利用三维大脑细胞集合体为大脑相关疾病的诊断和药物筛查提供信息的方法

摘要

本发明利用由患者来源的细胞制备的三维大脑细胞集合体，对自闭症谱系障碍等大脑相关疾病进行诊断，提供了为大脑相关疾病提供信息的系统、为筛查大脑相关疾病的治疗物质提供信息的系统以及为筛查药物和选择患者定制药物提供相关信息的方法，可以早期诊断大脑相关疾病并选择适当的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用三维大脑细胞集合体(three-dimensional cerebral cellaggregates)提供大脑疾病相关信息的方法。更具体地，涉及从患者来源的细胞中制备三维大脑细胞集合体，并利用其进行大脑相关疾病的诊断和患者定制药物选择及筛查的方法。

背景技术

类器官是指利用干细胞的分化能力(differentiation)、自我再生能力(self-renewal)、自我组织能力(self-organization)，通过三维培养，再现与体内脏器相似的细胞组成及结构，是新的干细胞分化技术，通过模拟与体内脏器相似的环境，可用于多种疾病模拟的研究以及治疗药物筛查的研究。此外，通过制备患者定制类器官，可以低成本、短时间内制备针对多种疾病的患者定制治疗药物。

最近有报道称可以制备出反映多种脑部特点的脑类器官，利用脑类器官进行寨卡病毒(ZIKA virus)研究或利用患者来源的脑类器官进行疾病模拟及新药开发的研究正在积极进行中。

然而，为患者定制的类器官制备成本高、耗时长。如图1所示，制备实际患者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSCs)通常需要6到8周以上，其效率也很低，通常为0.02％左右。另外，制备类器官所需的时间根据各类器官的不同而不同，但大部分需要3到6个月以上。因此，对于年龄较大的患有退行性脑病的患者及其他急需药物治疗的患者来说，患者定制新药的研发在现实中存在一定难度。

此外，包括脑类器官在内的大多数类器官的制备都存在以下问题，这些都是类器官研究实用化或产业化所必须解决的问题：

首先，类器官的制备成本高，耗时长，且需要氧气和养分的供给，直到类器官内部分化和成熟。因此，在大多数情况下，使用震荡生物反应器(shaking bioreactor)在CO

第二，类器官个体间差异(batch variation)非常严重(图2)，因此，在利用类器官进行的疾病模拟研究和新药筛查研究中，可能会导致不正确的结果。

第三，类器官分化时会产生“异常分化(out-growth)”的异常组织，这是影响类器官质量和功能的严重问题(图2)。

第四，目前类器官内部没有血管，因此氧气和养分不能正常输送到类器官的核心，导致内部细胞死亡的“死核(dead core)”现象非常普遍，这会阻碍类器官的成熟，所以必须要解决(图2)。

第五，为了进行基于类器官的高速大量筛查(high throughput screening；HTS)的药物筛选(drug screening)或药物再定位(drug repositioning)研究，需要开发符合HTS格式(format)的类器官大量制备系统。此外，在HTS格式下，将类器官的制备和药物筛查一元化，可进行全周期one-step类器官生产和新药开发体系的开发，是今后构建类器官自动化生产的实用化基础所必须的部分。

自闭症障碍(Autism)或自闭症是一种交流困难，且以有限和反复的行为为特征的发育障碍。最近人们一直讨论自闭症的诊断标准与不完全满足的自闭症谱系障碍(Autismspectrum disorders，ASD)的区分，认为大多数自闭症在2-3岁的儿童时期就被发现，并在成长期表现出发育上的问题。患有自闭症的儿童，如果及早接受适当的治疗，症状可以好转或恢复正常生活。

在自闭症谱系障碍治疗方面，患者和医护人员面临的最大问题在于其成因的多样性。自闭症谱系障碍是由多种原因引起的，不同的致病性会有不同的根源性治疗方法，需要针对不同原因进行适当的药物选择及行为治疗。然而，到目前为止，还没有一种通用性的药物可以使自闭症谱系障碍的关键症状有所好转的报告。

因此，对于包括上述自闭症的自闭症谱系障碍，应进行早期诊断，并根据发生原因尽早采用适当的治疗方法。

发明内容

希望解决的问题：

为此，本发明确立了图3所示的大脑类器官在HTS平台上实现大脑类器官高速/批量制备的平台。通过上述平台，可以制备几乎没有个体间差异、异常分化的标准化大脑类器官，与传统的大脑类器官相比，具有显著提高的均质性和功能性。实现大脑类器官的高速和大量制备是可行的。

此外，本发明还发现上述制备的患者细胞来源大脑类器官在其形态和大小、增殖性神经前体细胞数量、早期分化神经细胞数量、以及兴奋性/抑制性神经细胞比例上与正常组相比有显著差异。因此，利用患者来源的大脑类器官，可以再现自闭症谱系障碍的主要病理学特征，发明自闭症谱系障碍等大脑相关疾病的诊断及药物筛查方法。

