基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒

摘要

本发明涉及基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种用于检测白假丝酵母菌耐药性的分子标志物，所述分子标志物包括ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性。研究表明，ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性均与唑类抗真菌药物的耐药性相关，基于核酸质谱检测技术对这些基因的突变位点进行单核苷酸多态性分析能够判断患者所感染的白假丝酵母菌是否对唑类抗真菌药物具有耐药性，有助于临床上及时调整白假丝酵母菌感染患者用药。

说明书

技术领域

本发明涉及基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

白色假丝酵母又称白色念珠菌(Canidiaalbicans)，属于真菌界半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科。白色假丝酵母通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则白色假丝酵母大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。

念珠菌病主要是白假丝酵母菌引起的急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病，常侵犯皮肤、粘膜，也可引起内脏或全身感染。目前，主要通过使用抗真菌药物治疗念珠菌病，而白假丝酵母菌耐药性的产生是导致念珠菌病临床治疗失败的重要原因之一。对患者所感染的白假丝酵母菌进行耐药性检测，以及时更换适用的抗真菌药物，对念珠菌病的治疗十分重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于检测白假丝酵母菌耐药性的分子标志物，所述分子标志物包括ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性。

在本发明的一种实施方式中，所述ERG11基因突变位点包括T315C、A428G、A685G、T996C、G1020A、G1349A、C1470T和/或G1609A；所述ERG3基因突变位点包括A100C、T134G、C662T、T836C和/或C1052T；所述TAC1基因基因突变位点包括A673G、A2929G和/或G2939A；所述UPC2基因突变位点包括G1947A；所述MRR1基因突变位点包括G2751A；所述MRR2基因突变位点包括C1049A。

在本发明的一种实施方式中，所述分子标志物通过核酸质谱检测技术进行检测。

在本发明的一种实施方式中，所述核酸质谱检测技术由核酸质谱系统实现。

本发明还提供了检测上述分子标志物的试剂在制备检测白假丝酵母菌耐药性的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述分子标志物通过核酸质谱检测技术进行检测。

在本发明的一种实施方式中，所述核酸质谱检测技术由核酸质谱系统实现。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂包括靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的特异性延伸引物。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂还包括靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因的扩增引物组。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂还包括PCR扩增所需试剂以及核酸质谱鉴定所需试剂。

本发明还提供了一种用于检测白假丝酵母菌耐药性的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测上述分子标志物的试剂。

在本发明的一种实施方式中，所述分子标志物通过核酸质谱检测技术进行检测。

在本发明的一种实施方式中，所述核酸质谱检测技术由核酸质谱系统实现。

核酸质谱系统的工作原理为：MALDI应用激光照射核酸分子与基质形成的共结晶薄膜，基质吸收激光能量并传递给核酸分子，从而使基质和核酸分子间发生质子转移，产生完整的电离化核酸分子。TOF使离子化的核酸分子在电场作用下加速飞过真空管腔，根据样品分子的电荷及分子量不同以及到达检测接收器的时间差异，智能分析SNP的基因型。

核酸质谱系统的检测流程如下：

样品的准备：准备核酸质谱仪可直接检测的稀有样本和降解样品，以及可兼容全血、唾液、口腔黏膜、干血斑、活检组织、石蜡包埋组织、血浆等各类样本；

扩增和延伸反应的引物设计：由于核酸质谱仪的SNP分型是一种在PCR基础上进行单碱基延伸的技术，因此相关的引物设计必须遵循PCR引物设计原则。引物应尽量避免自身形成发卡结构及5个以上嘌呤或嘧啶核苷酸的连续序列；由于同一体系可进行多达几十重反应，引物间需避免互补，防止出现非特异性扩增延伸而干扰检测结果；

PCR扩增、纯化及单碱基延伸反应：在核酸扩增阶段，通过多重PCR扩增多达含40个待检SNP的目标片段；PCR结束后加入虾碱性磷酸酶进行纯化，去除反应液中的脱氧核苷酸；随后在反应液中加入针对SNP位点的特异性单碱基延伸引物及经修饰的双脱氧核苷酸进行单碱基延伸反应，使等位基因的延伸产物仅表现为末端一个碱基的差异；

