佛手柑内酯脂质体及制法、包封率测定方法、佛手柑内酯脂质体凝胶及制法

摘要

本发明公开了佛手柑内酯脂质体及制法、包封率测定方法、佛手柑内酯脂质体凝胶及制法，属于药物技术领域。本发明的佛手柑内酯脂质体的制备方法，所述脂质体的原料包括佛手柑内酯、蛋黄卵磷脂、胆固醇和吐温80；所述制备方法为薄膜分散法。本发明的佛手柑内酯脂质体包封率的测定方法采用葡聚糖微柱离心法测定。本发明还公开了以上述的佛手柑内酯脂质体为原料的佛手柑内酯脂质体凝胶。本发明创造性地以乳香、没药混合挥发油为促渗剂，不仅能促进药物渗透，还能发挥抗炎消肿的功效。本发明创造性地将佛手柑内酯制成脂质体外用凝胶，增加了佛手柑内酯溶解度与皮肤滞留量，为水溶性差的药物用于白癜风治疗提供了研究基础。

说明书

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及佛手柑内酯脂质体及制法、包封率测定方法、佛手柑内酯脂质体凝胶及制法。

背景技术

补骨脂素类化合物广泛存在于伞形科、菊科以及芸香科植物中，是一类具有较强光化学作用的天然植物光敏剂。补骨脂素类化合物由于光敏特性的存在，在白癜风临床治疗中占据重要地位。佛手柑内酯是补骨脂素类化合物中的重要代表之一，但由于佛手柑内酯水溶性差，不易透皮吸收，生物利用度低，大大地限制了其在皮肤局部用药的应用。

因此，提供一种佛手柑内酯制剂，能显著提高其溶解度和药物的透皮吸收速率，增加药物皮肤滞留量，提高药物生物利用度，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种佛手柑内酯脂质体的制备方法，方法简单，操作简便，制备的脂质体包封率高，粒径均一，易透皮吸收，生物利用度高。

本发明的目的之二在于，提供采用该制备方法制得的佛手柑内酯脂质体。

本发明的目的之三在于，提供该佛手柑内酯脂质体包封率的测定方法。

本发明的目的之四在于，提供以该佛手柑内酯脂质体为原料的佛手柑内酯脂质体凝胶。

本发明的目的之五在于，提供佛手柑内酯脂质体凝胶的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的一种佛手柑内酯脂质体的制备方法，所述脂质体的原料包括佛手柑内酯、蛋黄卵磷脂、胆固醇和吐温80；其中蛋黄卵磷脂与胆固醇质量比为3～8:1；蛋黄卵磷脂与佛手柑内酯质量比为15～45:1；蛋黄卵磷脂与吐温80的质量体积比为4～7.5：1，蛋黄卵磷脂的质量单位为g时，吐温80的体积单位为ml；

所述制备方法为薄膜分散法。

申请人分别考察了注入法、逆向蒸发法、薄膜分散法制备佛手柑内酯脂质体，结果发现，采用薄膜分散法制备时，所得脂质体粒径较小、包封率较高。

本发明的部分实施方案中，蛋黄卵磷脂与胆固醇质量比为4:1，蛋黄卵磷脂与佛手柑内酯质量比为30:1，蛋黄卵磷脂与吐温80的质量体积比为6.3：1，蛋黄卵磷脂的质量单位为g时，吐温80的体积单位为ml。