但是，本发明所要解决的问题不限于以上所述的问题，未述及的其他问题可以从下列记载中可为本领域普通技术人员明确理解。

解决问题的手段：

根据本发明的第一方面，提供了为大脑相关疾病提供信息的系统，包括以下元件：

a)培养元件，所述培养元件用于执行以下步骤：培养从患有或疑似患有大脑相关疾病的目标体和正常目标体中获得的细胞，制备三维大脑细胞集合体；和

b)检测元件，所述检测元件用于执行以下i)至iii)步骤中的至少一个步骤：

i)测定患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体的大小；

ii)测定患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；和

iii)测定患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中的兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量。

根据本发明实施例，所述为大脑相关疾病提供信息的系统还包括c)分析元件，所述分析元件用于执行以下i)至iii)步骤中的至少一个步骤：

i)比较患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体的大小；

ii)比较患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；和

iii)比较患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中的兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量；

其中，所述步骤i)包括比较存在于患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的每个三维大脑细胞集合体内的脑室区大小，所述脑室区大小的比较包括比较其直径、面积、周长，以及体积中的一项或多项。

所述步骤iii)包括计算患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中兴奋性神经细胞与抑制性神经细胞的比例。

根据本发明实施例，所述分析元件还用于执行以下步骤：当患有或疑似患有所述疾病的目标体的三维大脑细胞集合体的脑室区大小显著大于或小于正常目标体时，输出结果：患有或疑似患有所述疾病的目标体患有大脑相关疾病。

根据本发明实施例，所述分析元件还用于执行以下步骤：当患有或疑似患有所述疾病的目标体的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞的数量或早期分化神经细胞的数量显著多于或少于正常目标体时，输出结果：患有或疑似患有所述疾病的目标体患有大脑相关疾病。

根据本发明实施例，所述分析元件还用于执行以下步骤：当患有或疑似患有所述疾病的目标体的三维大脑细胞集合体中的兴奋性神经细胞与抑制性神经细胞的比例显著高于或低于正常目标体时，输出结果：患有或疑似患有所述疾病的目标体患有大脑相关疾病。

根据本发明一些实施例，所述大脑相关疾病包括神经前体细胞增殖异常、早期神经分化异常、兴奋性抑制失衡中的一种或多种。根据本发明另一些实施例，所述大脑相关疾病包括大头症、小头症、自闭症、雷特氏症、儿童崩解症、阿斯伯格综合征、强迫症、强迫障碍、特定失能的全面性发育障碍、自闭症谱系障碍、双向情感障碍和躁狂症中的一种或多种。

根据本发明的第二方面，提供了为筛查大脑相关疾病的治疗物质提供信息的系统，包括以下元件：

a)培养元件，所述培养元件用于执行以下步骤：培养从患有大脑相关疾病的目标体中获得的细胞，制备三维大脑细胞集合体；将候选物质接触部分所述三维大脑细胞集合体；和

b)检测元件，所述检测元件用于执行以下i)至iii)步骤中的至少一个步骤：

i)测定接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体的大小；

ii)测定接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；和

iii)测定接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体中的兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量。

根据本发明实施例，所述为筛查大脑相关疾病的治疗物质提供信息的系统还包括c)分析元件，所述分析元件用于执行以下i)至iii)步骤中的至少一个步骤：

i)比较接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体的大小；

ii)比较接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；和

iii)比较接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体中的兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量。

根据本发明实施例，所述分析元件还用于执行以下步骤：当接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体的大小显著大于或小于未接触所述候选物质时，输出结果：所述候选物质为大脑相关疾病的治疗物质。

根据本发明实施例，所述分析元件还用于执行以下步骤：当接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体的神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量显著多于或少于未接触所述候选物质时，输出结果：所述候选物质为大脑相关疾病的治疗物质。

根据本发明实施例，所述分析元件还用于执行以下步骤：当接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体中兴奋性神经细胞或抑制性神经细胞的数量显著多于或少于未接触所述候选物质时，输出结果：所述候选物质为大脑相关疾病的治疗物质。

根据本发明实施例，所述候选物质可以包括但不限于以下一种或多种：胰岛素样生长因子1(IGF-1)、加巴喷丁(Gabapentin)、(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)、氨己烯酸(Vigabatrin)、盐酸噻加宾(Tiagabine hydrochloride)、加奈索酮(Ganaxolone)和瑞替加滨(Retigabine)，优选IGF-1和加巴喷丁。

根据本发明的第三方面，提供了为大脑相关疾病提供信息的方法，其包括以下步骤：a)培养从患有或疑似患有疾病的目标体(subject)和正常目标体中获得的细胞，制备三维大脑细胞集合体；和b)提供诊断大脑相关疾病的信息；其中，b)步骤包括以下i)至iii)步骤中的至少一个步骤：

i)比较患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体的大小；

ii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；和

iii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量。

据上介绍，在i)步骤中，上述大小的比较可以是通过测量存在于每个三维大脑细胞集合体内的脑室区(ventricular zone)的直径、面积、周长和体积中的一项或多项而实现，该脑室区存在于患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体内。

据上介绍，如果患有或疑似患有上述疾病的目标体的三维大脑细胞集合体的脑室区大小显著大于或小于正常目标体时，则可以包括判定为大脑相关疾病的步骤。

据上介绍，在ii)步骤中，如果患有或疑似患有上述疾病的目标体的三维大脑细胞集合体的脑室区内的增殖性神经前体细胞的数量或早期分化神经细胞的数量显著多于或少于正常目标体时，则可以包括判定为大脑相关疾病的步骤。

