基于化学指纹图谱和质量差异成分的杜鹃兰质量检测方法

摘要

本发明涉及中药检测技术领域，具体是杜鹃兰的质量检测方法包括杜鹃兰药材的指纹图谱、2个质量差异标志物(4‑甲氧基菲‑2,7‑二醇、BlestriareneC)的含量测定以及薄层鉴别。本发明采用UHPLC建立杜鹃兰药材的指纹图谱和同时测定杜鹃兰中4‑甲氧基菲‑2,7‑二醇、BlestriareneC的含量，所用色谱柱为CORTECST3，色谱柱规格为2.1mm×100mm，1.7μm；以0.1％甲酸水溶液(A)‑甲醇乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，流速：0.3mL·min

说明书

技术领域

本发明涉及中药检测技术领域，具体是杜鹃兰的质量检测方法及其指纹图谱。

背景技术

杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don)Makino]为兰科(Orchidaceae)杜鹃兰属(Cremastra)珍稀药用植物，是中药山慈菇的正品基原之一，以其干燥假鳞茎入药，收载于2020年版《中国药典》(一部)中，具有清热解毒、化痰散结的功效，主要用于痈肿疔毒、瘰疬痰核等。中药山慈菇在临床多用于治疗乳腺癌、肝癌、肺癌、肠癌等多种肿瘤疾病，目前以山慈菇为君药的多种中药复方(如慈丹胶囊、艾愈胶囊、透解祛瘟颗粒等疗效显著，体现了山慈菇具有较好的临床应用价值。虽然山慈菇为多基原药材，除了杜鹃兰Cremastraappendic-ulata(D.Don)Makino，还包括独蒜兰Pleione bulbocodioides(Franch)Rolfe和云南独蒜兰Pleioneyunnanensis Rolfe两种基原，但在现代药理研究山慈菇的抗肿瘤作用中，以基原为杜鹃兰的山慈菇研究居多。

另外，由于杜鹃兰具有自身繁殖困难、人工栽培难度大的局限性，目前已被列入《国家重点保护野生植物名录》和《濒危野生动植物种国际贸易公约》，且由于2020年版《中国药典》(一部)中仅对杜鹃兰做了“性状”和“显微鉴别”2项检查，缺乏有效的质量控制标准，导致市场上存在白及、山兰、丽江山慈菇及老鸦瓣等多种习用品及伪品，掺假混用现象严重。因此，建立杜鹃兰药材的有效的质量检测方法对保证该药材的质量一致性、有效性、其种质资源收集以及在人工繁育优良品种的选育等方面具有重要意义。

中药质量一致性是药效一致性的基础，中药指纹图谱作为一种综合的、可量化的色谱鉴别手段，可以从宏观上整体反映中药所含化学成分的种类和数量，能够反映中药内在质量的整体变化情况，是控制药材质量一致性较为有效的方法之一，结合化学计量学手段，可对复杂的化学测量数据信息进行充分整合、正确表达，能真实、形象地反映中药质量差异，揭示复杂化合物之间的隐藏规律。

因此，开发基于化学指纹图谱结合质量差异成分的杜鹃兰定量定性的质量检测方法，对杜鹃兰中药材进行有效质量控制的方法是很有必要的。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供基于化学指纹图谱结合质量差异成分的杜鹃兰定量定性的质量控制模式，具体如下：

杜鹃兰的指纹图谱，具体是采用UHPLC方法进样测定得到，所用色谱柱为CORTECST3，色谱柱规格为2.1mm×100mm，1.7μm；以0.1％甲酸水溶液(A)-甲醇乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，流速：0.3mL·min

供试品和对照品制备方法同上。

进一步的，取不同地区的杜鹃兰进行测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2012版”，时间窗宽度为0.1min，中位数法生成叠加指纹图谱和对照指纹图谱，标定了11个共有峰，通过对照品比对和质谱碎片信息，共指认出8个化学成分，分别是1号峰为Denneanoside B，2号峰为7-hydroxy-4-methoxyphenanthrene-2,8-di-O-β-D-glucoside，3号峰为8-hydroxy-4-methoxyphenanthrene-2,7-di-O-β-D-glucoside，5号峰为Ephemeranthoquinone B，6号峰为4-甲氧基菲-2,7-二醇、7号峰为Blestriarene C，8号峰为7-hydroxy-2,4-dimethoxyphenanthrene，11号峰为2,7,2'-trihydroxy-4,4',7'-trimethoxy-1,1'-biphenanthrene。

