抗RCV抗原表位抗体作为标志物在自身免疫性视网膜病变诊断和/或预测中的应用

摘要

本发明公开了抗RCV抗原表位抗体作为标志物在自身免疫性视网膜病变诊断和/或预测中的应用，涉及临床医学技术领域。本发明提供了抗RCV抗原表位抗体作为标志物在制备自身免疫性视网膜病变诊断和/或预测试剂中的应用。所述抗RCV抗原表位抗体水平在狼疮性视网膜病变患者中显著升高，并通过其与临床参数的相关性分析发现抗RCV抗原表位抗体水平与SLE疾病活动度呈显著正相关，因此可将所述蛋白作为标志物参与狼疮性视网膜病变诊断或预测，当被检测的SLE血清样本抗RCV抗原表位抗体水平显著高于正常对照时，即提示患有狼疮性视网膜病变或者潜在狼疮性视网膜病变高风险。

说明书

技术领域

本发明属于临床医学技术领域，具体涉及抗RCV抗原表位抗体作为标志物在自身免疫性视网膜病变诊断和/或预测中的应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是最常见的自身免疫性疾病之一，以体内存在多种自身抗体为特征，可导致免疫复合物介导的组织损伤，影响多个器官系统。在我国该病的患病率约0.1％，患病人数约100万。眼睛是该病常见的受累器官之一，约1/3的SLE患者存在眼部症状，包括眼睑病变、角膜结膜炎、巩膜炎、视网膜血管炎、血管闭塞性疾病、脉络膜病变和视神经病变等。既往研究表明3％病情稳定的SLE患者和29％病情活动的SLE患者患有视网膜病变。狼疮性视网膜病变可发生在SLE病程的任何阶段，有时表现为无眼部症状，但可迅速发展至威胁视力，狼疮性视网膜病变的诊断和治疗的延误对患者的生活有着巨大的影响。既往的研究报道了SLE患者体内存在许多独特的自身抗体，如抗dsDNA抗体、抗Smith抗体等自身抗体已被应用于SLE诊断中。然而，与狼疮性视网膜病变相关的自身抗体的研究非常有限。

至今已有多种抗视网膜蛋白的自身抗体在自身免疫性视网膜病变的研究中被报道，如抗恢复蛋白(recoverin,RCV)抗体和抗烯醇化酶抗体，这些抗体与视锥或视杆细胞功能障碍有关。研究表明抗RCV自身抗体与癌症相关视网膜病变(cancerassociatedretinopathy,CAR)密切相关。RCV是一种23kDa钙结合蛋白，属于EF-hand超家族，主要存在于视网膜的视杆细胞和视锥细胞中，在高游离钙水平下，抑制视紫红质激酶对视紫红质的磷酸化，在视觉传导中起重要作用。在体外实验中发现，抗RCV抗体添加到光感受器细胞外段时，可促进视紫红质磷酸化；在体内实验中发现，抗RCV抗体通过caspase依赖通路和细胞内Ca

发明内容

本发明的目的在于提供抗RCV抗原表位抗体作为标志物在自身免疫性视网膜病变诊断和/或预测中的应用，抗RCV线性B细胞表位抗体作为标志物对狼疮性视网膜病变患者的诊断特异性较好，能够作为狼疮性视网膜病变的诊断或预测指标。

本发明提供了抗RCV抗原表位抗体作为标志物在制备自身免疫性视网膜病变诊断和/或预测试剂中的应用，所述RCV抗原表位为RCV线性B细胞表位。

优选的，所述RCV线性B细胞表位包括以下任一种：RCV

优选的，所述RCV

优选的，所述自身免疫性视网膜病变包括狼疮性视网膜病变。

本发明还提供了一种诊断和/或预测自身免疫性视网膜病变的试剂，包括检测抗RCV抗原表位抗体的产品，所述RCV抗原表位为RCV线性B细胞表位。

优选的，包括检测样本中以下至少一项的水平：抗RCV

优选的，所述检测的方法包括ELISA法。

优选的，所述样本包括血清样本、血浆样本或组织液。

本发明还提供了一种诊断和/或预测自身免疫性视网膜病变的ELISA试剂盒，包括：表位多肽、抗对应表位抗体强阳性样本、由标记物进行标记且特异识别人免疫球蛋白G的检测抗体和标记物反应显色的检测试剂；