据上介绍，在iii)步骤中，如果患有或疑似患有上述疾病的目标体的三维大脑细胞集合体中的兴奋性神经细胞与抑制性神经细胞的比例显著高于或低于正常目标体时，则可以包括判定为大脑相关疾病的步骤。

据上介绍，大脑相关疾病包括神经前体细胞增殖异常、早期神经分化异常、兴奋性抑制失衡中的一种或多种。

据上介绍，大脑相关疾病可以包括以下一种或多种：大头症、小头症、自闭症、雷特氏症、儿童崩解症、阿斯伯格综合征、强迫症、强迫障碍、特定失能的全面性发育障碍、自闭症谱系障碍、双向情感障碍和躁狂症等。

根据本发明的第四方面，提供了为筛查治疗大脑相关疾病的定制药物提供信息的方法，包括以下步骤：

a)培养从患有或疑似患有大脑相关疾病的目标体和正常目标体中获得的细胞，制备三维大脑细胞集合体；

b)利用所述三维大脑细胞集合体确认目标体是否患有或疑似患有大脑相关疾病；和

c)包括向确定患有大脑相关疾病的目标体提供用于治疗大脑相关疾病的药物信息与候选物质筛查方法的步骤，所述步骤包括将候选物质接触到患有大脑相关疾病目标体的任何一个三维大脑细胞集合体；

其中，所述c)步骤包括以下i)至iii)步骤中的至少一个步骤：

i)测定和比较接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体的大小；

ii)测定和比较接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；和

iii)测定和比较接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体中的兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量。

根据本发明具体实施例，为确认大脑相关疾病，上述b)步骤包括以下i)至iii)步骤中的至少一个步骤：

i)比较患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体的大小；

ii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；

iii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量；

据上介绍，上述提供用于治疗大脑相关疾病的候选物质筛查方法包括：在执行b)步骤中的i)步骤后，d)在上述c)步骤后，测量接触上述候选物质的三维大脑细胞集合体的大小，并比较未接触上述候选物质的任何一个三维大脑细胞集合体的大小；e)在上述d)步骤后，如果经上述候选物质处理的三维大脑细胞集合体的大小明显大于或小于未经候选物质处理的三维大脑细胞集合体的大小，则将上述候选物质筛选为大脑相关疾病的治疗物质。

据上介绍，上述提供用于治疗大脑相关疾病的候选物质筛查方法包括：在执行b)步骤中的ii)步骤后，d)在上述c)步骤后，测量接触上述候选物质的三维大脑细胞集合体的神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量，并比较未接触上述候选物质的任何一个三维大脑细胞集合体的神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；e)在上述d)步骤后，如果经上述候选物质处理的三维大脑细胞集合体的神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量显著多于或少于未经候选物质处理的三维大脑细胞集合体的神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量，则将上述候选物质筛选为大脑相关疾病的治疗物质。

据上介绍，上述提供用于治疗大脑相关疾病的候选物质筛查方法包括：在执行b)步骤中的iii)步骤后，d)在上述c)步骤后，测量接触上述候选物质的三维大脑细胞集合体的兴奋性神经细胞或抑制性神经细胞的数量，并比较未接触上述候选物质的任何一个三维大脑细胞集合体的兴奋性神经细胞或抑制性神经细胞的数量；e)在上述d)步骤后，如果经上述候选物质处理的三维大脑细胞集合体中兴奋性神经细胞或抑制性神经细胞的数量显著多于或少于未经候选物质处理的三维大脑细胞集合体的兴奋性神经细胞或抑制性神经细胞的数量，则将上述候选物质筛选为大脑相关疾病的治疗物质。

据上介绍，候选物质可以包括但不限于以下一种或多种：胰岛素样生长因子1(IGF-1)、加巴喷丁、(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯、氨己烯酸、盐酸噻加宾、加奈索酮和瑞替加滨，优选IGF-1和加巴喷丁。

据上介绍，大脑相关疾病包括以下一种或多种：神经前体细胞增殖异常、早期神经分化异常、兴奋性抑制失衡、大头症、小头症、自闭症、雷特氏症(Rett综合症)、儿童崩解症、阿斯伯格综合征、强迫症、强迫障碍、特定失能的全面性发育障碍、自闭症谱系障碍、双向情感障碍和躁狂症。

根据本发明的第五方面，提供了治疗物质，其为由本发明第二方面所述的系统或第四方面所述的方法筛查得到的大脑相关疾病的治疗物质。

根据本发明的第六方面，提供了药物组合物，且该组合物包括由本发明第二方面所述的系统或第四方面所述的方法筛查得到的大脑相关疾病的治疗物质，所述治疗物质作为其中的有效成分。

发明的效果：

本发明是利用由患者来源的细胞制备的大脑类器官，对大脑相关疾病进行早期诊断，以及筛查药物的方法。由此，可以在早期以高准确率诊断自闭症谱系障碍等大脑相关疾病，为患者选择量身定制的药物。因此，早期诊断和根据各种病因制定适当的治疗策略对自闭症谱系障碍等大脑相关疾病的治疗非常有用。