本发明的部分实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：

S1.称取蛋黄卵磷脂、胆固醇和佛手柑内酯，加溶剂溶解后，旋转蒸发至形成薄膜；

S2.加入吐温-80的缓冲溶液，水合后，再超声处理，即得。

本发明的部分实施方案中，S1中所述的溶剂包括三氯甲烷；

所述S2中，缓冲溶液的pH值为6～7，优选为6.5；

所述缓冲溶液中吐温-80的体积浓度为1～1.8％，优选为1.59％。

所述水合时间为10～60min，优选为30min；

所述超声条件为低温超声，优选为冰浴条件下超声。

本发明提供的上述制备方法制得的佛手柑内酯脂质体。

本发明提供的上述的佛手柑内酯脂质体包封率的测定方法，该测定方法采用葡聚糖微柱离心法测定，具体包括以下步骤：

步骤1.制备微型凝胶柱：取溶胀后的葡聚糖凝胶，装柱，排除气泡后，离心，使凝胶柱失水并产生柱壁分离，备用；优选地，柱高为2～5cm，优选为3cm；

步骤2.制备待测样品：吸取佛手柑内酯脂质体样品，缓慢加入微型凝胶柱中，用PBS缓冲液洗脱，收集洗脱液，加入甲醇超声溶解，并定容，得到待测样品；

步骤3.制备对照样品：吸取佛手柑内酯脂质体样品，直接加甲醇溶解并定容，得到对照样品；

步骤4.采用高效液色谱法分别测定待测样品和对照样品中佛手柑内酯含量，计算，得到佛手柑内酯脂质体包封率；

优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：以ODSC18为固定相，以乙腈-0.1％醋酸水溶液45～52:48～55为流动相，检测波长320nm。

本发明的部分实施方案中，采用HPLC进样分析得到待测样品中佛手柑内酯含量C

包封率是用来评价脂质体制剂的一项重要指标，现有技术中测定包封率的方法主要有(高速、低速)离心法、大孔树脂法、透析法、葡聚糖凝胶柱层析法、滤膜法、微型柱离心法、鱼精蛋白凝集法、萃取法以及超滤法等。申请人经过大量试验，发现由于游离的药物在溶液中形成了较大的纳米粒甚至微晶，使得游离药物与脂质体分离效果不好，因此采用离心法以及超滤离心法测定本发明脂质体的包封率时回收率不佳。考虑到微柱离心法与透析法相比具有时间较快、操作较方便，故最终选择微柱离心法测定佛手柑内酯脂质体包封率。

本发明中利用葡聚糖凝胶的分子筛特性进行分离，由于脂质体与游离药物的分子量差异，使得分子量较大的脂质体会被先洗脱下来，而游离药物被后洗脱下来，其原因在于小分子药物容易被葡聚糖凝胶吸附到内部空隙。

本发明的部分实施方案中，吸取佛手柑内酯脂质体样品，缓慢加入微型凝胶柱中，离心处理0.5～3min，促使物质进入凝胶内部，加入0.8～1.5倍佛手柑内酯脂质体样品体积的PBS缓冲液洗脱，并在同样转速下离心处理2～3min，至少重复5次，合并洗脱液，加入甲醇超声溶解，并定容，得到待测样品。

本发明提供的以上述的佛手柑内酯脂质体为原料的佛手柑内酯脂质体凝胶，该佛手柑内酯脂质体凝胶的原料按质量百分比计，包括有凝胶基质0.75％～1.2％、保湿剂5％～15％、促渗剂0.5-1.5％，佛手柑内酯脂质体30-50％，余量为缓冲溶液；

优选地，所述佛手柑内酯脂质体凝胶的原料按质量百分比计，包括有凝胶基质1％、保湿剂10％、促渗剂1％，佛手柑内酯脂质体40％，余量为缓冲溶液，优选地，缓冲溶液的pH值为6～7，更优选为6.5。

本发明的部分实施方案中，所述凝胶基质包括卡波姆940、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠，优选为卡波姆940；

所述保湿剂包括甘油或/和丙二醇，优选为丙二醇；

所述促渗剂为乳香和没药的挥发油；优选地，乳香和没药的挥发油质量比为0.8～1.2：0.8～1.2，优选为1：1。

本发明的部分实施方案中，包括以下步骤：

取佛手柑内酯脂质体，加入凝胶基质、促渗剂、保湿剂溶胀，混合均匀后加入缓冲溶液，搅拌均匀，即得。

本发明的部分实施方案中，溶胀时间为12～48小时，优选为24小时；

加入缓冲溶液，搅拌均匀后，加入碱液调节pH为5.5～6.5，即得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明设计科学，构思巧妙，本发明创造性地以乳香、没药混合挥发油为促渗剂，不仅能促进药物渗透，还能发挥抗炎消肿的功效。