所述表位多肽包括以下至少一种：RCV

优选的，由标记物进行标记且特异识别人免疫球蛋白G的检测抗体包括辣根过氧化物酶标记且特异性识别人IgG的抗体；

所述标记物反应显色的检测试剂包括四甲基联苯胺显色底物。

有益效果：本发明提供了抗RCV抗原表位抗体作为标志物在制备自身免疫性视网膜病变诊断和/或预测试剂中的应用。在本发明实施例中，通过酶联免疫吸附试验分析狼疮性视网膜病变患者(眼病组)、无视网膜病变的SLE患者(无眼病组)、健康人的血清样本，发现抗RCV

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为酶联免疫(ELISA)间接法检测抗RCV抗原表位抗体原理示意图；

图2为狼疮性视网膜病变患者(眼病组)、无视网膜病变的SLE患者(无眼病组)和健康对照组的血清样本中抗RCV抗原表位抗体的水平图；

图3为以抗RCV抗原表位抗体作为生物标志物预测狼疮性视网膜病变的灵敏度和特异性ROC曲线分析图；

图4为抗RCV抗原表位抗体水平与SLE疾病活动度的相关性分析图。

具体实施方式

本发明提供了抗RCV抗原表位抗体作为标志物在制备自身免疫性视网膜病变诊断和/或预测试剂中的应用，所述RCV抗原表位为RCV线性B细胞表位。

本发明所述RCV线性B细胞表位优选包括以下任一种：RCV

本发明所述自身免疫性视网膜病变优选包括狼疮性视网膜病变，实施例中以酶联免疫吸附法(即ELISA间接法)为基础，使用不同的表位多肽，以及抗对应表位抗体强阳性的血清样品以及HRP标记羊抗人IgG抗体(购自北京索莱宝科技有限公司)，对狼疮性视网膜病变患者、无视网膜病变的SLE患者以及健康对照血清中的抗RCV抗原表位抗体进行检测，以评价抗RCV表位抗体诊断狼疮性视网膜病变的价值。本发明所述表位多肽如RCV

本发明还提供了一种诊断和/或预测自身免疫性视网膜病变的试剂，包括检测抗RCV抗原表位抗体的产品，所述RCV抗原表位为RCV线性B细胞表位。

本发明所述检测优选包括检测样本中各抗RCV抗原表位抗体的水平，本发明对所述检测的方法并没有特殊限定，实施例中优选利用ELISA方法检测样本中抗RCV线性B细胞表位抗体的水平，但是不能将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述样本优选包括血清样本、血浆样本或组织液。

本发明还提供了一种诊断和/或预测自身免疫性视网膜病变的ELISA试剂盒，包括：表位多肽、抗对应表位抗体强阳性样本、由标记物进行标记且特异识别人免疫球蛋白G的检测抗体和标记物反应显色的检测试剂；

所述表位多肽包括以下至少一种：RCV

本发明对抗对应表位抗体强阳性样品的种类和来源没有特殊限定，可以是抗对应表位抗体强阳性血清，也可以合成纯化的特异性识别抗对应表位的抗体，只要能够满足特异性识别抗对应表位抗体的功能即可。本发明实施例中，强阳性血清样本是通过ELISA检测健康对照、80例系统性红斑狼疮患者血清抗RCV表位抗体水平，选择系统性红斑狼疮患者中OD值＞1.0且OD值最高的3例样本血清等体积混合作为强阳性血清。

本发明所述由标记物进行标记且特异识别人免疫球蛋白G的检测抗体优选包括辣根过氧化物酶标记且特异性识别人IgG的抗体；所述标记物反应显色的检测试剂优选包括四甲基联苯胺显色底物。

利用本发明所述ELISA试剂盒进行检测时，不同表位质检原理相同，如图1所示，表位多肽可以捕获血清中的抗对应表位抗体，捕获到的抗对应表位抗体被检测抗体(酶标二抗，与辣根过氧化物酶HRP结合且能识别人IgG)识别并结合，当加入显色底物后，结合在检测抗体上的HRP引起显色底物(TMB)的颜色反应，呈现检测信号(detection signal)，即可检测到血清中的抗对应表位抗体。在本发明中，患者血清抗RCV抗体阳性的标准为大于等于正常人的(均值+2倍标准差)AU值。眼病组的患者血清抗RCV表位抗体水平是与健康对照以及无眼病组相比，通过独立t检验进行统计分析得知眼病组患者血清抗RCV表位抗体水平显著升高。血清阳性的标准为健康对照的(均值+2倍标准差)AU值，本发明中，统计学分析中健康对照与无视网膜病变的SLE患者之间无显著差异，不可用于区分无视网膜病变患者和正常人。该自身抗体水平用于从SLE患者中区分出有视网膜病变的SLE患者。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的抗RCV抗原表位抗体作为标志物在自身免疫性视网膜病变诊断和/或预测中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

从UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)获取到RCV蛋白的完整氨基酸序列，其Swiss-Prot编号为P35243，共含有200个氨基酸，序列如SEQ ID No.4所示：MGNSKSGALSKEILEELQLNTKFSEEELCSWYQSFLKDCP TGRITQQQFQSIYAKFFPDTDPKAYAQHVFRSFDSNLDGTLDFKEYVIALHMTTAGKTNQKLEWAFSLYDVDGNGTISKNEVLEIVMAIFKMITPEDVKLLPDDENTPEKRAEKIWKYFGKNDDDKLTEKEFIEGTLANKEILRLIQFEPQKVKEKMKNA。

使用DNAStar生物医学软件(https://www.dnastar.com/t-allservices.aspx)中的Protean模块进行RCV蛋白质序列的理化性质及二级结构分析，通过Gamier-Robson和Chou-Fasman算法预测RCV蛋白的二级结构，根据Kyte-Doolittle算法对RCV蛋白质序列的亲水性进行分析，根据Emini算法预测RCV蛋白质表面可及性较大的区域，根据Karplus-Schulz算法预则蛋白质柔韧性较大的区域，根据Jameson-wolf算法预测RCV蛋白的抗原指数，综合以上参数筛选出最可能的RCV线性B细胞表位，其中位于55-70、139-154、155-170氨基酸残基的肽段骨架区的柔韧性较高，亲水性指数和表面可及性概率也较高，形成抗原表位的可能性较大，容易与抗体进行结合。具体多肽序列如下：

RCV

RCV

RCV

最后采用BepiPred-2.0以及ABCpred两种表位预测在线工具进行RCV的线性B细胞表位预测，结果显示RCV

实施例2

以酶联免疫吸附法(即ELISA间接法)为基础，使用RCV

用于检测受试者血清样本中的抗RCV各表位抗体水平的试剂组合包括以下成分：RCV

具体操作包括如下步骤：

血清样本：用无抗凝剂采血管抽取3mL静脉血，室温静置5分钟后，4000rpm离心5分钟获取上清标本。

用pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液将RCV

弃掉液体，每孔加入300μL的0.05％Tween-20的PBST浸泡式洗板，2min/次，共4次，每次洗涤后在吸水纸上拍干，彻底移除残留液体。

每孔加入200μL含3％BSA、0.05％Tween-20的PBS，37℃封闭2小时。

弃掉液体，每孔加入300μL的0.05％Tween-20的PBST浸泡式洗板，2min/次，共4次，每次洗涤后在吸水纸上拍干，彻底移除残留液体。

用含1％BSA、0.05％Tween-20的PBS作为稀释液对血清样本进行1:50的稀释，100μL/孔，同时也1:50稀释已知强阳性的抗RCV

弃掉液体，每孔加入300μL的0.05％Tween-20的PBST浸泡式洗板，2min/次，共4次，每次洗涤后在吸水纸上拍干，彻底移除残留液体。

用含1％BSA、0.05％Tween-20的PBS对HRP标记的羊抗人IgG抗体进行1:8000的稀释，100μL/孔，37℃孵育30分钟；

弃掉液体，每孔加入300μL的0.05％Tween-20的PBST浸泡式洗板，2min/次，共4次，每次洗涤后在吸水纸上拍干，彻底移除残留液体。

加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光反应10-15min；

加入2mol/L硫酸终止反应，100μL/孔，立即使用酶标仪测定在450nm的最大吸收波长和570nm的参考波长下的OD值；

本实施例共检测40例狼疮性视网膜病变患者、40例无视网膜病变的SLE患者以及36例正常人血清中的抗RCV各表位抗体水平，每板均设阳性对照及阴性对照，以健康人抗RCV表位抗体均值AU值+2×标准偏差AU值定为阳性阈值。

AU值计算公式如下所示：

AU值＝(OD

结果如图2～4所示，40例狼疮性视网膜病变患者中，抗RCV

抗RCV

抗RCV

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。