一种适制六堡茶山槛紫原种种苗的组织培养方法

摘要

本发明公开了适制六堡茶山槛紫原种种苗的组织培养方法，包括无菌播种、愈伤组织诱导培养、芽分化培养、丛生芽诱导培养、增殖培养、生根培养及炼苗；所述愈伤组织诱导培养为将子叶和胚轴接入愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养30～35d；愈伤组织诱导培养基为MS+6‑BA0.1～0.8mg/L+2,4‑D0.1～0.8mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂5.0～5.8g/L，pH为6.8～7.0。本发明六堡茶山槛紫组培苗叶片肥厚，幼叶紫色，茎干粗大，变异率低，增殖系数达6‑7倍，炼苗成活率达到90％以上，适用于提供六堡茶种植的种苗。无性繁育，保持山槛紫亲本优良特质，成本低，污染小，四季可生产，适合大规模无性育苗。

说明书

技术领域

本发明属于植物繁殖技术领域，尤其涉及一种适制六堡茶山槛紫原种种苗的组织培养方法。

背景技术

六堡茶(Camellia nitidissima cv.Liubaocha)山茶科山茶属常绿灌木或小乔木，叶呈长椭圆披针形，叶色褐黑光润，间有黄花点，叶底红褐。六堡茶素以"红、浓、陈、醇"四绝著称，其条索长整紧结，汤色红浓，香气陈厚，滋味甘醇可口；原产于我国广西梧州的六堡镇及其周边地区，是中国黑茶代表之一，是国家地理标志产品，其传统制作工艺已列入国家非物质文化遗产名录，六堡茶船古道是新海上丝绸之路文化，是广西特色优势产业。《苍梧县志》(清康熙三十六年即1697年版)记载：“茶产多贤乡六堡，味醇隔宿而不变，茶色香味俱佳”，清嘉庆年间，六堡茶以一定的保健功效而享誉海内外，六堡茶中发酵工艺上可归类于后发酵茶，因其原产于广西梧州市苍梧县六堡镇而得名，以“红、浓、陈、醇”的品质特征为世人称道。其生产历史可追溯到1500年前，主要含74种和80种挥发性香气组分等成分，其中Zn、Cu、Sr、Ni、Se含量较高，我国传统食疗中利用六堡茶药食同源产品。

目前国内市场上六堡茶原料90％以上来自广西，它以六堡镇为核心产区。因此，采用人工繁殖育苗的方法对保护野生六堡茶资源和满足规模化生产的需要显得十分必要。六堡茶树浑身是宝，除了六堡茶的根茎叶药用价值外，六堡茶还是石山区和荒地治理及林业生产的经济价值极高的树种。然而，六堡茶育苗是抑制六堡茶产业的瓶颈，因六堡茶属扦插较难生根树种之一，普通扦插较难生根和种子萌发率低等问题限制了其应用推广。

目前，六堡茶的种植栽培主要是采用种子实生苗进行育苗，由于茶树经常摘芽，结实极少，常规的田间种子萌发率<4％，生长周期长，占地面积大，难以实现高效快速的大规模工业化种植栽培。

发明内容

本发明的目的在于：山槛紫属于六堡茶的一个优质原生珍稀品种，为解决原生老茶树中优选良种、保持良种性状稳定、繁育高效、规模生产等问题，提供一种适制六堡茶山槛紫原种种苗的组织培养方法，本培养方法无菌苗增殖系数3-4倍，炼苗成活率达到80％以上，可以解决现有六堡茶种子实生苗不能高效快速的大规模工业化种植栽培的问题。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种适制六堡茶山槛紫原种种苗的组织培养方法，包括无菌播种、愈伤组织诱导培养、芽分化培养、丛生芽诱导培养、增殖培养、生根培养及炼苗；所述愈伤组织诱导培养为将子叶和胚轴接入愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养30～35d；愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.1～0.8mg/L+2,4-D0.1～0.8mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂5.0～5.8g/L，pH为6.8～7.0。

较佳地，所述无菌播种包括以下步骤：

(1)种子采收：10～12月采收优良单株的成熟果实，选取粒大、饱满、未开裂、无霉变、无虫害的种子，种子宜随采随播；

(2)表面灭菌：种子先用0.1％中性洗涤剂水溶液浸泡20～30min，然后在自来水下流水冲洗10～30min；在超净工作台上，将种子先用75％酒精浸泡40～60s，无菌水冲洗3～5遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡16～20min，无菌水冲洗3～5遍；