本发明创造性地将佛手柑内酯制成脂质体外用凝胶，增加了佛手柑内酯溶解度与皮肤滞留量，为水溶性差的药物用于白癜风治疗提供了研究基础。

附图说明

图1为3种因素对粒径(图a～c)及包封率(图d～f)影响图；

图2为微柱离心法测定佛手柑内酯脂质体(A)与对照品溶液(B)洗脱曲线图；

图3为不同保湿剂的失水率考察结果图；

图4为不同浓度促渗剂的影响结果图；

图5为佛手柑内酯脂质体(左)和稀释后的脂质体(右)外观图；

图6为佛手柑内酯脂质体电镜图；

图7为佛手柑内酯脂质体粒径分布图；

图8为佛手柑内酯脂质体Zeta电位图；

图9为佛手柑内酯DSC图；

图10佛手柑内酯脂质体冻干粉DSC图；

图11为佛手柑内酯混悬液与佛手柑内酯脂质体Q-t曲线；

图12为佛手柑内酯混悬液与佛手柑内酯脂质体经皮Qt-t关系图；

图13为佛手柑内酯脂质体凝胶外观图；

图14为佛手柑内酯脂质体凝胶电镜图；

图15为佛手柑内酯脂质体凝胶粒径分布图；

图16为佛手柑内酯脂质体凝胶Zeta电位图

图17为佛手柑内酯凝胶、佛手柑内酯脂质体凝胶体外累积释放度图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中的乳香、没药混合挥发油油购于江西雪松药业公司。

本发明实施例中所用的佛手柑内酯购于重庆高仁生物科技有限公司。

实施例1

本实施例公开了本发明的佛手柑内酯脂质体的制备方法，具体为：

在50ml三氯甲烷中分别加入300mg蛋黄卵磷脂、75mg胆固醇、10mg佛手柑内酯，溶解后倒入圆底烧瓶中，旋转蒸发至有机溶剂挥发除尽，并形成均匀薄膜。而后加入3ml1％吐温-80PBS(pH值为7.0)水合0.5h使薄膜脱落，再于冰水浴条件下探头超声10min，即得佛手柑内酯脂质体。

实施例2

本实施例公开了佛手柑内酯脂质体的筛选试验，分别采用注入法、逆向蒸发法、薄膜分散法制备佛手柑内酯脂质体，具体为：

(1)注入法

在50ml三氯甲烷中分别加入300mg蛋黄卵磷脂、75mg胆固醇、10mg佛手柑内酯，溶解后得到有机相。使用注射器将有机相缓慢注入到1％吐温-80PBS(pH值为7.0)中(50℃)，开启磁力搅拌器转速为200r·min

(2)逆向蒸发法

在50ml三氯甲烷中分别加入300mg蛋黄卵磷脂、75mg胆固醇、10mg佛手柑内酯，溶解后，加入适量的水溶液超声乳化(冰水浴条件下)，使之转化成为稳定的乳液后，倒入圆底烧瓶中旋转蒸发至形成胶状，加入3ml1％吐温-80PBS(pH值为7.0)，继续旋蒸0.5h至胶体脱落，最后探头超声10min(冰水浴条件下)，即得。