本发明的效果不限于上述效果，应理解为包括从本发明详细说明或权利要求范围记载的发明构成中进一步推断的所有效果。

附图说明

图1是为患者制备量身定制型类器官的模式图，包括诱导多能干细胞(InducedPluripotent Stem Cells，iPSCs)的制备以及类器官的分化过程。

图2是过往类器官制备中各种问题的模式图。

图3是表示与过往技术相比较的本发明类器官制备策略的模式图。

图4是基于大脑类器官的自闭症谱系障碍体外疾病建模及药物筛查与定义的模式图；图4中，ASD：自闭症谱系障碍(Autism spectrum disorders)。

图5是正常人及自闭症谱系障碍患者来源的诱导多能干细胞的制备和分化能力确认。

图6是正常人及自闭症谱系障碍患者来源的诱导多能干细胞(iPSC)的特征分析结果。

图7显示了在自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官中大头症症状的重现。

图8研究了正常人及自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官的早期神经分化情况。

图9显示了自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官的兴奋性抑制失衡的症状。

图10为对照组和患者组来源的大脑类器官经抑制性促神经分化药物处理的结果。

图11显示了缓解兴奋性抑制失衡的药物对神经分化及兴奋性神经分化的影响。

图12显示了在高速/大量制备的大脑类器官中大头症症状的重现。

图13是基于高速/大量制备的大脑类器官的兴奋性抑制失衡症状重现和药物效应的验证图。

具体实施方式

以下参照附图详细说明实施例。每个附图中给出的相同参照符号表示相同的构件。

下述实施例可以进行各种变更。以下说明的实施例不是对实施形式的限定，对它们的任何改变，均应理解为包括等同物或替代物。

在实施例中使用的术语仅用于说明目的，不能被解释为限定的意图。单数的表达除非在文中有明显不同含义，均可以理解为包括单数与复数的含义。在本说明书术语中“包括”或“拥有”应理解为是指定说明书上标记的特征、数字、步骤、操作、组件、部件或它们的组合的存在，而不是预先排除一个或多个其他特征或数字、步骤、操作、组件、部件或它们的组合的存在或附加的可能性。

除非定义不同，在这里使用的所有术语，包括技术性或科学性术语，都与在实施例所属的技术领域中，拥有通常知识的人通常理解的意义相同。通常使用的如事先定义的术语，在相关技术中应被解释为具有一致的意义，除非在本文中明确定义，否则不会被理想或过度地解释为形式意义。

以下，参照附图详细说明实施例。但是，可以对实施例进行各种修改，因此专利申请的权利范围不受这些实施例的限制或限定。对实施例的所有修改、均等的替代物应被理解为包括在权利范围内。

此外，在参照附图进行说明时，无论图形符号如何，相同的组件都将赋予相同的参照符号，并省略重复的说明。在说明实施例时，如果认为对相关技术的具体说明会不必要地模糊实施例的摘要，则省略其详细说明。

本发明是利用由患者来源的细胞制备的大脑类器官，对大脑相关疾病进行早期诊断，以及筛查药物的方法。由此，可以在早期以高准确率诊断自闭症谱系障碍等大脑相关疾病，为患者选择量身定制的药物。因此，早期诊断和根据各种病因制定适当的治疗策略对自闭症谱系障碍等大脑相关疾病的治疗非常有用。此外，本发明利用大脑类器官的高速和大量制备方法以及由此制备的大脑类器官，快速、准确地诊断大脑相关疾病，实现患者个性化药物的提供，并高效地实现大脑相关疾病的药物筛查。以下是本发明的更详细说明。

根据本发明的实施例，提供了为大脑相关疾病提供信息的系统，包括以下元件：a)培养元件，所述培养元件用于执行以下步骤：培养从患有或疑似患有大脑相关疾病的目标体和正常目标体中获得的细胞，制备三维大脑细胞集合体；b)检测元件，所述检测元件用于执行以下测定步骤：测定患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体的大小，增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量，以及兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量；和c)分析元件，所述分析元件用于执行以下比较步骤：比较患有或疑似患有所述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体的大小，增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量，以及兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量；其中分析元件还可以计算兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的比值。

根据本发明的具体实施例，可以利用本领域普通技术人员已知的培养元件对细胞进行培养。在一些实施例中，可以采用培养皿、微孔板、培养箱等对细胞进行培养，微孔板例如可以选用96孔板、384孔板等。

根据本发明的具体实施例，测定所述三维大脑细胞集合体的大小可以通过测定每个三维大脑细胞集合体内的脑室区的直径、面积、周长以及体积中的一项或多项来确定。可以利用本领域普通技术人员已知的自动化技术来测定上述项目。在一些实施例中，可以采用带有成像分析软件的自动化活细胞培养与观察工作站，例如可以采用蔼可芯昂生物仪器(上海)有限公司的CytoSMART Omni箱内明场/荧光多孔板活细胞工作站。

根据本发明的具体实施例，可以利用本领域普通技术人员已知的自动化技术来测定各类细胞的数量。在一些实施例中，可以采用带有成像分析软件的自动化明场或荧光细胞计数观测站，例如可以采用蔼可芯昂生物仪器(上海)有限公司的CytoSMART Exact FL自动细胞计数平台。