核酸质谱仪的分型检测：将完成延伸的反应液与树脂混合进行离子交换，去除吸附于DNA片段上的离子，再经脱盐后将反应液点在靶板基质上形成共结晶；基质可增强核酸分子对激光的吸收，保护核酸分子的稳定性；核酸质谱仪根据不同质量的单碱基的飞行时间差异自动分析确定对应的碱基类型。整个检测流程和数据分析简单，检测周期短；另外，由于核酸质谱技术采用物理方法学，检测过程只需简单的PCR及延伸试剂，无需荧光探针和荧光类试剂，因此试剂成本低。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂包括靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的特异性延伸引物。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂还包括靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因的扩增引物组。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂还包括PCR扩增所需试剂以及核酸质谱鉴定所需试剂。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供了一种用于检测白假丝酵母菌耐药性的分子标志物，所述分子标志物包括ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和/或MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性。单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的高密度、高保守的DNA序列多态性。研究表明，ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性均与唑类抗真菌药物的耐药性相关，对这些基因的突变位点进行单核苷酸多态性分析能够判断患者所感染的白假丝酵母菌是否对唑类抗真菌药物具有耐药性，有助于临床上及时调整白假丝酵母菌感染患者用药。

SNP的常见检测方法包括直接测序法、基因芯片法、PCR-限制性片段长度多态性法、荧光标记的单碱基延伸法和核酸质谱法等。其中核酸质谱法是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS)技术，根据解吸的核酸分子的质量和在真空腔中的飞行时间差异，通过计算分子量进而获得分析物的基因型信息。在pmol水平可鉴别仅1个碱基差别的不同DNA片段是核酸质谱仪进行SNP分型的基础。核酸质谱技术具有高灵敏度、高通量和高精确度等优势，是国际业界公认的SNP分型的黄金标准。本发明的分子标志物即是基于核酸质谱检测技术进行检测，所述核酸质谱检测技术由核酸质谱系统实现。核酸质谱系统主要由进样系统、基质辅助激光解吸电离离子源(matrix-assistedlaserdesorption/ionization，MALDI)、飞行时间质量分析器(timeofflightmass analyzer，TOF)、检测接收器和配套分析软件5个部分组成。设备进样系统提

供标准的96和384制式芯片，可满足不同检测量的需求。核酸质谱系统的一张芯片可同时分析多个检测项目并可分多次使用，方便检测内容的灵活定制或修改，减少拼凑样本的限制，大大提高了检测效率。核酸质谱系统的全封闭设计可避免人为操作误差及潜在的交叉污染风险。核酸质谱系统单个反应能够实现10重以上的检测，只需简单的多重PCR，无需荧光探针，多重检测成本低。核酸质谱系统分型准确性高，突变检测灵敏度高。核酸质谱系统检测流程和数据分析简单，从DNA到结果输出只需几个小时。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1：一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒

本实施例提供了一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，所述检测试剂盒基于核酸质谱系统，包括检测分子标志物的试剂；所述分子标志物包括ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性；所述ERG11基因突变位点包括T315C、A428G、A685G、T996C、G1020A、G1349A、C1470T和G1609A；所述ERG3基因突变位点包括A100C、T134G、C662T、T836C和C1052T；所述TAC1基因基因突变位点包括A673G、A2929G和G2939A；所述UPC2基因突变位点包括G1947A；所述MRR1基因突变位点包括G2751A；所述MRR2基因突变位点包括C1049A；所述试剂包括靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1

基因、UPC2基因、MRR1基因和MRR2基因突变位点的特异性延伸引物，靶向ERG11基因、ERG3基因、TAC1基因、UPC2基因、MRR1基因和MRR2基因的扩增引物组，PCR扩增所需试剂，虾碱式磷酸酶(SAP)，单碱基延伸反应所需试剂，以及，脱盐树脂。使用基因提取试剂盒提取待测白假丝酵母菌的基因组；提取后的基因组DNA用于核酸质谱检测，检测方法为：配置反应液5μL，进行PCR扩增，扩增程序为95℃2分钟，(95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒)45个循环，72℃5分钟；扩增后的产物取5μL加入2μL的SAP酶和缓冲液的混合溶液进行dNTP和多余引物的去除，程序为37℃40分钟，85℃5分钟；再加入2μL的单碱基反应液(UEP反应液)2μL进行检测位点的单碱基延伸反应，反应程序为94℃30秒，(94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒)40个循环，72℃3分钟；将反应液中加入适量洁净树脂，在Hula翻转摇匀30分钟；将96孔板离心10分钟，在核酸质谱系统上点样到芯片，将芯片在核酸质谱系统上打质谱，获得核酸物质检测峰，通过分析核酸物质检测峰即可获得白假丝酵母菌耐药性相关基因突变位点的单核苷酸多态性检测结果。