(3)薄膜分散法

采用实施例1的方法制备。

将上述三种方法制得的脂质体进行粒径和包封率测试，结果如如表1所示：

表1

结果表明：采用薄膜分散法时，所得佛手柑内酯脂质体的粒径较小、包封率高，故本发明采用薄膜分散法制备佛手柑内酯脂质体。

实施例3

本实施例考察不同蛋黄卵磷脂与胆固醇比例、不同蛋黄卵磷脂与佛手柑内酯脂比例、不同吐温80用量对佛手柑内酯脂质体质量的影响。

不同蛋黄卵磷脂与胆固醇比例对佛手柑内酯脂质体质量影响的考察

按实施例1的方法制备佛手柑内酯脂质体，其中蛋黄卵磷脂用量为300mg，胆固醇按下表比例配置，其余条件均与实施例1相同。结果如下表所示：

表2蛋黄卵磷脂-胆固醇质量比对佛手柑内酯脂质体的影响

结果表明，随着蛋黄卵磷脂与胆固醇比例的增加，佛手柑内酯脂质体的粒径逐渐减小，包封率则先增加后减少。当蛋黄卵磷脂与胆固醇质量比为2:1和3:1时，在冰箱放置几天后出现分层情况。

2.不同蛋黄卵磷脂与佛手柑内酯脂比例对佛手柑内酯脂质体质量影响的考察

按实施例1的方法制备佛手柑内酯脂质体，其中蛋黄卵磷脂用量为300mg，佛手柑内酯脂按下表比例配置，其余条件均与实施例1相同。结果如下表所示：

表3蛋黄卵磷脂-佛手柑内酯质量比对佛手柑内酯脂质体的影响

结果表明，粒径随着蛋黄卵磷脂与药物的比例不断增大而减小，包封率则呈先增大后减小的趋势。

3.不同吐温80用量对佛手柑内酯脂质体质量影响的考察

按实施例1的方法制备佛手柑内酯脂质体，其中吐温-80PBS溶液的浓度按下表比例配置，其余条件均与实施例1相同。结果如下表所示：

表4吐温-80用量对佛手柑内酯脂质体的影响

结果表明，粒径随着表面活性剂吐温-80用量的增加而呈先减小后增大的趋势，包封率则呈先增大后减小的趋势。

实施例4

本实施例对佛手柑内酯脂质体制备方法中步骤S2的水合条件，即水化介质温度、水化介质pH值、水化时间、水化介质用量进行了考察。

1.水化介质温度考察

按实施例1的方法制备佛手柑内酯脂质体，水化介质温度按下表操作，其余条件均相同。结果如下表所示：

表5水化介质温度对佛手柑内酯脂质体的影响

结果表明，温度在一定范围内对脂质体的粒径与包封率无明显影响，但温度过高时可能会引起膜材氧化，导致包封率降低。

2.水化介质pH值考察

按实施例1的方法制备佛手柑内酯脂质体，水化介质pH值按下表操作，其余条件均相同。结果如下表所示：

表6水化介质pH对佛手柑内酯脂质体的影响

结果表明，不同pH水化介质制备的脂质体差异较明显：在pH较小的环境下，包封率相对较高，脂质体体系较为稳定。

3.水化时间考察

按实施例1的方法制备佛手柑内酯脂质体，水化时间按下表操作，其余条件均相同。结果如下表所示：

表7水化时间对佛手柑内酯脂质体的影响

结果表明，当水化持续时间在1.5h内时，脂质体粒径与包封率变化不明显，且当水化时间为0.5h和1h时，包封率相差不大。

4.水化介质用量考察

按实施例1的方法制备佛手柑内酯脂质体，水化介质用量按下表操作，其余条件均相同。结果如下表所示：

表8水化介质用量对佛手柑内酯脂质体的影响

结果表明，水化介质用量对粒径大小及包封率影响不显著。

实施例5

本实施例在实施例3单因素考察的实验基础上，为进一步优化佛手柑内酯脂质体的处方，采用Box-Behnken效应面法以粒径(Y

表9因素水平表

表10响应面实验方案及结果

表11方差分析

采用Design-Expert8.0.6.1软件对设计中的两个数据结构进行了模型拟合和线性计算函数分析，以图中Y

Y

+3.97X

Y

8.78X

由拟合结果可知，模型相关性系数R

且实验中的误差相对较小，模型的拟合程度也比较高，极具有统计科学性。

从方差分析结果来看，在模型Y

