抑制骨髓脂联素阳性细胞中骨硬化蛋白表达水平的物质在治疗骨质疏松症中的应用

摘要

本申请公开了抑制骨髓脂联素阳性细胞中骨硬化蛋白表达水平的物质在治疗骨质疏松症中的应用。本申请的第一方面提供任包括特异性编辑骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的编码基因的物质在内的至少一种物质在制备治疗骨质疏松症的产品中的应用。实验过程中发现小鼠骨髓Adipoq

说明书

技术领域

本申请涉及骨质疏松症技术领域，尤其是涉及抑制骨髓脂联素阳性细胞中骨硬化蛋白表达水平的物质在治疗骨质疏松症中的应用。

背景技术

骨组织是一个动态的组织，通过破骨细胞和成骨细胞/骨细胞的耦合活动不断地进行重塑。骨质疏松症是一种潜在的疾病，其特征是骨质过度流失、骨强度降低，骨微结构恶化和骨折风险增加。骨质疏松症可发生于任何年龄，多见于绝经后女性和老年男性。随着人口老龄化加剧，骨质疏松症患病率快速攀升，是老年患者致残和致死的主要原因之一。现如今骨质疏松已经严重影响患者的生活质量和生命预期。

目前临床治疗骨质疏松症的一线药物主要是抗骨吸收类药，如骨吸收抑制剂双膦酸盐类药物、RANKL抑制剂、雌激素类药物等，这些药物虽然可以通过减少骨吸收增加骨量，但是无法修复已经受损的骨基质。因此开发针对骨形成的药物至关重要。目前临床上促进骨形成的药物太少，仅有特立帕肽(甲状旁腺激素类似物)以及Evenity(骨硬化蛋白单抗romosozumab)，并且大部分药物需要皮下注射，药物作用范围广，极大增加了药物的副作用。因此开发特异性靶向骨组织的药物具有重大的临床意义。

随着近年肥胖与骨质疏松症的合并症的研究，脂肪细胞与骨细胞之间的相互作用越来越被重视。脂肪衍生因子，如瘦素和脂联素，通过对成骨细胞的直接和间接作用影响骨量积累。骨髓脂肪组织可以通过调节骨形态发生蛋白等信号通路来控制骨量。骨髓脂肪细胞也可以通过分泌可溶性因子与局部骨细胞(包括成骨细胞、破骨细胞和骨细胞)进行交流。因此，有必要尝试通过靶向脂肪细胞的产物来治疗骨质疏松症。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种抑制骨髓脂联素阳性细胞中骨硬化蛋白表达水平的物质在治疗骨质疏松症中的应用。

本申请的第一方面，提供A1)～A5)中至少一种物质在制备治疗骨质疏松症的产品中的应用：

A1)特异性编辑骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的编码基因的物质；

A2)特异性抑制骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的mRNA水平的物质；

A3)特异性抑制骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的表达水平的物质；

A4)特异性抑制骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的活性的物质；

A5)包含A1)～A4)中任一种的载体。

根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：

骨髓脂肪组织是由脂肪组织在骨髓腔内累积形成，它们可以通过内分泌或者旁分泌的方式分泌一系列细胞因子，在骨髓甚至全身机体代谢中发挥重要作用。通过构建脂联素阳性(adipoq

在本申请的一些实施方式中，治疗骨质疏松症的产品包括具有以下B1)～B4)中至少一种作用的产品：

B1)增加骨量；

B2)增加骨密度；

B3)增加骨相对体积；

B4)增加骨形成能力。

在本申请的一些实施方式中，骨质疏松症包括原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症、老年骨质疏松症和特发性骨质疏松症中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，继发性骨质疏松症包括疾病(例如内分泌代谢疾病、结缔组织疾病、慢性肾病导致肾性骨营养不良、胃肠疾病和营养性疾病、血液系统疾病、神经肌肉系统疾病等其中至少一种)、长期制动、失重、药物及毒物(如糖皮质激素、免疫抑制剂、肝素、抗惊厥药、抗癌药、含铝抗酸剂、甲状腺激素、促性腺激素释放激素激动剂、慢性氟中毒、肾衰竭用透析液等其中至少一种)、器官移植中至少一种引起的骨质疏松症。