最终所得指纹图谱见图2。

杜鹃兰的质量检测方法，具体是采用UHPLC方法同时测定杜鹃兰中4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C的含量，所用色谱柱为CORTECS T3，色谱柱规格为2.1mm×100mm，1.7μm；以0.1％甲酸水溶液(A)-甲醇乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，流速：0.3mL·min

进一步的，所述UHPLC方法，具体洗脱程序如下：

进一步的，所述供试品溶液，是通过如下方式制备得到：杜鹃兰粉碎，过3号筛，得到杜鹃兰粉末；取杜鹃兰粉末3g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25mL，称定质量，加热回流提取1h，放冷，再称定质量，用50％乙醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得。所述杜鹃兰，是兰科杜鹃兰属植物杜鹃兰Cremastraappendiculata(D.Don)Makino的干燥假鳞茎。

进一步的，所述对照品溶液，是通过如下方式制备得到：精密称取4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C对照品适量，分别置于5mL量瓶中，加甲醇分别制成每1mL含2.01mg4-甲氧基菲-2,7-二醇的溶液和每1mL含1.72mg Blestriarene C的溶液；精密量取上述两种溶液适量，分别置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含4-甲氧基菲-2,7-二醇0.201mg的贮备液1和每1mL含Blestriarene C 0.172mg的贮备溶液2；分别精密量取贮备液1和贮备液2适量，置于10mL量瓶中，加甲醇定容，即得1号混合对照品溶液。精密量取1号混合对照品溶液5mL置10mL容量瓶中，加甲醇稀定容，混匀，即得2号混合对照品溶液；依此类推，即得系列不同浓度的混合对照品溶液，其中4-甲氧基菲-2,7-二醇的系列浓度为0.126～16.08μg/mL，BlestriareneC的系列浓度为0.161～20.64μg/mL。

一种杜鹃兰的质量检测方法，采用薄层色谱鉴别法，具体是照薄层色谱法(通则0502)试验，精密量取8μL供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一硅胶板上，以甲苯-丙酮-冰醋酸(5:3:0.5)为展开剂，预饱和10min，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

进一步的，所述供试品溶液，是通过如下方法制备得到：取杜鹃兰粉末3.0g，具塞锥形瓶中，加50乙醇25ml，回流提取1h，定性滤纸滤过，滤液蒸干，残渣加20mL水溶解；用环己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯依次萃取，每种试剂萃取三次，萃取剂体积为20mL；将得到的各相同萃取层进行合并，然后用旋转蒸发仪挥干溶剂，再加2mL甲醇溶解，即得到环己烷层、二氯甲烷层、和乙酸乙酯层供试品溶液。

进一步的，所述对照品溶液，是浓度100.5μg/mL的4-甲氧基菲-2,7-二醇甲醇溶液和浓度86μg/mL的Blestriarene C甲醇溶液。

进一步的，所述硅胶板，是薄层色谱硅胶GF254板。

一种杜鹃兰的质量检测方法，其包括如下三个步骤：(1)采用前述的指纹图谱及构建方法；(2)采用前述的UHPLC方法同时测定杜鹃兰中4-甲氧基菲-2,7-二醇、BlestriareneC的含量；(3)采用前述的薄层色谱鉴别法。综合三个方法同时进行质量控制，可以进一步增强对杜鹃兰原材料的质量把控。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

(1)本发明采用UHPLC方法同时测定杜鹃兰中4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C的含量，所用色谱柱为CORTECS T3，色谱柱规格为2.1mm×100mm，1.7μm；以0.1％甲酸水溶液(A)-甲醇乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，流速：0.3mL·min

(2)本发明采用上述UHPLC方法获得杜鹃兰指纹图谱。全面反映中药材杜鹃兰的内在化学特征，可以用于鉴别杜鹃兰中药真伪、评价质量优劣，并且确保杜鹃兰制剂一致性、稳定性。

(3)本研究从供试品溶液制备、展开剂组成等方面进行了优化，并分别考察了影响薄层色谱效果的温度、湿度、稳定性、薄层色谱板等多个因素，建立了一种操作简便可行、定性特征明显的杜鹃兰薄层色谱鉴别方法。