3种因素对粒径(图a～c)及包封率(图d～f)影响如附图1所示：脂质体粒径随卵磷脂与药物的质量比增加出现逐渐减小的趋势，这是因为药物加入到脂质体中会增加脂质体粒径，当加入药物量越来越少时，脂质体粒径也会出现减小的情况。脂质体包封率随卵磷脂与胆固醇质量比的增加而降低，随卵磷脂与药物的质量比增加先增加后减小，随吐温-80浓度增加先增加后减小。分析原因可能是当加入胆固醇过少时，胆固醇无法调节脂质体膜的流动性，引起脂质体包封率降低。加入脂质体的药物若超过磷脂所能承载的最大负荷量，就会导致脂质体不稳定，包封率降低。当脂质体中加入吐温-80时，可对脂质体中药物达到增溶作用，包封率增大，当吐温-80的量过大时会使得部分膜材溶解于其中，从而造成包封率的降低。

采用实验软件，得到优选处方：X

表12验证实验结果

实施例6

本实施例公开了本发明的包封率检测方法的考察。

1.微型凝胶柱的制备

分别取适量溶胀12h后的葡聚糖凝胶Sephadex G-25、Sephadex G-50，装入提前备好的2.5mL注射器中(去除针头和内塞，并在针管底部放与针管内径相当的圆形滤纸2张)，进行排除气泡操作后，放入离心机中处理2min(转速为2000r·min

2.葡聚糖凝胶型号的选择

按实施例1的方法制备不添加药物的空白脂质体。取适量空白脂质体用PBS缓冲液稀释10倍后进行全波长扫描，显示在400nm处有稳定吸收，故选择在波长为400nm条件下检测。

取200μL空白脂质体，分别缓慢加入由Sephadex G-25与Sephadex G-50制备的凝胶柱顶端，离心机处理1min(1000r·min-1)，促使脂质体进入凝胶内部，继续加入200μLPBS洗脱脂质体，并在同样转速下离心处理2min，连续重复5次上述操作，并将每次的洗脱液收集到一起，使用PBS定容至10mL；另取200μL空白脂质体，加入PBS定容至10mL，将上述两种溶液分别于400nm下测定吸光度，考察两种型号的葡聚糖凝胶对空白脂质体的洗脱能力(以回收率表示)。

表13葡聚糖凝胶型号的选择

结果表明，Sephadex G-50对空白脂质体的洗脱效果更好。

3洗脱曲线的考察

分别精密吸取200μL按实施例1方法制得的含药脂质体和40％乙醇配制的佛手柑内酯对照品溶液，避开管壁，分别缓慢加入凝胶柱顶端，离心机处理1min(1000r·min-1)，促使物质进入凝胶内部，继续加200μL PBS洗脱，并在同样转速下离心处理2min，重复7次(为保证脂质体被100％洗脱完全，确保后面洗脱出来的是游离药物，而不包含残留的含药脂质体)上述操作后，改用40％乙醇溶液进行洗脱，每次洗脱后均在1000r·min-1转速下离心处理2min，重复洗脱8次。将上述操作得到的15份洗脱液每份都单独收集，均加入甲醇定容至10mL，滤过后进行HPLC分析，计算含药量，并分别绘制佛手柑内酯脂质体、对照品溶液的洗脱曲线图，结果如附图2所示。

色谱条件：色谱柱为SyncronisC18(250×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈-0.1％醋酸水溶液(49:51)，体积流量1.0mL·min-1；柱温30℃；检测波长320nm；进样量10μL。

结果表明，脂质体主要在前面的流份被洗脱出来，游离的佛手柑内酯在第10-15流份被洗脱出来，脂质体可与游离的佛手柑内酯有效分离。

实施例7

本实施例公开了佛手柑内酯脂质体凝胶的制备方法，采用直接溶胀法制备。具体为：取按实施例方法制得的佛手柑内酯脂质体40g，加入1g卡波姆940凝胶基质、1g乳香、没药混合精油，1g丙二醇，溶胀24h，混合均匀后加入PBS(pH为6.5)溶液至100g，再加入适量三乙醇胺调节pH值为6.0，即得佛手柑内酯脂质体凝胶。