根据本发明的实施例，提供了为筛查大脑相关疾病的治疗物质提供信息的系统，包括以下元件：a)培养元件，所述培养元件用于执行以下步骤：培养从患有大脑相关疾病的目标体中获得的细胞，制备三维大脑细胞集合体；将候选物质接触部分所述三维大脑细胞集合体；b)检测元件，所述检测元件用于执行以下测定步骤：测定接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体的大小，增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量，以及兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量；和c)分析元件，所述分析元件用于执行以下比较步骤：比较接触所述候选物质和未接触所述候选物质的三维大脑细胞集合体的大小，增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量，以及兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量。

根据本发明的实施例，提供了为大脑相关疾病提供信息的方法，包括以下步骤：a)培养从患有或疑似患有疾病的目标体(subject)和正常目标体中获得的细胞，制备三维大脑细胞集合体；和b)提供诊断大脑相关疾病的信息，包括：i)比较患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体的大小；ii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞和早期分化神经细胞的数量；和iii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量。

从疑似患有上述疾病的目标体及正常目标体中获取的细胞可以是红细胞，但不限于此，任何能产生诱导多能干细胞的体细胞都可以利用。

本文中的术语“干细胞”是指具有自我复制能力并能分化成两个或两个以上细胞的细胞。干细胞可分为多能干细胞(totipotent stem cell)、全分化能干细胞(pluripotent stem cell)、多分化能干细胞(multipotent stem cell)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSCs)。

在本发明中，三维细胞集合体可以是类器官，例如，可以是脑类器官，优选是大脑类器官。

本文中的术语“类器官”是指用三维(3D)培养方法将从干细胞或器官起源细胞中分离出的细胞重新凝聚或重组而成的细胞集合体，可以包括由悬浮细胞培养物形成的类器官或细胞簇。上述类器官也可以被命名为小型类似器官、器官类似体和类似器官。上述类器官具体包括构成器官或组织的多种细胞中的一种或多种细胞，可以再现组织或器官的结构和功能。在本文中，术语“类器官”和“三维细胞集合体”具有相同的含义，可以选择使用。

这种三维大脑细胞集合体的制备不受特定方法的限制，并且可以使用业界已知的任何干细胞来源的类器官细胞集合体的制备方法，但优选根据以下方法制备。

一种可取的三维大脑细胞集合体的制备方法，包括以下步骤：从人类分离的细胞制备诱导多能干细胞；用解离为单细胞的诱导多能干细胞形成拟胚体(Embryoid body)；从上述拟胚体诱导分化到特定组织，形成三维细胞集合体；以及诱导所述三维细胞集合体成熟；从形成所述拟胚体到所述三维细胞集合体成熟的步骤，可以通过形成所述三维细胞集合体的方法来实现，其特征是在同一微孔板上连续培养。

据上介绍，在i)步骤中，上述大小的比较可以是通过测量存在于每个三维大脑细胞集合体内的脑室区(ventricular zone)的直径、面积、周长或体积中的一项或多项而实现。

上述脑室区是神经干细胞存在的区域，增殖性神经干细胞的数量及相应的脑室区大小与大头症/小头症的病理症状有关。本发明证实了自闭症谱系障碍患者人群来源的大脑类器官中的脑室区大小较正常人群来源的增大。即证实了自闭症谱系障碍的主要病变之一大头症在自闭症谱系障碍患者人群来源的大脑类器官中重现。

据上介绍，如果患有或疑似患有上述疾病的目标体的三维大脑细胞集合体的脑室区的大小显著大于或小于正常目标体时，则可以包括判定为大脑相关疾病的步骤。

据上介绍，在ii)步骤中，如果患有或疑似患有上述疾病的目标体的三维大脑细胞集合体的脑室区内的增殖性神经前体细胞的数量或早期分化神经细胞的数量显著多于或少于正常目标体时，则可以包括判定为大脑相关疾病的步骤。

上述神经前体细胞是能够自我再造并具有分化成神经系统细胞能力的细胞，可分化成神经细胞、星状胶质细胞、少突胶质细胞等。

据上介绍，在iii)步骤中，如果患有或疑似患有上述疾病的目标体的三维大脑细胞集合体中的兴奋性神经细胞与抑制性神经细胞的比例显著高于或低于正常目标体时，则可以进一步包括判定为大脑相关疾病的步骤。

上述兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的比值据报告与自闭症谱系障碍密切相关，本发明证实了自闭症谱系障碍患者人群来源的大脑类器官中兴奋性/抑制性神经细胞比值的有意义变化。特别是，如以下实施例所示，自闭症谱系障碍患者来源大脑中的抑制性神经细胞数量显著减少，证实了自闭症谱系障碍的主要病变之一的兴奋性抑制失衡的重现。

据上介绍，大脑相关疾病包括以下一种或多种：神经前体细胞增殖异常、早期神经分化异常、兴奋性抑制失衡，非限制性的例子包括大头症、小头症、自闭症、雷特氏症、儿童崩解症、阿斯伯格综合征、强迫症、强迫障碍、特定失能的全面性发育障碍、自闭症谱系障碍、双向情感障碍和躁狂症等。本发明中的大脑相关疾病优选为大头症、小头症、自闭症、雷特氏症和自闭症谱系障碍。