(4)本申请以杜鹃兰为对象，建立其有效的质量检测方法。指纹图谱技术能全面反映中药材的内在化学特征，是鉴别中药真伪、评价质量优劣和确保制剂一致性、稳定性的强有力方法。化学模式识别技术是一种根据物质所含化学成分信息，借助计算机处理以揭示事物内部规律的综合技术，利用化学模式识别技术将指纹图谱中的有效信息进行综合、降维和分类分析，更好地对中药材进行质量一致性评价、并筛选出质量差异性成分。本申请采用超高效液相色谱指纹图谱结合化学模式识别方法对35批杜鹃兰药材质量进行了评价，并对其中2个主要差异标志物进行了含量测定研究，为杜鹃兰药材的质量控制提供参考。

附图说明

图1是杜鹃兰UHPLC叠加指纹图谱(S1～S35)。

图2是杜鹃兰对照指纹图谱。

图3是混合对照品(A)和杜鹃兰S27(B)的UHPLC图，其中峰6：4-甲氧基菲-2,7-二醇；峰7：Blestriarene C。

图4是杜鹃兰UHPLC指纹图谱共有峰指认光谱信息图。

图5是35批杜鹃兰样品的聚类分析结果。

图6是35批不同产地杜鹃兰药材的PCA得分图。

图7是35批不同产地杜鹃兰药材的正交偏最小二乘法判别分析得分图。

图8是35批不同产地杜鹃兰药材的OPLS-DA置换检验图。

图9是35批不同产地杜鹃兰药材的正交偏最小二乘法判别分析VIP值图。

图10是杜鹃兰TLC鉴别法不同萃取部位考察结果图。

图11是杜鹃兰TLC鉴别法不同展开剂考察结果图。

图12是杜鹃兰TLC鉴别法不同品牌薄层色谱硅胶GF254板考察结果图。

图13是杜鹃兰TLC鉴别法不同展开湿度考察结果图。

图14是杜鹃兰TLC鉴别法不同展开温度考察结果图。

图15是杜鹃兰TLC鉴别法供试品溶液稳定性考察结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例：

1仪器与材料

1.1仪器

Agilent 1290型超高效液相色谱系统(美国安捷伦科技有限公司)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；EL-104型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Centrifuge型离心机(美国Beckman Coulter公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)。

1.2材料

4-甲氧基菲-2,7-二醇对照品(批号wkq22060806，纯度≥97％)；Blestriarene对照品(批号wkq22053109，纯度≥98％)均购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为自制超纯水。实验所用药材由贵州医科大学药学院生药学教研室刘春花副教授鉴定为兰科杜鹃兰属植物杜鹃兰Cremastra appendiculata(D.Don)Makino的干燥假鳞茎。来源见表1。

表1杜鹃兰药材来源

2方法与结果

2.1溶液的制备2.1.1供试品溶液

杜鹃兰粉碎，过3号筛。取杜鹃兰粉末3g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25mL，称定质量，加热回流提取1h，放冷，再称定质量，用50％乙醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.2对照品溶液

精密称取4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C对照品适量，分别置于5mL量瓶中，加甲醇分别制成每1mL含2.01mg 4-甲氧基菲-2,7-二醇的溶液和每1mL含1.72mgBlestriarene C的溶液。各精密量取上述两种溶液适量，置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含4-甲氧基菲-2,7-二醇0.201mg、Blestriarene C 0.172mg的混合标准评溶液。

2.2色谱条件

色谱柱为CORTECS T3(2.1mm×100mm，1.7μm)，以0.1％甲酸水溶液(A)-甲醇乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序见表2。流速：0.3mL·min

表2梯度洗脱程序

2.3指纹图谱研究

2.3.1精密度试验

取杜鹃兰供试品溶液(S10)，按“2.2”项下色谱条件连续进样测定6次，以6号4-甲氧基菲-2,7-二醇色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD<0.89％,相对峰面积RSD<1.36％，表明仪器精密度良好

2.3.2重复性试验

取同一批杜鹃兰供试品适量(S10)，按“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，以6号4-甲氧基菲-2,7-二醇色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对保留时间RSD<1.26％，相对峰面积RSD<2.10％，表明该方法重复性良好。

2.3.3稳定性试验

取杜鹃兰供试品溶液(S10)，按“2.2”项下色谱条件,分别于制备后0、2、4、6、8、12、24h进样测定，以6号4-甲氧基菲-2,7-二醇色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对保留时间RSD<1.59％，相对峰面积RSD<1.76％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.3.4指纹图谱建立及相似度评价