实施例8

本实施例公开了佛手柑内酯脂质体凝胶的凝胶基质考察、凝胶基质浓度考察、保湿剂选择以及促渗剂浓度的选择。

1.凝胶基质考察

分别称取0.1g卡波姆940、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、海藻酸钠加入10gPBS(pH为6.5)溶液中溶胀24h，并以粘度和延展性为评价指标，选取佛手柑内酯脂质体凝胶基质。结果如下表所示：

表14凝胶基质选择

结果显示，同等浓度下，卡波姆940粘性较好，故最终选择卡波姆940作为佛手柑内酯脂质体凝胶的基质。

2.凝胶基质浓度考察

分别制备0.5％、0.75％、1％、1.5％、2％、3％的卡波姆940，并根据凝胶性状确定最终基质浓度。

表15凝胶基质浓度选择

结果表明，浓度过小或过大均不适合涂抹，卡波姆浓度在0.75％～1％时，较为合适

3保湿剂的选择

选取凝胶保湿剂丙二醇和甘油，以失水率为评价指标，在50℃烘箱条件下干燥，计算并比较第1、2、4、6、8、10h的失水率，考察两种保湿剂不同浓度的保湿效果。失水率计算公式：

式中M为空白称量瓶和加入凝胶的总质量，Mi为每个时间点称量瓶和凝胶的总质量，M0为空白称量瓶的质量。

结果如附图3所示。由结果可得，两种保湿剂失水率均随着保湿剂使用量增加而有所减小，且丙二醇的保湿效果明显优于甘油，故最终选择丙二醇作为凝胶剂的保湿剂。

4.促渗剂用量的选择

按实施例7的方法，采用不同用量的乳香和没药混合挥发制备佛手柑内酯脂质体凝胶，以12h离体皮肤累积透过量为评价指标，考察其促渗效果。结果如附图4所示。

结果表明，佛手柑内酯的累积释放量随着促渗剂浓度呈现先升后降的趋势，故选择促渗剂的用量为佛手柑内酯脂质体凝胶的1wt.％。

试验例1

取按实施例1方法制备的佛手柑内酯脂质体，进行性能测试。

1.佛手柑内酯脂质体形态学观察

分别于肉眼和利用透射电镜(TEM)来观察佛手柑内酯脂质体的粒子形态。结果如图5和附图6所示。佛手柑内酯脂质体为乳白色混悬液，肉眼观察时，未见不溶颗粒，且脂质体稀释后有淡蓝色乳光。透射电镜图结果表明，佛手柑内酯脂质体形态近似于球形，且粒子之间未出现粘连。

2佛手柑内酯粒度分布及电位测定

取适量佛手柑内酯脂质体，加蒸馏水稀释，振荡摇匀后在室温下测定佛手柑内酯脂质体的粒径与电位，重复测定3次。结果如附图7和附图8所示。佛手柑内酯脂质体粒径为(173±2.97)nm，PDI为(0.22±0.02)，Zeta电位为(-14.46±0.37)mV。结果表明，佛手柑内酯脂质体粒径符合纳米制剂标准，且粒径分布较窄。

3包封率与含量测定

取按实施例1方法制备的佛手柑内酯脂质体样品3批，分别测定包封率与含量。

表16佛手柑内酯脂质体包封率与含量结果

由表中结果可知，3批脂质体样品平均包封率为83.12％，平均含量为3.26mg·mL-1。

4差示扫描量热(DSC)分析

分别称取佛手柑内酯原料药与脂质体冻干粉适量，放于铝坩埚内，盖上坩埚盖，并以空白坩埚做参比，设置初始温度值为0℃，终止温度值为300℃，升温速率为20℃·min-1做差示扫描量热分析。结果如图9和图10示，佛手柑内酯在195℃有明显的吸热峰，而在脂质体冻干粉中无药物峰出现，表明药物被较好地包封在脂质体中。