实施例2：一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒

本实施例提供了一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，所述检测试剂盒基于核酸质谱系统，包括检测分子标志物的试剂；所述分子标志物包括ERG11基因突变位点的单核苷酸多态性；所述ERG11基因突变位点包括T315C、A428G、A685G、T996C、G1020A、G1349A、C1470T和G1609A；所述试剂包括靶向ERG11基因突变位点的特异性延伸引物，靶向ERG11基因扩增引物组，PCR扩增所需试剂，虾碱式磷酸酶(SAP)，单碱基延伸反应所需试剂，以及，脱盐树脂。使用基因提取试剂盒提取待测白假丝酵母菌的基因组；提取后的基因组DNA用于核酸质谱检测，检测方法为：配置反应液5μL，进行PCR扩增，扩增程序为95℃2分钟，(95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒)45个循环，72℃5分钟；扩增后的产物取5μL加入2μL的SAP酶和缓冲液的混合溶液进行dNTP和多余引物的去除，程序为37℃40分钟，

85℃5分钟；再加入2μL的单碱基反应液(UEP反应液)2μL进行检测位点的单碱基延伸反应，反应程序为94℃30秒，(94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒)40个循环，72℃3分钟；将反应液中加入适量洁净树脂，在Hula翻转摇匀30分钟；将96孔板离心10分钟，在核酸质谱系统上点样到芯片，将芯片在核酸质谱系统上打质谱，获得核酸物质检测峰，通过分析核酸物质检测峰即可获得白假丝酵母菌耐药性相关基因突变位点的单核苷酸多态性检测结果。

实施例3：一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒

本实施例提供了一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，所述检测试剂盒基于核酸质谱系统，包括检测分子标志物的试剂；所述分子标志物包括ERG3基因突变位点的单核苷酸多态性；所述ERG3基因突变位点包括A100C、T134G、C662T、T836C和C1052T；所述试剂包括靶向ERG3基因突变位点的特异性延伸引物，靶向ERG3基因的扩增引物组，PCR扩增所需试剂，虾碱式磷酸酶(SAP)，单碱基延伸反应所需试剂，以及，脱盐树脂。使用基因提取试剂盒提取待测白假丝酵母菌的基因组；提取后的基因组DNA用于核酸质谱检测，检测方法为：配置反应液5μL，进行PCR扩增，扩增程序为95℃2分钟，(95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒)45个循环，72℃5分钟；扩增后的产物取5μL加入2μL的SAP酶和缓冲液的混合溶液进行dNTP和多余引物的去除，程序为37℃40分钟，85℃5分钟；再加入2μL的单碱基反应液(UEP反应液)2μL进行检测位点的单碱基延伸反应，反应程序为94℃30秒，(94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒)40个循环，72℃3分钟；将反应液中加入适量洁净树脂，在Hula翻转摇匀30分钟；将96孔板离心10分钟，在核酸质谱系统上点样到芯片，将芯片在核酸质谱系统上打质谱，获得核酸物质检测峰，通过分析核酸物质检测峰即可获得白假丝酵母菌耐药性相关基因突变位点的单核苷酸多态性检测结果。

实施例4：一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒

本实施例提供了一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，所述检测试剂盒基于核酸质谱系统，包括检测分子标志物的试剂；所述分子标志物包括TAC1基因突变位点的单核苷酸多态性；所述TAC1基因基因突变位点包括A673G、A2929G和G2939A；所述试剂包括靶向TAC1基因突变位点的特异性延伸引物，靶向TAC1基因的扩增引物组，PCR扩增所需试剂，虾碱式磷酸酶(SAP)，单碱基延伸反应所需试剂，以及，脱盐树脂。使用基因提取试剂盒提取待测白假丝酵母菌的基因组；提取后的基因组DNA用于核酸质谱检测，检测方法为：配置反应液5μL，进行PCR扩增，扩增程序为95℃2分钟，(95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒)45个循环，72℃5分钟；扩增后的产物取5μL加入2μL的SAP酶和缓冲液的混合溶液进行dNTP和多余引物的去除，程序为37℃40分钟，85℃5分钟；再加入2μL的单碱基反应液(UEP反应液)2μL进行检测位点的单碱基延伸反应，反应程序为94℃30秒，(94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒)40个循环，72℃3分钟；将反应液中加入适量洁净树脂，在Hula翻转摇匀30分钟；将96孔板离心10分钟，在核酸质谱系统上点样到芯片，将芯片在核酸质谱系统上打质谱，获得核酸物质检测峰，通过分析核酸物质检测峰即可获得白假丝酵母菌耐药性相关基因突变位点的单核苷酸多态性检测结果。