取35批杜鹃兰样品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，以S1号样品的图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.1min，中位数法生成叠加指纹图谱和对照指纹图谱，标定了11个共有峰，见图1、2。通过比对对照品和药材的色谱图(图3)及紫外光谱图(图3)，指认了其中2个共有峰，6号峰为4-甲氧基菲-2,7-二醇、7号峰为Blestriarene C。通过查阅文献和质谱碎片信息比对，指认出1号峰为Denneanoside B，2号峰为7-hydroxy-4-methoxyphenanthrene-2,8-di-O-β-D-glucoside，3号峰为8-hydroxy-4-methoxyphenanthrene-2,7-di-O-β-D-glucoside，5号峰为Ephemeranthoquinone B，8号峰为7-hydroxy-2,4-dimethoxyphenanthrene，11号峰为2,7,2'-trihydroxy-4,4',7'-trimethoxy-1,1'-biphenanthrene。相似度评价结果见表3，除了S21，其余各产地的杜鹃兰样品与对照指纹图谱的相似度均大于0.89，表明所建立的指纹图谱方法可用于杜鹃兰药材的鉴定和整体质量控制。各杜鹃兰样品与对照指纹图谱基本相似，表明各产地的杜鹃兰样品所含化学成分种类一致。以6号峰(4-甲氧基菲-2,7-二醇)为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对保留时间RSD为0.06％～0.27％，表明各批次间样品共有峰出峰时间较为稳定，但其相对峰面积RSD(41.13％～74％)相差较大，表明不同批次杜鹃兰样品成分含量存在一定差异性。

表3杜鹃兰样品相似度评价结果

2.5化学模式识别

2.5.1系统聚类分析(HCA)

运用SPSS 24.0软件以35批杜鹃兰药材的11个共有峰峰面积为变量，采用组间联接的聚类方法，以平方欧式距离为样品间距离进行聚类分析，构建树系图，结果见图5，将样本划分为不同类群进行评价。当平方欧式距离为15时，各批次杜鹃兰样本主要分为2大类：S1为一大类(I)，其他样本聚为一大类(II)。在平方欧式距离5处，各批次杜鹃兰样本被分为5小类：S24为一小类(A)，S21为一小类(B)，S11、S17聚为一小类(C)，其他样本聚为一小类(D)。

2.5.2主成分分析(PCA)

在SIMCA14.0软件中导入35批不同产地杜鹃兰药材的11个共有峰峰面积进行主成分分析，Scaling(标度化)方式为Ctr(中心化)，特征值及方差贡献率见表4，结果显示，特征值均大于1的有2个，即有2个主成分。前2个主成分的累积方差贡献率为88.262％，表明前2个主成分能够充分体现出杜鹃兰的基本特征和主要信息，可作为杜鹃兰的评价指标。以2个主成分建立坐标系，进行投影，从而分析样品的整体分布情况及各色谱峰对样本分布的贡献大小。图6为PCA散点得分图，结果表明可将35批杜鹃兰药材样品分为5类，其中S1为第I类，S24为第II类，S21为第III类；S11、S17聚为第IV类，其他样本聚为第V类，该结果与聚类分析结果基本吻合，进一步佐证了CA的有效性。表5为主成分载荷矩阵，主要说明样品中11个原始变量与主成分1和主成分2的相关程度，5号峰、6号峰(4-甲氧基菲-2,7-二醇)、7号峰(Blestriarene C)、8号峰在第一主成分中呈明显正载荷值，说明主成分1的方差贡献率主要由共有峰5、共有峰6、共有峰7和共有峰8起主要作用。5号峰在第二主成分中呈明显正载荷值，说明主成分2的方差贡献率主要由共有峰5起主要作用。综上，上述成分对杜鹃兰的整体质量起主要影响作用。

表4杜鹃兰主成分特征值及贡献率

表5杜鹃兰主成分成分矩阵

2.5.3正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)