根据本发明的另一实施例，提供了为筛查治疗大脑相关疾病的定制药物提供信息的方法，即为筛查大脑相关疾病目标体的定制药物提供信息的方法，其包括以下步骤：a)培养从患有或疑似患有大脑相关疾病的目标体和正常目标体中获得的细胞，制备三维大脑细胞集合体；b)利用上述三维大脑细胞集合体确认是否患有或疑似患有大脑相关疾病；和c)包括向确定患有大脑相关疾病的目标体提供大脑相关疾病药物信息与候选物质筛查的步骤，所述步骤包括将候选物质接触到患有大脑相关疾病目标体的任何一个三维大脑细胞集合体；其中，为确认大脑相关疾病，上述b)步骤包括以下i)至iii)步骤中的至少一个步骤：——i)比较患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体的大小；ii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；iii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量；

上述所谓目标体定制药物，可能是通过从目标体来源细胞中制备的三维大脑细胞集合体选择最适合目标体的药物而获得的，优选通过将药物直接接触到上述三维大脑细胞集合体，测量细胞集合体中脑室区的大小、增殖性神经前体细胞的数量、早期分化神经细胞的数量以及兴奋性/抑制性神经细胞的比例中的任何一项或多项进行选择。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗大脑相关疾病的候选物质筛查方法，包括以下步骤：a)培养从患有或疑似患有大脑相关疾病的目标体和正常目标体中获得的细胞，制备三维大脑细胞集合体；b)利用上述三维大脑细胞集合体确认目标体是否患有或疑似患有大脑相关疾病；和c)将候选物质接触到患有大脑相关疾病目标体的任何一个三维大脑细胞集合体；所述b)步骤提供了一种确认大脑相关疾病的方法，包括以下i)至iii)步骤中的至少一个步骤：

i)比较患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体的大小；

ii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中的增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；

iii)测定患有或疑似患有上述疾病的目标体和正常目标体的三维大脑细胞集合体中兴奋性神经细胞和抑制性神经细胞的数量。

另一方面，上述筛查方法可以将a)步骤三维大脑细胞集合体的来源作为确诊为患有大脑相关疾病患者的目标体，该筛查方法作为为上述目标体定制药物的选择提供信息的方法。

据上介绍，上述提供用于治疗大脑相关疾病的候选物质筛查方法包括：在执行b)步骤中的i)步骤后，d)在上述c)步骤后，测量接触上述候选物质的三维大脑细胞集合体的大小，并比较未接触上述候选物质的任何一个三维大脑细胞集合体的大小；e)在上述d)步骤后，如果经上述候选物质处理的三维大脑细胞集合体的大小明显大于或小于未经候选物质处理的三维大脑细胞集合体的大小，则将上述候选物质筛选为大脑相关疾病的治疗物质。

据上介绍，上述提供用于治疗大脑相关疾病的候选物质筛查方法包括：在执行b)步骤中的ii)步骤后，d)在上述c)步骤后，测量接触上述候选物质的三维大脑细胞集合体的神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量，并比较未接触上述候选物质的任何一个三维大脑细胞集合体的神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量；e)在上述d)步骤后，如果经上述候选物质处理的三维大脑细胞集合体的神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量显著多于或少于未经候选物质处理的三维大脑细胞集合体的神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量，则将上述候选物质筛选为大脑相关疾病的治疗物质。

据上介绍，上述提供用于治疗大脑相关疾病的候选物质筛查方法包括：在执行b)步骤中的iii)步骤后，d)在上述c)步骤后，测量接触上述候选物质的三维大脑细胞集合体的兴奋性神经细胞或抑制性神经细胞的数量，并比较未接触上述候选物质的任何一个三维大脑细胞集合体的兴奋性神经细胞或抑制性神经细胞的数量；e)在上述d)步骤后，如果经上述候选物质处理的三维大脑细胞集合体中兴奋性神经细胞或抑制性神经细胞的数量显著多于或少于未经候选物质处理的三维大脑细胞集合体的兴奋性神经细胞或抑制性神经细胞的数量，则将上述候选物质筛选为大脑相关疾病的治疗物质。

上述治疗大脑相关疾病候选物质的筛查可利用上述三维大脑细胞集合体进行，优选地，将上述候选物质直接接触到上述三维大脑细胞集合体，将候选物质处理前后进行比较或将候选物质处理组与非处理组进行比较，所述比较包括以下一项或多项：细胞集合体中脑室区的大小；增殖性神经前体细胞或早期分化神经细胞的数量以及兴奋性/抑制性神经细胞的比例。

该接触可以为使药物作用于构成三维大脑细胞集合体的细胞，例如注射、添加等，但不局限于具体的接触方法，优选为直接添加到三维大脑细胞集合体的培养基中。

据上介绍，上述候选物质可以包括但不限于以下一种或多种：胰岛素样生长因子1(IGF-1)、加巴喷丁、(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯、氨己烯酸、盐酸噻加宾、加奈索酮和瑞替加滨，优选IGF-1或加巴喷丁。

据上介绍，大脑相关疾病包括以下一种或多种：神经前体细胞增殖异常、早期神经分化异常、兴奋性抑制失衡、大头症、小头症、自闭症、雷特氏症、儿童崩解症、阿斯伯格综合征、强迫症、强迫障碍、特定失能的全面性发育障碍、自闭症谱系障碍、双向情感障碍和躁狂症。

