一种沙尔威酮衍生物在药物制备中的应用

摘要

本发明公开了一种沙尔威酮衍生物在药物制备中的应用，所述的药物用于治疗或者预防化学物质葡聚糖硫酸钠(DSS)引起的机体局部免疫器官对肠道内抗原的高敏状态而引起的非特异性炎症包括急性肠道症状和慢性肠道症状,但是不局限于这种诱导物，具体的，该药物可以抑制或改善结肠组织的病理损伤、炎症反应、细胞凋亡以及对RIPK2信号通路的影响。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防炎症性肠病药物中的用途。

背景技术

近年来，炎症性肠病(IBD)的发病率持续上升，并已成为一种全球性疾病。炎症性肠病目前病因未明，与环境、遗传及肠道微生态等多因素相互作用导致肠道异常免疫失衡有关。IBD的特征是腹痛，腹泻，血便，体重减轻以及产生细胞因子，蛋白水解酶和自由基的中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，最终导致炎症和溃疡，炎症性结肠炎的持续发生有可能造结肠癌和肠穿孔等并发症的发生。

本发明人在多年的工作基础上，发现了式(I)的化合物能够有效治疗多种因素诱发的炎症性肠病包括急性结肠炎和慢性结肠炎，尤其是机体器官局部免疫对肠道内抗原的高敏状态而引起的非特异性炎症，能够抑制化学物质葡聚糖硫酸钠(DSS)的结肠损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供了沙尔威酮衍生物C

具体而言，本发明提供了式(I)的化合物(144)或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防炎症性结肠炎的药物中的用途。

本发明还提供了式(I)的化合物(144)或其药学上可接受的盐在制备用于改善炎症性结肠炎的药物中的用途。

炎症性结肠炎是由多种因素引起的，炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病等。炎症性肠病发病机制非常复杂，包括个体遗传差异、肠道菌群的变化、炎症免疫反应和外部环境变化。不同的原因导致的炎症性肠病的症状以及治疗方式都有所不同，作为优选，本发明所针对的炎症性肠病主要是由化学物质葡聚糖硫酸钠(DSS)引起的机体器官局部免疫对肠道内抗原的高敏状态而引起的非特异性炎症，但不限于这种致病因素诱发的。

优选在本发明的用途中，炎症性肠病的主要症状是腹泻，黏液脓血便，体重下降以及结肠组织的病理损伤、炎症和凋亡。

优选在本发明的用途中，式(I)的化合物(144)或其药学上可接受的盐是不在统计学上显著降低体重的。

本发明的用途中的药物含有有效剂量的式(I)的化合物(144)。有效剂量可以是单位给药剂量形式(如，一片、一针、一丸或一剂)的药物中的含量，也可以是所需治疗/预防的患者的单位剂量(如，单位体重剂量)。药物制造商能够很容易地通过所需治疗/预防的患者群体的平均体重将所需治疗/预防的患者的单位体重剂量换算成单位给药剂量形式的药物中的含量，例如，成人患者的平均体重可以是60kg，因此通过平均体重乘以成人的单位体重剂量，即可得到用于成人的单位给药剂量形式的药物中的含量。在本发明中，患者可以是哺乳动物，如人、兔、狗或鼠。根据本领域普通技术人员所公知的实验动物与人的等效剂量换算关系(通常可参见FDA、SFDA等药品管理机构的指导意见，也可参见“黄继汉等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算.中国临床药理学与治疗学,2004，9(9):1069-1072”)可从实验动物的剂量推导出人的单位体重剂量。例如，对于常用的实验动物小鼠而言，根据上述文献，其与成人的换算关系约为12：1；对于常用的实验动物大鼠而言，根据上述文献，其与成人的换算关系约为6：1。在本发明中，有效剂量(以含量计)可以是10ug-1g优选是0.1mg-500mg，更优选是1mg-100mg。