为了更好地分析上述不同分类样本之间的差异，继而采用有监督的OPLS-DA进行建模研究。在SIMCA14.0软件中导入35批不同产地杜鹃兰药材的11个共有峰峰面积进行OPLS-DA分析，得分散点图见图7。结果在所建立的模型下：R2X＝0.799，R2Y＝0.762，Q2＝0.520，均大于0.5，提示该模型稳定且有较好的预测能力。为考察该模型是否存在过拟合现象，进行了200次置换检验，结果如图8所示，R2Y＝0.496139，Q2Y＝0.323559，表明该模型没有过拟合，可用于判别分析35批杜鹃兰样品的组间差异。为进一步寻找35批杜鹃兰药材的差异标志物，提取了OPLS-DA模型中11个共有峰所代表化学成分的变量权重重要性排序(varia-ble importance in projection，VIP)预测值，各成分VIP值见图9，以VIP>1为有意义变量进行搜寻，按VIP值大小依次为6号峰(4-甲氧基菲-2,7-二醇)、7号峰(BlestriareneC)、5号峰、8号峰，这些成分可能是不同批次样品之间产生差异的主要标志物，该结果与PCA中载荷矩阵寻找的重要性权重变量基本一致。

2.4成分含量测定(基于指纹图谱化学模式识别的含量测定)

通过UHPLC指纹图谱化学模式识别研究，发现导致不同批次杜鹃兰样品之间产生差异的主要成分有4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C、5号峰、8号峰。4-甲氧基菲-2,7-二醇具有较好的抗肿瘤活性和抗氧化活性，Blestriarene C对人肺癌A549细胞的增殖具有显著的抑制作用。故而本实验采用UHPLC法同时测定杜鹃兰中4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C的含量，以期为杜鹃兰质量控制和评价提供科学依据。

2.4.1线性关系考察

精密吸取“2.1.2”项下4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C对照品溶液适量，置于10mL量瓶中，加甲醇定容，即得1号混合对照品溶液。精密量取1号混合对照品溶液5mL置10mL容量瓶中，加甲醇稀定容，混匀，即得2号混合对照品溶液。依此类推，配制系列不同浓度的混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果见表6。

表6杜鹃兰中3个成分的线性关系考察结果

2.4.2精密度试验

取“2.1.2”项下混合对照品储备溶液，用甲醇稀释40倍，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次测定，计算得到4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C峰面积的RSD分别为0.31％、0.93％，表明仪器精密度良好。

2.4.3重复性试验

取同一批杜鹃兰供试品适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算得到4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C峰面积的RSD分别为0.62％、1.25％，表明该方法重复性良好。

2.4.4稳定性试验

取杜鹃兰供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别于制备后0、2、4、8、12、24h进样测定，计算得到4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C峰面积的RSD分别为0.39％、0.49％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.4.5加样回收率试验

取已知2种成分含量的杜鹃兰样品(S27)6份，每份0.5g，精密称定，按样品中含量-对照品量1∶1加入各对照品溶液，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件进样测定，计算得到4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C的平均加样回收率分别为106.32％、98.59％，RSD分别为1.73％、1.2％，表明该方法准确性良好。

2.4.6样品含量测定

取35批杜鹃兰样品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算各成分含量，结果见表7。35批杜鹃兰中4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C含量分别为0.7329～69.4868μg/g、2.3272～81.6388μg/g，表明不同产地杜鹃兰中4-甲氧基菲-2,7-二醇、BlestriareneC含量差异较大。

表7杜鹃兰中2个成分的含量测定结果(μg/g)

3讨论

3.1供试品溶液制备的考察

为使指纹图谱尽可能多地反映杜鹃兰的化学成分，且使杜鹃兰中主要成分含量最大化，对提取方法进行了优化。分别考察了不同提取方式(超声和回流)、溶剂(甲醇、70％甲醇、50％甲醇、乙醇、70％乙醇、50％乙醇)以及提取时间(30，60，90，120min)对色谱图的影响。结果发现，加热回流提效率高于超声提取，50％乙醇作为提取溶剂能提取相对更为丰富全面的成分，提取时间对色谱峰个数和主要色谱峰峰面积大小无明显变化，因此，选择50％乙醇加热回流提取60min为最终提取方法。

3.2色谱条件的选择

在色谱条件优化过程中，主要考察了Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1mm x100mm，1.8um)、CORTECS T3(2.1mm×100mm，1.7μm)2种色谱柱，最终以CORTECS T3 C18色谱峰分离效果较好。采用梯度洗脱方式，流动相考察了水-乙腈、0.1％甲酸水-乙腈、水-甲醇、0.1％甲酸水-甲醇、0.1％甲酸水-乙腈甲醇，以基线平稳状况、分离效果等为评价指标，最终确定以0.1％甲酸水-乙腈甲醇水作为流动相。此外，还考察流动相流速、柱温、波长等，最终确定流速为0.3mL/min，柱温为30℃，检测波长为260nm。