根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，且该组合物包括由上述治疗大脑相关疾病的候选物质筛查方法筛选的治疗大脑相关疾病的物质，所述治疗物质作为其中的有效成分。

以下通过实施例更详细地说明本发明。下列实施例是为演示本发明而描述的，本发明的范围并不局限于此。

在整个清单中，“％”用于表示特定物质的浓度。除非另有说明，固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，以及液体/液体为(体积/体积)％。

实施例1.从目标体中获取诱导多能干细胞和其特性验证

利用大脑类器官分化技术对自闭症谱系障碍进行体外建模，并进行治疗自闭症谱系障碍的药物筛查，如图4所示，从正常人和自闭症谱系障碍患者中获取诱导多能干细胞，将其形成大脑类器官，进行疾病建模/药物筛查试验(图4)。

为此，从自闭症谱系障碍患者和其父母的血液细胞中分离出红血球母细胞(erythroblast)，采用慢病毒(Lentivirus)导入OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC重编程因子，制备诱导多能干细胞。制备的正常人和患者来源的诱导多能干细胞与胚胎干细胞，证实了其具有干细胞特有的形态，确定其基因表达情况(免疫组化实验)与体外可分化能力，且将其移植到免疫缺陷小鼠中，通过证实畸胎瘤的形成，从而证实其具有全能性(图5)。

正常人和患者来源的诱导多能干细胞全部表达了胚胎干细胞特异性标记基因，OCT4基因启动子部分的DNA甲基化情况的研究结果与胚胎干细胞的情况相同，证实了在表观遗传学(epigenetic)水平上的重编程是正确的，进而确认其具有正常核型(图6)。

实施例2.类器官的制备和确认病理现象的重现

实施例2-1：类器官的制备

(第0天)用解离的单细胞状态的诱导多能干细胞在包含COB1(脑类器官基础培养基1)(添加了50μM Y-27632(ROCK抑制剂)和4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))的超低吸附u形底96孔(well)板上进行脑类器官的制备。COB1：DMEM/F12混合物，其中包含20％血清替代物(KSR)，1％ P/S(青霉素/链霉素，penicillin/streptomycin)，1％谷氨酰胺(glutamax)，55μMβ-巯基乙醇，3％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1μg/mL肝素。

(第1至7天)拟胚体(Embryoid body；EB)的形成，COB1中加入2μM二氢脱氧吗啡(dorsomorphin)、2μM A83-01、2.5μM WNT信号转导体系抑制剂IWP2。此时处理时间限定为第1天(day 1)、第3天(day 3)、第5天(day 5)，每孔更换100μL培养液。从第4天开始，可选择性地用100nM sonic hedgehog agonist(SAG)处理1、2或者3天。

(第7至15天)神经上皮扩增：隔天更换100μL/孔包含20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF的COB1培养基，同时添加1％生长因子抑制的溶解性基质胶(Growth factor reducedmatrigel)，直接添加到COB1培养基中。

(第15天)神经分化及成熟：隔天更换100μL/孔COB2(脑类器官基础培养基2)，加入10ng/mL脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor；BDNF)、10ng/mL胶质细胞神经生长因子(Glial cell line derived neurotrophic factor；GDNF)、200μM维生素C和125μM cAMP。同时添加1％生长因子抑制的溶解性基质胶(Growth factor reducedmatrigel)，直接添加到COB2培养基中。COB2：DMEM/F12和Neurobasal Medium(神经细胞培养基)的1：1混合物，其中包含N2 supplement(神经细胞培养血清替代品)100×、2％ B27w/o维生素A、1％ P/S、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸(NEAA)、55μMβ-巯基乙醇和1μg/mL肝素。

实施例2-2：确认在自闭症谱系障碍患者来源的类器官中大头症的重现

分化第15天左右，与正常人相比，患者来源的大脑类器官神经干细胞存在的脑室区(ventricular zone，VZ)异常地变长变大(图7)。通过免疫组织染色比较VZ内存在的增殖性神经前体细胞的数量，发现患者来源的大脑类器官中其数量显著增加，这也解释了自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官大小增加的原因(图7)。自闭症谱系障碍患者有时会发现大头症或小头症症状，因此，上述结果证实了利用大脑类器官技术可以重现自闭症谱系障碍病变之一的大头症症状。

实施例2-3：自闭症谱系障碍患者来源的类器官的早期神经分化表现

分化第15天，研究正常人及自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官的早期神经分化情况；为此，对TUJ1(神经元类型IIIβ-微管蛋白)阳性的细胞进行了确认，结果发现正常人来源的大脑类器官中有多个TUJ1阳性的神经细胞，而自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官中的数量显著地减少(图8)。利用RNA测序(RNA sequencing，RNAseq)技术研究了正常人和自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官的基因表达，结果确认神经分化及脑发育相关的基因在正常人来源的大脑类器官中的表达较高(图8)。上述结果表明自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官中的早期神经分化异常。