5有机试剂残留测定

分别取0.5mL三氯甲烷标准溶液与佛手柑内酯脂质体于10mL容量瓶中，DMF定容至刻度线，按照《中国药典》2020版四部通则0861第一法[38](毛细管柱顶空进样等温法)进行测定。结果显示，在脂质体中未检测到三氯甲烷，表明佛手柑内酯脂质体中无三氯甲烷残留。

试验例2

取按实施例1方法制备的佛手柑内酯脂质体，进行体外释放度考察。

采用恒温振荡箱进行测定，设置振荡箱速度为100rpm，温度为37℃，漏槽条件为1％SDS磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)。分别吸取含3mg的佛手柑内酯混悬液(乙醇配制)与佛手柑内酯脂质体至透析袋(已事先处理好)中，用夹子夹紧透析袋两端后，放于烧杯(装有100mL释放介质)中，并于0、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12h精密吸取2mL介质溶液，同时补加等体积同温空白介质，样品溶液滤过后，并按实施例6的色谱条件进样分析，计算累积释放度Q，并对时间t作图。结果如附图11所示。由图中结果可知，前0.25h是药物的突释阶段，佛手柑内酯混悬液释放较快，而佛手柑内酯脂质体释放较慢，无突释现象出现。在12h时，佛手柑内酯混悬液的累积释放量达95.64％，而佛手柑内酯脂质体的累积释放量仅56.72％，说明脂质体能延缓佛手柑内酯的释放。分别对体外释放结果进行拟合，得到一级方程、Higuchi方程结果分别为：Ln(1-Q)＝-0.0706t-0.1728，r＝0.935；Q＝16.706t1/2+5.4329，r＝0.981，说明佛手柑内酯脂质体符合缓释制剂要求。

试验例3

取按实施例1方法制备的佛手柑内酯脂质体，进行透皮试验。

1.皮肤的预处理

选取昆明小鼠，事先用剃刀和脱毛膏给小鼠的腹部进行脱毛，24h后将小鼠脱颈椎处死，取下小鼠的腹部皮肤，并用干净的棉签蘸取生理盐水将皮肤的结缔组织与脂肪去掉，用滤纸将皮肤多余的水分吸干后，用锡箔纸将皮肤铺平包起来，放于-20℃冰箱中备用(于一周内用完)。

2.体外透皮试验

将冰箱中的小鼠皮肤拿出，恢复至室温，用生理盐水冲洗后用滤纸将皮肤上的水分吸干，固定于立式的Franz扩散池上，角质层向上。向扩散池中注入6.5mL30％乙醇PBS(pH为7.4)溶液作为接收介质，并将气泡充分有效地向外排出，使得皮肤与接受介质完全接触。设定透皮扩散仪的转速为350r·min

式中Qt为t时间的累积透过量，Vr代表接收液的体积(本研究为6.5mL)，C

透皮实验结束后从扩散池上取下皮肤，按照相关文献的方法

表17佛手柑内酯混悬液及佛手柑内酯脂质体透皮指标

结果表明，佛手柑内酯脂质体与佛手柑内酯混悬液透皮吸收存在差异，佛手柑内酯脂质体Q24、Js以及皮肤滞留量均大于佛手柑内酯混悬液，说明佛手柑内酯脂质体不仅能促进佛手柑内酯透皮吸收，还能提高佛手柑内酯在皮肤上的滞留量，有利于佛手柑内酯发挥药效。

试验例4

取按实施例1方法制备的佛手柑内酯脂质体，放于4℃的冰箱避光保存，并于0、5、10天时取出样品，观察脂质体的外观形态，并取样进行脂质体包封率和粒径的测定。结果如下表所示。