3.3指纹图谱的建立和分析

在用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对不同产地的杜鹃兰药材进行分析的过程中相似程度较高，相似度数值均>0.89，指纹图谱中相对保留时间的RSD值差异不大，但相对峰面积的RSD值相差较大，这可能与野生环境、生长年限等因素有比较大的关系。通过PCA分析，结果表明可将35批杜鹃兰药材样品分为5类，其中S1(贵州安顺)为第I类，S24(贵州兴义)为第II类，S21(贵州仁怀)为第III类；S11(湖北恩施)、S17(贵州晴隆)聚为第IV类，其他样本聚为第V类，该结果与聚类分析结果基本吻合。总的来说贵州的四批杜鹃兰药材(S1贵州安顺、S17贵州晴隆、S21贵州仁怀、S24贵州兴义各自聚为一类。推测这几批杜鹃兰药材的质量可能受到药材原产地的影响较大。

此外，S1(贵州安顺)、S17(贵州晴隆)、S24(贵州兴义)三批药材的采收期均为冬季，而S21(贵州仁怀)的采收期为秋季。结合相似度评价结果知，S21(贵州仁怀)与对照指纹图谱的相似度数值为0.739，其余的三批杜鹃兰相似度数值大于0.9。推测这几批中药材质量间的差异，除了与产地有关，还与中药材的采收期有关。而贵州省外三批杜鹃兰药材(S22陕西石泉、S23四川乐山、S25云南滇西)与贵州省内的另外27批杜鹃兰药材无法分开，提示中药材的质量不仅受到药材产地的影响，更可能受到药材的生长年限、采收时间、产地加工方法等影响。利用载荷图对影响分类的差异性成分进行分析，结合OPLS-DA分析共找出4个强特征峰，分别为6号峰(4-甲氧基菲-2,7-二醇)、7号峰(Blestriarene C)、5号峰、8号峰。

3.4含量测定分析

通过杜鹃兰指纹图谱结合化学模式识别技术筛选得到4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C、5号峰、8号峰4个质量差异成。其中4-甲氧基菲-2,7-二醇和BlestriareneC具有较好的抗肿瘤活性。且课题组前期实验研究表明，以上两种化合物对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖具有较显著的抑制作用。因此推测4-甲氧基菲-2,7-二醇和Blestriarene C既为质量差异成分又为活性成分，故本实验采用UHPLC法同时测定杜鹃兰中4-甲氧基菲-2,7-二醇、Blestriarene C的含量。结果显示，35批杜鹃兰中，2021年1月采收的贵州晴隆杜鹃兰样品(S17)中的4-甲氧基菲-2,7-二醇和Blestriarene C的总含量(A)较高。而其他三个批次间A无明显差异，其平均值约为S17的5倍。6个批次贵州镇宁杜鹃兰，2022年1月采收的杜鹃兰(S27)的A最高，与其余5个批次间相差较大。推测同一产地不同采收期的杜鹃兰中A存在较大差异，可能是采收期、加工方式等多种因素的影响。而同一采收期(2021年12月)，不同产地的杜鹃兰(如S1贵州安顺、S10贵州关岭、S14贵州六枝、S20贵州晴隆、S32贵州镇宁、S35贵州紫云)中A存在较大差异，其中S1贵州安顺杜鹃兰中A最高。推测，同一采收期不同产地杜鹃兰中A存在较大差异，主要是由于产地产生的影响。且2种指标性成分的含量较低，推测可能存在的原因有：药材中含量本身较低、药材经过炮制后煎煮等工艺，相关成分可能发生了变化，进一步导致了含量更低。本研究通过对35批杜鹃兰指纹图谱以及2个成分含量进行分析，可为杜鹃兰质量控制和评价提供科学依据。

基于TLC的杜鹃兰定性鉴别研究

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器

FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；EL-104型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.1.2试药