本发明的用途中的药物通常还含有药学上可接受的载体。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。例如，稀释剂、赋形剂，如水、生理盐水等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂，如甘油；崩解剂，如琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醇；吸附载体，如高岭土和/或皂粘土；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外，本发明的药物组合物还可以进一步含有其它辅料，如香味剂、甜味剂等。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位给药剂量形式，如冻干剂、片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、水针剂或喷雾剂，更优选该药物组合物为注射剂型(如，冻干粉针剂)或口服剂型(如，片剂、胶囊)。药物可以通过常规途径施用，特别是肠内，例如口服，例如以片剂或胶囊剂形式，或非肠道施用，例如以可注射溶液剂或混悬剂形式，局部施用，例如以洗剂或凝胶剂，或以鼻剂或检剂形式。

为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是部分示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明：

图1式(I)的化合物(144)对炎症性结肠炎小鼠体重和体重变化率、疾病活动指数、脾脏指数和结肠长度的影响。

图2式(I)的化合物(144)对炎症性结肠炎小鼠结肠病理损伤的改善效果。

图3式(I)的化合物(144)对炎症性结肠炎小鼠结肠中炎症的改善效果。

图4式(I)的化合物(144)对炎症性结肠炎小鼠结肠中细胞凋亡的改善效果。

图5式(I)的化合物(144)对炎症性结肠炎小鼠结肠中的RIPK2信号通路的影响。

具体实施方式：

本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。

实施例1本发明的化合物缓解炎症性结肠炎诱导后小鼠的体重减轻、疾病活动指数和脾脏指数升高和结肠长度缩短。

1、急性模型：将C57L/B6小鼠随机分为5组，每组6只，具体造模实施流程可参照图1A，分别为：

空白对照组(CON组)：健康C57L/B6小鼠，全程给予高温无菌水；

疾病对照组(DSS组)：健康C57L/B6小鼠，正常饮食喂养小鼠，2.5％DSS饮水，不给药，喂养8天；

化合物治疗组(DSS+144 5mg/kg、DSS+144 10mg/kg)：健康C57L/B6小鼠，正常饮食喂养小鼠，2.5％DSS喂养7天后给予正常饮水，同时每天分别以5mg/kg/day和10mg/kg/day的剂量将(I)的化合物(144)使用灌胃给药方式给予小鼠，连续给药8天。

阳性药物治疗组(DSS+SASP 200mg/kg)：健康C57L/B6小鼠，正常饮食喂养小鼠，2.5％DSS喂养7天后给予正常饮水，同时每天分别以200mg/kg/day的剂量将SASP使用灌胃给药方式给予小鼠，连续给药8天。

2、慢性模型：将C57L/B6小鼠随机分为5组，每组6只，具体实施流程可参照图K分别为：

空白对照组(CON组)：健康C57L/B6小鼠，正常饮食喂养小鼠，正常饮食喂养小鼠，全程给予正常饮水；

疾病对照组(DSS组)：健康C57L/B6小鼠，正常饮食喂养小鼠，2.5％DSS饮水给予六天后，然后正常饮水给予14天，循环3个周期，共60天；

化合物治疗组(DSS+144 5mg/kg、DSS+144 10mg/kg)：健康C57L/B6小鼠，正常饮食喂养小鼠，2.5％DSS喂养6天后，然后给予正常饮水14天，循环3个周期，共60天。同时在给予2.5％DSS的周期内，每天分别以5mg/kg/day和10mg/kg/day的剂量将(I)的化合物(144)使用灌胃给药方式给予小鼠。

阳性药物治疗组(DSS+SASP 200mg/kg)：健康C57L/B6小鼠，正常饮食喂养小鼠，2.5％DSS喂养6天后给予正常饮水14天，循环3个周期，共60天。同时在给予2.5％DSS的周期内，每天以200mg/kg/day的剂量将SASP使用灌胃给药方式给予小鼠。

期间急性模型每天同时间，慢性模型每两天同时间测定各组鼠的体重(Bodyweight)同时计算体重变化率，记录粪便稠度、血便的存在和体重减轻情况并打分，将单项评分合并取平均值以生成疾病活动指数(DAI)，急性模型该指数每天为每只小鼠计算，慢性模型该指数每两天为每只小鼠计算。急性模型结果如图1B-H所示，化合物治疗组小鼠体重和体重变化率相比于疾病对照组的减少得到缓解，疾病活动指数值评分相比于疾病对照组较低，与阳性药物治疗组呈现相同的趋势。慢性模型结果如图1L-Q所示，化合物治疗组小鼠体重和体重变化率相比于疾病对照组的减少得到缓解，疾病活动指数值评分相比于疾病对照组较低，与阳性药物治疗组呈现相同的趋势。这表明，式(I)的化合物(144)缓解DSS诱导的急性和慢性结肠炎引起的小鼠体重和体重变化率降低和疾病活动指数(DAI)升高。