实施例5：一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒

本实施例提供了一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，所述检测试剂盒基于核酸质谱系统，包括检测分子标志物的试剂；所述分子标志物包括UPC2基因突变位点的单核苷酸多态性；所述UPC2基因突变位点包括G1947A；所述试剂包括靶向UPC2基因突变位点的特异性延伸引物，靶向UPC2基因的扩增引物组，PCR扩增所需试剂，虾碱式磷酸酶(SAP)，单碱基延伸反应所需试剂，以及，脱盐树脂。使用基因提取试剂盒提取待测白假丝酵母菌的基因组；提取后的基因组DNA用于核酸质谱检测，检测方法为：配置反应液5μL，进行PCR扩增，扩增程序为95℃2分钟，(95℃30秒，56℃

30秒，72℃60秒)45个循环，72℃5分钟；扩增后的产物取5μL加入2μL的SAP酶和缓冲液的混合溶液进行dNTP和多余引物的去除，程序为37℃40分钟，85℃5分钟；再加入2μL的单碱基反应液(UEP反应液)2μL进行检测位点的单碱基延伸反应，反应程序为94℃30秒，(94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒)40个循环，72℃3分钟；将反应液中加入适量洁净树脂，在Hula翻转摇匀30分钟；将96孔板离心10分钟，在核酸质谱系统上点样到芯片，将芯片在核酸质谱系统上打质谱，获得核酸物质检测峰，通过分析核酸物质检测峰即可获得白假丝酵母菌耐药性相关基因突变位点的单核苷酸多态性检测结果。

实施例6：一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒

本实施例提供了一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，所述检测试剂盒基于核酸质谱系统，包括检测分子标志物的试剂；所述分子标志物包括MRR1基因突变位点的单核苷酸多态性；所述MRR1基因突变位点包括G2751A；所述试剂包括靶向MRR1基因突变位点的特异性延伸引物，靶向MRR1基因的扩增引物组，PCR扩增所需试剂，虾碱式磷酸酶(SAP)，单碱基延伸反应所需试剂，以及，脱盐树脂。使用基因提取试剂盒提取待测白假丝酵母菌的基因组；提取后的基因组DNA用于核酸质谱检测，检测方法为：配置反应液5μL，进行PCR扩增，扩增程序为95℃2分钟，(95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒)45个循环，72℃5分钟；扩增后的产物取5μL加入2μL的SAP酶和缓冲液的混合溶液进行dNTP和多余引物的去除，程序为37℃40分钟，85℃5分钟；再加入2μL的单碱基反应液(UEP反应液)2μL进行检测位点的单碱基延伸反应，反应程序为94℃30秒，(94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒)40个循环，72℃3分钟；将反应液中加入适量洁净树脂，在Hula翻转摇匀30分钟；将96孔板离心10分钟，在核酸质谱系统上点样到芯片，将芯片在核酸质谱系统上打质谱，获得核酸物质检测峰，通过分析核酸物质检测峰即可获得白假丝酵母菌耐药性相关基因突变位点的单核苷酸多态性检测结果。

实施例7：一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒

本实施例提供了一种基于核酸质谱检测的白假丝酵母菌耐药性检测试剂盒，所述检测试剂盒基于核酸质谱系统，包括检测分子标志物的试剂；所述分子标志物包括MRR2基因突变位点的单核苷酸多态性；所述MRR2基因突变位点包括C1049A；所述试剂包括靶向MRR2基因突变位点的特异性延伸引物，靶向MRR2基因的扩增引物组，PCR扩增所需试剂，虾碱式磷酸酶(SAP)，单碱基延伸反应所需试剂，以及，脱盐树脂。使用基因提取试剂盒提取待测白假丝酵母菌的基因组；提取后的基因组DNA用于核酸质谱检测，检测方法为：配置反应液5μL，进行PCR扩增，扩增程序为95℃2分钟，(95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒)45个循环，72℃5分钟；扩增后的产物取5μL加入2μL的SAP酶和缓冲液的混合溶液进行dNTP和多余引物的去除，程序为37℃40分钟，85℃5分钟；再加入2μL的单碱基反应液(UEP反应液)2μL进行检测位点的单碱基延伸反应，反应程序为94℃30秒，(94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒)40个循环，72℃3分钟；将反应液中加入适量洁净树脂，在Hula翻转摇匀30分钟；将96孔板离心10分钟，在核酸质谱系统上点样到芯片，将芯片在核酸质谱系统上打质谱，获得核酸物质检测峰，通过分析核酸物质检测峰即可获得白假丝酵母菌耐药性相关基因突变位点的单核苷酸多态性检测结果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。