在本申请的一些实施方式中，特异性编辑骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的编码基因的物质包括CRISPR/Cas、ZFN、TALEN、Cre-LoxP中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，特异性抑制骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的mRNA水平的物质包括反义核酸序列、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，载体为无机载体、有机载体、无机-有机复合载体中的任一种。

在本申请的一些实施方式中，载体为慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中的至少一种。

本申请的第二方面，提供一种用于治疗骨质疏松症的组合物，包括以下A和C的组合；

A)包括以下A1)～A5)中至少一种物质：

A1)特异性编辑骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的编码基因的物质；

A2)特异性抑制骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的mRNA水平的物质；

A3)特异性抑制骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的表达水平的物质；

A4)特异性抑制骨髓中脂联素阳性细胞的骨硬化蛋白的活性的物质；

A5)包含A1)～A4)中任一种的载体；

C)包括以下C1)～C6)中至少一种物质：

C1)钙剂；

C2)骨吸收抑制剂；

C3)骨形成促进剂；

C4)双重作用药物；

C5)维生素D类；

C6)抗骨质疏松中成药。

在本申请的一些实施方式中，钙剂包括无机钙、有机钙中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，无机钙包括磷酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙、氧化钙中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，有机钙制剂选自柠檬酸钙、乳酸钙、枸橼酸钙、醋酸钙、葡萄糖酸钙、丁酸钙、丙酸钙、氨基酸钙中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，骨吸收抑制剂包括双膦酸盐类、RANKL抗体、降钙素、雌激素、SERMS。

在本申请的一些实施方式中，双膦酸盐类包括阿仑膦酸钠、唑来膦酸、利塞膦酸钠、伊班膦酸钠、米诺膦酸中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，RANKL抗体包括地舒单抗。

在本申请的一些实施方式中，骨形成促进剂包括甲状旁腺素类似物。

在本申请的一些实施方式中，双重作用药物包括硬骨抑素抗体。

在本申请的一些实施方式中，维生素D类包括维生素D、活性维生素D及其类似物。其中，活性维生素D类似物包括维生素D3的生物学活性代谢物、生物学活性代谢物的前体、侧链和/或骨架修饰的维生素D骨架的化合物，具体包括阿法骨化醇、骨化三醇、艾地骨化醇、卡泊三醇、他卡西醇、马沙骨化醇、帕立骨化醇、氟骨三醇、度骨化醇、骨化二醇、伊奈骨化醇、西奥骨化醇、艾洛骨化醇、来沙骨化醇、司骨化醇等其中至少一种。

在本申请的一些实施方式中，抗骨质疏松的中成药包括骨碎补总黄酮制剂、淫羊藿总黄酮制剂、人工虎骨粉制剂或者其它能够抗骨质疏松的中药制剂等。

在本申请的一些实施方式中，用于治疗骨质疏松症的组合物为药物。

目前骨硬化蛋白单克隆抗体(商品名Evenity)是皮下注射给药，具有潜在心血管疾病发病风险。而本申请通过实验发现，骨髓Adipoq

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的实施例中骨硬化蛋白(SOST)和脂联素(adiponectin)的免疫荧光染色结果。

图2是骨髓Adipoq

图3是骨髓Adipoq

图4是骨髓Adipoq

图5是骨髓Adipoq

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数，约的含义是指在本数±20％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％等的范围内。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

下述实施例中涉及的两组不同的小鼠说明如下：

将Sost-flox/flox小鼠与具有Adipoq启动子驱动的Cre转基因的小鼠杂交，得到具有骨髓脂联素阳性(Adipoq

实施例1

将KO组和WT组的小鼠取胫骨切片，采用抗骨硬化蛋白、脂联素或DAPI抗体进行免疫荧光染色。结果如图1所示，从图中可以看出，对照组小鼠骨髓细胞中脂联素和骨硬化蛋白存在共定位，而敲除组小鼠的共定位减少。该结果表明，小鼠骨髓Adipoq