在造模结束后，称量小鼠体重，用4％水合氯醛溶液麻醉小鼠，腹腔打开，取出脾脏，测量脾脏的重量，将脾脏重量除以小鼠牺牲时当天的体重，计算脾脏指数，以‰表示，将肛门到盲肠区的结肠取肠系膜纵向部分，整理并固定，测量结肠长度。结果如图1I，1J和图1Q，1R显示，给予式(I)的化合物(144)后对DSS诱导引起的急性结肠炎(图1I，1J)和慢性结肠炎(图1Q，1R)带来的脾脏指数增加和结肠长度的缩短有明显的缓解作用，作用效果同阳性药物治疗组具有相同的趋势。

这表明，式(I)的化合物(144)对炎症性结肠炎带来的体重减轻、脾脏指数升高和结肠长度缩短有缓解作用。

实施例2本发明的化合物明显改善炎症性结肠炎小鼠结肠组织的病理损伤。

按照实施例1分组并进行试验，在急性和慢性模型造模周期结束后，处死各组小鼠，取结肠组织，以4％福尔马林液固定、石蜡包埋、5μm切片后进行苏木素&伊红(H&E)、Alcian blue(AB)and Periodic acid Schiff(PAS)、胶原纤维(MASSON)染色并镜检。结果如图2A，2B所示，在急性(图2A)和慢性模型(图2B)两种模型中都观察到疾病对照组结肠远端组织中炎症细胞浸润，隐窝组织丢失和杯状细胞和上皮细胞破坏同时伴随结肠纤维化的发生；而同时给予式(I)的化合物(144)后，明显改善了疾病对照组的小鼠结肠组织的病理损伤包括炎症细胞浸润和隐窝组织丢失，杯状细胞和上皮细胞破坏等症状，同时改善了结肠纤维化的发生，与此同时，上述式(I)的化合物(144)对结肠病理损伤的改善效果在阳性药物治疗组中观测到相同的结果。

这表明，式(I)的化合物(144)能够缓解由于炎症性结肠炎而引起的结肠组织的病理损伤。

实施例3本发明的化合物明显改善炎症性结肠炎小鼠结肠中的炎症。

按照实施例1分组并进行试验，在急性和慢性模型造模周期结束后，处死各组小鼠，取结肠组织，以4％福尔马林液固定、石蜡包埋、5μm切片后进行巨噬细胞(F4/80+)染色并镜检。结果如图3A，3E所示，在急性(图3A)和慢性(图3E)两种模型中都观察到疾病对照组结肠中的巨噬细胞的数量增加，而同时给予式(I)的化合物(144)后，结肠组织中巨噬细胞的数量较疾病对照组减少，与此同时，上述式(I)的化合物(144)对降低结肠中巨噬细胞的数量在阳性药物治疗组中观测到相同的结果。

这表明，式(I)的化合物(144)能够减少由于炎症性结肠炎而引起的结肠组织中的巨噬细胞浸润。

取结肠组织匀浆后，采用Trizol试剂提取总mRNA，并且用RT-qPCR实验进行检测发现，在急性和慢性结肠炎模型中，化学物质葡聚糖硫酸钠(DSS)显著升高结肠组织中炎症相关指标IL-6(图3B，3F)、TNF-α(图3C，3G)和IL-1β(图3D，3H)的mRNA表达，而给予式(I)的化合物(144)后，抑制了化学物质葡聚糖硫酸钠(DSS)引起的结肠组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的基因表达，与此同时，上述式(I)的化合物(144)对降低结肠中结肠组织中炎症相关指标的mRNA表达在阳性药物治疗组中观测到相同的结果。