4-甲氧基菲-2,7-二醇对照品(批号wkq22060806，纯度≥97％)；Blestriarene对照品(批号wkq22053109，纯度≥98％)均购自四川省维克奇生物科技有限公司；薄层层析硅胶GF254板(青岛海洋化工厂分厂)；石油醚(分析纯，天津致远化学试剂有限公司))；丙酮(分析纯，四川西陇科学有限公司)；甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，四川西陇科学有限公司)；三氯甲烷、二氯甲烷、冰醋酸、盐酸、浓硫酸(均购自重庆川东化工有限公司)；环己烷；实验用水为自制超纯水。

1.1.2仪器

薄层数码成像系统(型号：LINOMAT5，厂家：瑞士CAMAG)，薄层色谱半自动电样器(REPORSTAR3)；硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工有限公司、烟台江友硅胶开发有限公司)；硅胶HSGF254薄层板(烟台江友硅胶开发有限公司)；恒温水浴锅。

1.2方法

1.2.1薄层条件考察

预实验通过考察杜鹃兰粗提取物，不同展开体系的摸索：三氯甲烷：甲醇(13:1)、二甲苯-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸(5:12:2:0.5)、甲苯-丙酮-冰醋酸(5:3:0.5)等，不同点样方式的摸索：条状及点状，最终建立薄层色谱方法。

1.2.2药材供试品溶液的制备

取本品粉末3.0g，具塞锥形瓶中，加50乙醇25ml，回流提取1h，定性滤纸滤过，滤液蒸干，残渣加20mL水溶解。用环己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯依次萃取，每种试剂萃取三次，萃取剂体积为20mL。将得到的各相同萃取层进行合并，然后用旋转蒸发仪挥干溶剂，再加2mL甲醇溶解，即得到环己烷层、二氯甲烷层、和乙酸乙酯层供试液。

1.2.3对照品溶液的制备

取4-甲氧基菲-2,7-二醇对照品2.01mg，定容至1ml容量瓶中，再稀释10倍，配置成浓度100.5μg/mL的对照品溶液。Blestriarene C对照品3.44mg，定容至2ml容量瓶中，再稀释10倍，配置成浓度86ug/mL的对照品溶液。

1.2.4不同萃取部位考察

具体结果见图1

1.2.4不同展开剂考察

分别考察了三氯甲烷：甲醇(13:1)、二甲苯-三氯甲烷-甲醇-冰醋酸(5:12:2:0.5)和甲苯-丙酮-冰醋酸(5:3:0.5)三种展开剂，结果见图2。

从图2中3个不同的展开剂可知，在甲苯-丙酮-冰醋酸(5:3:0.5)展开剂中，3批供试品色谱中所呈现的荧光主斑点的分离效果较好，且且斑点显色清晰。

2.3.4薄层鉴别方法的建立

照薄层色谱法(通则0502)试验，精密量取8μL供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一硅胶板上，以甲苯-丙酮-冰醋酸(5:3:0.5)为展开剂，预饱和10min，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

2.3.5不同品牌薄层色谱硅胶GF254板考察

照拟定的薄层色谱鉴别方法，分别考察了青岛海洋硅胶GF254板、烟台黄海硅胶GF254板和烟台黄海硅胶HSGF254板的展开效果，结果见图3。从3个品牌的硅胶G板结果可知，青岛海洋硅胶G板的分离度最好，因此选择青岛海洋硅胶G板。

2.3.6不同展开湿度的考察

分别以不同浓度硫酸调节的展开环境相对湿度为32％、47％、72％，在25℃温度下分别考察不同相对湿度展开的效果，结果见图4。图4结果所示，虽不同湿度下色谱图的条带清晰，Rf值有一定差异，但仍能较好鉴别药材，说明该湿度耐用性较好。

2.3.7不同展开温度的考察

分别在35℃，25℃，15℃相对湿度为58％下展开，考察不同温度对展开的影响，结果见图5。

从图5结果所示，不同温度下色谱图的条带清晰，Rf值差异不明显，说明该药材受温度的影响不大。

2.3.8供试品溶液稳定性考察

将同一批次的本品粉末于3天前、2天前、当天按拟定的方法制备供试品溶液，分别点于同一硅胶G板上，展开，显色，如图6所示。

从图6结果显示，放置1～3天的供试品溶液展开后的色谱图基本一致，表明供试品溶液在3天稳定性良好。

本研究从供试品溶液制备、展开剂组成等方面进行了优化，并分别考察了影响薄层色谱效果的温度、湿度、稳定性、薄层色谱板等多个因素，建立了一种操作简便可行、定性特征明显的杜鹃兰薄层色谱鉴别方法。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。