实施例2

WT组和KO组分别雄鼠6只、雌鼠6只，取右侧股骨样本进行Micro-CT扫描，以股骨远端生长板融合位置往下500μm作为评价骨小梁结构的起始点，股骨终端约1.5mm长度为评价皮质骨的兴趣区域，用NRecon v1.7.4.6重构软件进行三维重建，并分析骨体积分数(Bonevolume/Total volume，BV/TV)和骨密度(Bone Mineral Density，BMD)。结果如图2所示，从股骨远端三维重建扫描图可见，KO组小鼠的骨量、相对骨体积和骨密度都显著大于WT组。因此，骨髓Adipoq

实施例3

WT组和KO组分别雄鼠6只、雌鼠6只处死后取血，室温静置30分钟，4℃1000g离心10分钟，取血清，检测骨硬化蛋白含量。WT组和KO组雌鼠各6只，取性腺周围脂肪(eWAT)、腹股沟脂肪(subWAT)和肩胛骨棕色脂肪(BAT)称重。WT组和KO组雌鼠各6只，取性腺周围脂肪(eWAT)、腹股沟脂肪(subWAT)和肩胛骨棕色脂肪(BAT)，4％多聚甲醛固定24小时，梯度脱水，石蜡包埋后切片，进行HE染色。结果如图3的A、B和C所示，WT组和KO组小鼠外周血骨硬化蛋白含量无差别，外周脂肪组织重量和脂肪组织形态大小无明显差别。

WT组和KO组雌性小鼠各6只，实验前禁食16小时，腹腔注射葡萄糖后，检测30分钟、60分钟、120分钟小鼠血糖变化。结果如图3的D所示，WT组和KO组的血糖水平无明显差别。

WT组和KO组雌性小鼠各6只，实验前禁食6小时，腹腔注射胰岛素后，检测30分钟、60分钟、120分钟小鼠血糖变化。结果如图3的E所示，WT组和KO组的血糖水平无明显差别。

综合以上多个实验结果，骨髓Adipoq

实施例4

WT组和KO组小鼠在处死前分别两次给予钙黄绿素注射，标记小梁骨和皮质骨的钙质沉积，两条荧光线之间的距离即为两次注射间期的骨形成量，并以此计算骨形成率(BFR)。结果如图4的A和B所示，敲除组小鼠骨形成量和骨形成率都要显著高于对照组小鼠。

WT组和KO组小鼠的胫骨石蜡切片后，复水，抗原修复18小时后，免疫荧光通透液通透10分钟，免疫荧光封闭液封闭1小时后，一抗4℃封闭过夜，选择相应荧光二抗常温避光孵育1小时，用含有DAPI的封片剂封片，4℃避光保存。结果如图4的C所示，敲除组小鼠成骨细胞特异性转录因子(Osterix)表达量显著增加，说明敲除组小鼠的骨形成能力高于对照小鼠。

实施例5

分别对WT组和KO组小鼠实施假手术(Sham组)和卵巢切除术(OVX组)，使用Micro-CT扫描并重建股骨的三维显微CT重建图像。结果如图5所示，WT组小鼠OVX手术后，骨量明显下降，表明对照组小鼠在OVX诱导下形成了骨质疏松表型。而敲除组小鼠OVX手术后骨量、骨密度和相对骨体积相比于对照组手术后都明显增加。因此，骨髓Adipoq

实施例6

本实施例提供一种靶向脂联素的AAV病毒载体的应用，AAV病毒载体上负载有干扰SOST的shRNA。将该AAV病毒载体以一定滴度经尾静脉注射到已经实施卵巢切除术的WT组小鼠，继续喂养10天，发现骨量、骨密度和相对骨体积相比于手术后都明显增加。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。