表18佛手柑内酯脂质体稳定性参数

结果表明，佛手柑内酯脂质体在前10天基本无变化，说明佛手柑内酯脂质体在短期内具有良好的稳定性。

试验例5

取按实施例7方法制备的佛手柑内酯脂质体凝胶，进行理化性能测试。

1.佛手柑内酯脂质体凝胶形态学观察

如附图13所示，按照凝胶制备最优工艺制得的凝胶为质地细腻、均匀、稠度适中的乳白色半透明固体，涂展性良好。

利用透射电镜观察凝胶形态如附图14所示，佛手柑内酯脂质体凝胶呈球型，说明将佛手柑内酯脂质体加入凝胶中并未改变其形态。

2.凝胶粒度分布及电位测定

取适量佛手柑内酯脂质体凝胶，加PBS稀释，振荡摇匀后在室温下测定佛手柑内酯脂质体凝胶的粒径与电位，平行测定3次。结果如附图15和附图16所示。佛手柑内酯脂质体凝胶粒径为(194.6±6.77)nm，PDI为(0.28±0.02)，Zeta电位为(-33.24±0.98)mV。由结果可知，凝胶相关参数与脂质体相关参数差异不大，表明将脂质体制成凝胶后并没有改变脂质体性质。

3.pH值测定

取0.5g佛手柑内酯脂质体凝胶于小烧杯中，加入10mL蒸馏水稀释后，用pH计测定其pH值，重复进行3次。结果显fi，凝胶pH值为6.13±0.05。皮肤外用制剂最适合pH值范围为5.5～6.5，说明本发明的佛手柑内酯脂质体凝胶符合要求。

4.粘度测定

根据《中国药典》2020版第四部通则0633第三法[45]测定佛手柑内酯脂质体凝胶粘度。使用NDJ-1型旋转式粘度计，4号转子，进行粘度测定。测得凝胶粘度系数为(37.6±1.07)Pa·s，其延展性较好，说明本发明的佛手柑内酯脂质体凝胶符合要求。

5.离心稳定性

取5g佛手柑内酯脂质体凝胶于离心管中，10000r·min-1离心30min，观察凝胶形态。结果未出现分层现象。说明本发明的佛手柑内酯脂质体凝胶质地均匀。

6.温度稳定性

将凝胶密封于样品瓶中，分别于4℃、25℃、40℃条件下避光存放，并于第0天、第5天、第10天观察样品外观性状，并测定其药物含量。

表19佛手柑内酯脂质体凝胶温度稳定性考察

结果显示，凝胶外观性状和药物含量在低温和室温条件下基本不会发生变化，在高温条件下，外观形状和含量均有一定变化，提示凝胶应常温或低温保存。

7.光照稳定性

将凝胶密封于透明样品瓶中，于4500lx，25℃条件下存放，分别于第0天、第5天、第10天观察样品外观性状，并测定其药物含量。

表20佛手柑内酯脂质体凝胶光照稳定性考察

结果表明，凝胶样品在强光照射下，药物含量出现降低现象，且下降量超过5％，提示凝胶应该避光保存。

试验例6

取按实施例7方法制备的佛手柑内酯脂质体凝胶，进行体外释放考察。

分别量取含1.12mg药物的佛手柑内酯凝胶、佛手柑内酯脂质体凝胶于事先备好的透析袋中，并采用透析袋法按试验例2的步骤进行试验。结果如附图17所示。

结果表明，佛手柑内酯凝胶、佛手柑内酯脂质体和佛手柑内酯脂质体凝胶的体外释放实验结果如图17所示，佛手柑内酯凝胶12h的累积释放量达到47.09％，而佛手柑内酯脂质体凝胶12h的累积释放量达到54.48％，表明脂质体可以增加佛手柑内酯的溶解度。

最后应说明的是：以上各实施例仅仅为本发明的较优实施例用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，当然更不是限制本发明的专利范围；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；也就是说，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内；另外，将本发明的技术方案直接或间接的运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。