(3)种子处理及播种：将种子埋入无菌河沙中，用无菌水将无菌河沙湿润，覆膜保湿，置于温度25±2℃，光照强度为：1500-2000LUX，光照时间为14-16h/d的培养室中催芽；

(4)外植体的获得：待种子萌发后，选择具有2片子叶、真叶尚未展开的无菌苗，切取子叶和胚轴或剪接第一、二、三次后再萌的新芽或在晴天下午室外采摘的六堡茶山槛紫嫩芽作为外植体。

较佳地，所述芽分化培养为将愈伤组织接入分化培养基上进行培养，培养时间为30～35d；所述分化培养基为MS+6-BA1～3mg/L+NAA0.05～0.15mg/L+TDZ0.01～0.02mg/L+蔗糖20～40g/L+琼脂4.5～5.6g/L，pH为6.8～7.0。

较佳地，所述丛生芽诱导培养为将经愈伤组织分化的不定芽接入丛生芽培养基上进行培养，培养30～35d；所述丛生芽培养基为MS+6-BA1～3mg/L+NAA0.05～0.15mg/L+TDZ0.01～0.03mg/L+赤霉素0.1～0.2mg/L+蔗糖20～40g/L+琼脂4.5～6.0g/L，pH为6.8～7.0。

较佳地，所述增殖培养为将经丛生芽诱导后的长约1～2cm的芽或分段剪成带一个芽的茎段接入增殖培养基上进行培养，培养30～35d；所述增殖培养基为MS+6-BA0.2～0.8mg/L+NAA0.02～0.08mg/L+IBA0.02～0.08mg/L+蔗糖20～40g/L+琼脂4.5～6.0g/L，pH为6.8～7.0。

较佳地，所述生根培养为从增殖培养获得的不定芽或丛生芽中切取生长健壮、高度为3～4cm的组培芽，接入生根培养基上进行培养，培养20～30d；所述生根培养基为1/2MS+0.50～1.00mg/L IBA+蔗糖20～40g/L+琼脂4.5～6.0g/L，pH为6.8～7.0。

较佳地，所述炼苗为选择根、茎、叶俱全，株高3.0～4.0cm，叶片2～6片，根数3-5条以上，根长1～2cm的组培苗，先带瓶放置于室温为15～28℃、光照强度为1500～3000LUX、空气相对湿度≥85％的环境中2～7d，然后除去瓶盖继续放置1～2d以进行炼苗。

较佳地，所述愈伤组织诱导培养、愈伤组织分化培养、丛生芽诱导培养、增殖培养及生根培养的培养温度为23～30℃，光照强度为1800～2 000LUX，光周期14～16h。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)本发明以六堡茶核心产区的原生优质六堡茶山槛紫种子或芽为外植体，经过无菌播种、愈伤组织诱导培养、愈伤组织分化培养、丛生芽诱导、增殖培养、生根培养及炼苗的标准步骤，并通过培养基的筛选，制成了诱导、分化、丛生芽培养、生根培养等专用培养基，成功地建立了六堡茶山槛紫组织培养育苗的全套体系，为六堡茶山槛紫的快速繁殖提供了一条可靠的技术和方法。

(2)本发明通过采用组织培养方法，增殖殖系数达3-4倍，在短期内能提供大量的优质种苗，加快了六堡茶推广应用的速度；经过诱导增殖，大多数六堡茶不定芽叶片肥厚，茎干粗大，经过数轮继代培养后，组培苗生长正常。

(3)本发明与同类方法相比具有很大优势，如扦插育苗虽然比较容易操作，但是枝条扦插繁殖生根困难，成活率低；种子育苗方法中由于六堡茶种子较少，种皮坚硬，常规田间发芽率不足4％，造成种子的大量浪费和造林中六堡茶种苗的缺乏；本发明采用组织培养法繁育六堡茶山槛紫种苗，无菌苗增殖系数3-4倍以上，炼苗成活率达到80％以上，实现高效栽培管理技术，可实现一年种树，第二年见成效，为大规模六堡茶育种提供了快速有效途径，在工厂规模化育苗生产中具有很强的实用意义。