这表明，式(I)的化合物(144)能够缓解炎症性结肠炎而引起的结肠组织中的炎症，从而缓解结肠损伤。

实施例4本发明的化合物明显改善炎症性结肠炎小鼠结肠中的细胞凋亡。

按照实施例1分组并进行试验，在急性和慢性模型造模周期结束后，处死各组鼠，取结肠组织，以4％福尔马林液固定、石蜡包埋、5μm切片后进行TUNEL免疫组化染色并镜检。结果如图4A，B所示，急性模型(图4A)和慢性模型(图4B)的疾病对照组小鼠结肠组织中有明显的细胞凋亡，而同时给予式(I)的化合物(144)后，明显改善了各治疗组的小鼠结肠组织的细胞凋亡，此外，上述式(I)的化合物(144)具有阳性药物治疗组更好的对结肠中细胞凋亡的保护作用。

取结肠组织匀浆后，样品加入到相应比例的SDS凝胶上样体系中。SDS-PAGE电泳并转移膜后，将膜5％脱脂牛奶封闭，室温下1.5小时，然后用TBST洗涤3次。然后加入Bcl-2(1：1000)、Bax(1：1000)、Cleaved-Caspase3(1：1000)和Caspase3(1：1000)一抗，膜在4℃下孵育过夜，用TBST洗涤3次，用与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1.5小时，膜洗涤3次，检测免疫反应条带在超敏ECL化学发光试剂盒显现。对凝胶成像系统进行拍照。结果如图4C，D所示，在急性(图4C)和慢性模型(图4D)中疾病对照组的促凋亡指标Bax、Cleaved-Caspase3的蛋白水平升高，而抗凋亡指标Bcl-2的蛋白水平降低，而同时给予式(I)的化合物(144)后，促凋亡指标Bax、Cleaved-Caspase3的蛋白水平降低，抗凋亡指标Bcl-2的蛋白水平升高。

这表明，式(I)的化合物(144)能够缓解由于炎症性结肠炎而引起的结肠中的细胞凋亡。

实施例5本发明的化合物能与RIPK2(RIP2)结合并且降低的RIPK2(RIP2)磷酸化，影响RIPK2(RIP2)信号通路。

按照实施例1分组并进行试验，在急性和慢性模型造模周期结束后，处死各组鼠，取结肠组织加入动物裂解液匀浆后，同时准备好结肠上皮细胞裂解液。取链霉亲和素磁珠20ul,加入PBS重悬，用磁力架吸附磁珠去除PBS，重复两次，加入BIO-144(混悬在500ul PBS中)，室温，混悬30min。去除PBS，加入5％BSA,加单纯生物素封闭，室温，混悬60min。去除BSA，加入PBS重悬两次，取含相同蛋白量动物裂解液和细胞裂解液的一定体积，室温孵育，混悬6h。去除动物裂解液和细胞裂解液，加入PBS重悬两次。弃上清，再加入50ul 1×loading，100℃金属浴10min。后续进行WB。结果如图5A，5B所示，式(I)的化合物(144)能够与动物组织中和结肠上皮中的RIPK2(RIP2)的蛋白结合。

取结肠组织匀浆后，样品加入到相应比例的SDS凝胶上样体系中。SDS-PAGE电泳并转移膜后，将膜5％脱脂牛奶封闭，室温下1.5小时，然后用TBST洗涤3次。然后加入p-RIPK2(1：1000)、RIPK2(1：1000)、p-TAK1(1：1000)、TAK1(1：1000)、p-JNK(1：1000)、JNK(1：1000)、p-ERK(1：1000)、ERK(1：1000)、p-P38(1：1000)、P38(1：1000)、p-p65(1：1000)、P65(1：1000)、p-IκBα(1：1000)、IκBα(1：1000)、GAPDH(1：10000)一抗，膜在4℃下孵育过夜，用TBST洗涤3次，用与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1.5小时，膜洗涤3次，检测免疫反应条带在超敏ECL化学发光试剂盒显现。对凝胶成像系统进行拍照。结果如图5C-J所示，在化学物质葡聚糖硫酸钠(DSS)的作用下，无论是急性模型(图5C，5E，5G，5I)还是慢性模型(图5D，5F，5H，5J)还是结肠中的RIPK2(RIP2)信号通路被激活，而同时给予式(I)的化合物(144)后，结肠中的RIPK2(RIP2)信号通路的激活受到抑制。这表明，式(I)的化合物(144)能够缓解由于炎症性结肠炎而引起的结肠中的RIPK2(RIP2)信号通路的变化。