实施例2-4：确认兴奋性抑制失衡的重现

兴奋性抑制失衡是以自闭症谱系障碍为首的双向情感障碍、躁狂症等的核心机制，是传统二维(2D)分化技术难以再现的自闭症谱系障碍的核心病理改变之一。因此，为了验证兴奋性抑制失衡(即自闭症谱系障碍的核心机理)在患者来源的大脑类器官中是否可以重现，研究了正常人和患者来源的大脑类器官中TBR1/TBR2阳性的兴奋性神经和GABA阳性的抑制性神经的分化情况。结果表明，TBR1/TBR2阳性的兴奋性神经数量在正常人和自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官中没有差异，而GABA阳性的抑制性神经在正常人中发现的数量较多，而在患者中却以很少的数量存在(图9)。这表明了自闭症谱系障碍的核心病变之一兴奋性抑制失衡在患者来源的大脑类器官中可以适当地重现。

实施例3.兴奋性抑制失衡药物筛选实验

在本发明中，由于自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官中抑制性神经数量显著减少，导致兴奋性抑制失衡，因此，作为药物筛查试验的一部分，为了缓解自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官中重现的兴奋性抑制失衡症状，用可促进抑制性神经分化的GABA激动剂(GABA agonist)：加巴喷丁(Gabapentin；GBP)、加奈索酮(Ganaxolone；GNZL)、氨己烯酸(Vigabatrin；VGBT)、盐酸噻加宾(Tiagabine hydrochloride；TGB)和瑞替加滨(Retigabine；RTGB)进行处理。同时也验证了自闭症和雷特氏症的治疗剂胰岛素样生长因子1(IGF-1)的效果。为此，从分化第35至45天对大脑类器官用候选物质进行了10天的处理，并用免疫组织染色技术观察了抑制性神经的分化情况。结果表明，经候选物质(药物)处理后，抑制性神经数量与非处理组相比显著增加，尤其IGF-1和Gabapentin的效果最佳(图10)。上述结果表明，运用大脑类器官技术可以重现自闭症谱系障碍的核心病理变化——兴奋性抑制失衡，并将其用于药物筛查，且雷特氏症候选药物IGF-1和抗癫痫药物Gabapentin的疗效最佳。

为了确认本发明所筛选的药物效果对促进抑制性神经分化是特异性的，对其他神经分化没有影响，在药物处理的大脑类器官中确认了一般神经细胞的标记MAP2和兴奋性神经的标记vGLUT1。结果显示，药物处理后的大脑类器官中MAP2及vGLUT1阳性细胞数量与非处理组无差异(图11)。这意味着候选物质(药物)的效果对抑制性神经是特异性的。

实施例4.大脑类器官的高速、大量制备方法的应用和重现性确认

本研究团队在先行专利(WO2022/005023A1)中开发了连续非震荡的用于大脑类器官的高速、大量制备技术。上述先行专利提供了在96或384微孔板上非震荡连续培养，最初细胞数控制在100至3000个，至少30天内形成类器官的高速、大量制备方法。

对于今后的大量药物筛查，以下条件是必须的：1)开发出可以大量制备患者来源的大脑类器官的技术；2)通过开发标准化分化技术，制备具有一定质量，个体间的差异小的大脑类器官；3)能够再现疾病核心病变；4)开发可一次性完成大脑类器官制备、疾病再现、药物筛查的一元化全周期类器官制备和药物筛查平台。为此，通过本研究团队先行专利中开发的大脑类器官的连续非震荡培养，制备了正常人及自闭症谱系障碍患者来源的大脑类器官。在分化第7天比较正常人和患者来源的大脑类器官的形态及大小，其结果如图7所示，高速、大量制备的患者来源的大脑类器官可以重现比正常人来源的大脑类器官更大的情况，即大头症症状(图12)。

分化第15天，也出现了类似的表现，即患者来源的大脑类器官的大头症症状(图10)。以过往技术方法制备的患者来源的大脑类器官为例，从15日左右就可以明显地观察到大头症症状，因此上述结果(图11、12)证实通过本发明开发的大脑类器官高速、大量制备方法可以在早期重现大头症症状。

此外，为了确定患者来源的大脑类器官的兴奋性抑制失衡症状是否在高速、大量制备的大脑类器官中重现，利用图9中确定的现有技术，采用连续非震荡方法制备正常人及患者来源的大脑类器官。在分化第45天，vGlut阳性的兴奋性神经和GABA阳性的抑制性神经分化的研究结果显示，与先行结果(即用传统技术制备的大脑类器官)相似，患者来源的大脑类器官中GABA阳性的抑制性神经的数量显著减少(图13)。进而使用图10中证实具有效果的IGF1和Gabapentin处理时，GABA阳性的神经数量显著增加，恢复到与正常人来源的大脑类器官相似的水平(图13)。结果表明高速、大量制备的大脑类器官，可以充分重现自闭症谱系障碍的核心病变，在评价药物的功效时，可以显示与现有技术制备的大脑类器官相似的结果，因此适合作为今后用于大量药物筛查的模型。

如上所述，虽然实施例由有限的附图说明，但如果是在该技术领域具有通常知识的人员，可以在上述基础上应用各种技术修改和变形。例如，所述技术与所述方法以不同的顺序执行，以及所述系统、结构、设备、线路等要素以与所述方法不同的形式结合或组合，或由其他组件或物品替换或置换，也可以获得适当的结果。

因此，其他实施例以及与专利申请范围均等的内容也属于权利要求的请求范围。