(4)本发明的六堡茶山槛紫组培苗叶片肥厚，幼叶紫色，茎干粗大，具有变异率低、增殖系数高的优点，适用于提供六堡茶种植的种苗；本发明通过无性繁育，保持亲本优良特质，成本低，污染小，四季可生产，适合大规模无性育苗。

附图说明

图1为本发明的六堡茶山槛紫组培苗，包括(a)和(b)；

图2为本发明的六堡茶山槛紫组培苗生根；

图3为本发明的六堡茶山槛紫组培苗丛生芽；

图4为本发明的六堡茶山槛紫春梢；

图5为本发明的六堡茶山槛紫萌发的紫芽；

图6为本发明的六堡茶山槛紫花；

图7为本发明的六堡茶山槛紫果；

图8为本发明的六堡茶山槛紫树。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

本发明中：6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为α-萘乙酸，IBAK为吲哚丁酸钾盐，GA为赤霉素，TDZ为N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲。

实施例1

一种适制六堡茶山槛紫原种种苗的组织培养方法，包括如下步骤：

(1)无菌播种：

1)种子采收：10～12月采收优良单株的成熟果实，选取粒大、饱满、未开裂、无霉变、无虫害的种子，宜随采随播；

2)表面灭菌：种子先用0.1％中性洗涤剂水溶液浸泡25min，然后在自来水下流水冲洗20min；在超净工作台上，将种子先用75％酒精浸泡45s，无菌水冲洗4遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡18min，无菌水冲洗4遍；

3)种子处理及播种：将种子埋入无菌河沙中，用无菌水将无菌河沙湿润，覆膜保湿，置于温度25±2℃，光照强度为：1800LUX，光照时间为15h/d的培养室中催芽；

4)外植体的获得：待种子萌发后，选择具有2片子叶、真叶尚未展开的无菌苗，切取子叶和胚轴或剪接第一、二、三次后再萌的新芽或在晴天下午室外采摘的六堡茶嫩芽作为外植体；

(2)愈伤组织诱导培养

将子叶和胚轴接入愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养32d；愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.5 mg/L+2,4-D0.5 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH为6.8；

(3)愈伤组织芽分化培养

将愈伤组织接入不定芽分化培养基上进行培养，培养时间为32d；分化培养基为MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.10mg/L+TDZ 0.015mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.0g/L，pH为6.8；

(4)丛生芽诱导

将经愈伤组织分化培养后的不定芽接入丛生芽培养基上进行培养，培养32d；所述丛生芽培养基为MS+6-BA2 mg/L+NAA0.10 mg/L+TDZ0.02 mg/L+赤霉素0.15mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.0g/L，pH为6.8；

(5)增殖培养

将经丛生芽诱导后的长约1～2cm的不定芽或分段剪成带一个芽的茎段接入增殖培养基上进行培养，培养30d；增殖培养基为MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.06 mg/L+IBA0.06mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L，pH为6.8；

(6)生根培养

从增殖培养获得的不定芽或丛生芽中切取生长健壮、高度为3～4cm的组培芽，接入生根培养基上进行培养，培养25d；所述生根培养基为1/2MS+0.80mg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L，pH为6.8；

(7)炼苗

选择根、茎、叶俱全，株高3.0～4.0cm，叶片2～6片，根数3-5条以上，根长1～2cm的组培苗，先带瓶放置于室温为20℃、光照强度为2500LUX、空气相对湿度≥85％的环境中5d，然后开瓶盖继续放置1d以上进行炼苗。

愈伤组织诱导培养、芽分化培养、丛生芽诱导培养、增殖培养及生根培养的培养温度为28℃，光照强度为1900LUX，光周期15h。

实施例2

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(1)，无菌播种包括以下步骤：

1)种子采收：10～12月采收优良单株的成熟果实，选取粒大、饱满、未开裂、无霉变、无虫害的种子，随采随播；

2)表面灭菌：种子先用0.1％中性洗涤剂水溶液浸泡20min，然后在自来水下流水冲洗10min；在超净工作台上，将种子先用75％酒精浸泡40s，无菌水冲洗3遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡16min，无菌水冲洗4遍；

3)种子处理及播种：将种子埋入无菌河沙中，用无菌水将无菌河沙湿润，覆膜保湿，置于温度25±2℃，光照强度为：1500LUX，光照时间为8-10h/d的培养室中催芽；

4)外植体的获得：待种子萌发后，选择具有2片子叶、真叶尚未展开的无菌苗，切取子叶和胚轴或剪接第一、二、三次后再萌的新芽或在晴天下午室外采摘的六堡茶嫩芽作为外植体。

实施例3

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(1)，无菌播种包括以下步骤：

1)种子采收：10～12月采收优良单株的成熟果实，选取粒大、饱满、未开裂、无霉变、无虫害的种子，随采随播；

2)表面灭菌：种子先用0.1％中性洗涤剂水溶液浸泡30min，然后在自来水下流水冲洗30min；在超净工作台上，将种子先用75％酒精浸泡60s，无菌水冲洗3遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡20min，无菌水冲洗4遍；

3)种子处理及播种：将种子埋入无菌河沙中，用无菌水将无菌河沙湿润，覆膜保湿，置于温度25±2℃，光照强度为：2000LUX，光照时间为10-12h/d的培养室中催芽；

4)外植体的获得：待种子萌发后，选择具有2片子叶、真叶尚未展开的无菌苗，切取子叶和胚轴或剪接第一、二、三次后再萌的新芽或在晴天下午室外采摘的六堡茶嫩芽作为外植体。

实施例4

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(2)，愈伤组织诱导培养：将子叶和胚轴接入愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养30d；愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.1 mg/L+2,4-D0.1 mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L，pH为7.0。

实施例5

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(2)，愈伤组织诱导培养：将子叶和胚轴接入愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养35d；愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.8 mg/L+2,4-D0.8mg/L+蔗糖35g/L+琼脂5.8g/L，pH为7.0。

实施例6

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(3)，愈伤组织芽分化培养：将愈伤组织接入分化培养基上进行培养，培养时间为30d；分化培养基为MS+6-BA1mg/L+NAA 0.05mg/L+TDZ 0.01mg/L+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L，pH为6.8。

实施例7

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(3)，愈伤组织芽分化培养：将愈伤组织接入分化培养基上进行培养，培养时间为35d；分化培养基为MS+6-BA3mg/L+NAA0.15mg/L+TDZ 0.02mg/L+蔗糖40g/L+琼脂5.6g/L，pH为7.0。

实施例8

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(4)，丛生芽诱导培养：将经愈伤组织分化培养后的愈伤组织接入丛生芽培养基上进行培养，培养30d；所述丛生芽培养基为MS+6-BA1mg/L+NAA0.05 mg/L+TDZ0.01 mg/L+赤霉素0.10mg/L+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L，pH为7.0。

实施例9

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(4)，丛生芽诱导培养：将经愈伤组织分化培养后的不定芽接入丛生芽培养基上进行培养，培养30d；所述丛生芽培养基为MS+6-BA3mg/L+NAA0.15 mg/L+TDZ0.03 mg/L+赤霉素0.20mg/L+蔗糖40g/L+琼脂6.0g/L，pH为7.0。

实施例10

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(5)，增殖培养：将经丛生芽诱导后的长约1～2cm的芽或分段剪成带一个芽的茎段接入增殖培养基上进行培养，培养30d；所述增殖培养基为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02 mg/L+IBA0.02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L，pH为6.8。

实施例11

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(5)，增殖培养：将经丛生芽诱导后的长约1～2cm的不定芽或分段剪成带一个芽的茎段接入增殖培养基上进行培养，培养35d；所述增殖培养基为MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.08mg/L+IBA0.08mg/L+蔗糖40g/L+琼脂6.0g/L，pH为7.0。

实施例12

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(6)，生根培养：从增殖培养获得的不定芽或丛生芽中切取生长健壮、高度为3～4cm的组培芽，接入生根培养基上进行培养，培养20d；所述生根培养基为1/2MS+0.50mg/L IBA+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L，pH为6.8。

实施例13

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(6)，生根培养：从增殖培养获得的不定芽或丛生芽中切取生长健壮、高度为3～4cm的组培芽，接入生根培养基上进行培养，培养30d；所述生根培养基为1/2MS+1.00mg/L IBA+蔗糖40g/L+琼脂6.0g/L，pH为7.0。

实施例14

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(7)，炼苗为选择根、茎、叶俱全，株高3.0～4.0cm，叶片2～6片，根数3-5条以上，根长1～2cm的组培苗，先带瓶放置于室温为15℃、光照强度为1500LUX、空气相对湿度≥85％的环境中2d，然后开瓶盖继续放置1d以上进行炼苗。

实施例15

本实施例其他工艺参数与实施例1保持一致，不同之处在于：步骤(7)，炼苗为选择根、茎、叶俱全，株高3.0～4.0cm，叶片2～6片，根数3-5条以上，根长1～2cm的组培苗，先带瓶放置于室温为28℃、光照强度为3000LUX、空气相对湿度≥85％的环境中7d，然后开瓶盖继续放置2d以上进行炼苗。

本申请的六堡茶山槛紫原种种苗，为现有的茶种。上世纪九十年代末，广西苍梧县六堡镇山坪村山槛组的老茶农在距离其家有两小时路程的山槛组(地名)老林中发现了分散分布的野生老茶树若干株。其中，有一株桩径23厘米老树，被山猪或野兽拱断后，有数个新枝桠从主干侧面长出。因长年在荒野中，树桩中部也被虫蛀空。为保护这棵老茶树，老茶农便从深山里把这棵老茶树挖了回来，种植在家旁的茶山中悉心护理。几年前，据专家对这株老树评估，其树龄在160年左右。

为区别和纪念这株因被发现在六堡镇山坪村山槛组深山而被命名为“山槛紫”的老茶树，属于苍梧县六堡镇珍稀原生群体种之一，为灌木型的中叶种。

“山槛紫”老茶树的树姿开展，分枝密。估算茶树原高超过3.5米，现新萌侧枝高98厘米，树幅约85厘米，节间3厘米。叶片半向上斜着生；成叶长达7.8厘米，宽3.2厘米，叶形椭圆修长，叶芽紫，三四片后叶色转绿，叶面微隆，部分隆起明显，光泽中，叶缘微波，锯齿细，浅而密，叶身平展稍内卷，叶质中，叶端尖；侧脉8-11对。嫩芽梢淡紫色，一芽两三叶呈紫色，茸毛很少，发芽密，持嫩性较强；发芽密度68个/平方尺。在3月中旬萌芽，四月初开采，属早芽种，萌芽终止期在10月中旬。通过5年时间对其茶品质跟踪研究，确认“山槛紫”这棵古树品种各项指标非常优秀，滋味醇厚、香气愉悦饱满，层次丰富，余韵悠长。

本实施例1-15六堡茶进行炼苗后，还进行组培苗驯化及苗期管理等。其中组培苗驯化具体为：(1)环境条件：环境温度为15℃～28℃，空气相对湿度≥85％；(2)基质：基质采用用50％多菌灵可湿性粉剂+枯草芽孢杆菌消毒的进口泥炭，pH为5.5～6.5，经沤堆发酵5-10d后，将基质填充到育苗穴盘；移栽容器采用50或72孔育苗穴盘，穴盘规格为54cm×28cm；(3)清洗：从培养瓶中取出组培苗，洗净根部培养基，用0.1-1％高锰酸钾水溶液浸泡10-20min后，沥水后在阴凉处晾10min～20min；(4)移栽每穴种植1株，将小苗种植在基质中，喷雾保湿；(5)移栽后管理：移栽后的组培苗置于苗床，覆膜，并采用遮光率为60％～80％的遮阳网进行遮光。视干湿情况白天喷雾保湿，移栽30-40d后，去除薄膜。苗期管理包括水分管理、施肥管理及病虫草害防治，施肥管理为每隔10d～15d用0.1％磷酸二氢钾水溶液叶面喷施1次，或每隔10d～15d用0.1％～0.3％尿素、复合肥N-P

如图1-8分别为本发明实施例1的组织培养方法，获得的六堡茶山槛紫组培苗、生根、丛生芽、春梢、紫芽及山槛紫原株的花、果和树。本发明采用组织培养法繁育种苗，山槛紫无菌苗增殖系数3-4倍以上，炼苗成活率达到80％以上，实现高效栽培管理技术，可实现一年种树，第二年见成效，为大规模六堡茶育种提供了快速有效途径，在工厂规模化育苗生产中具有很强的实用意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。