表达中和抗体及DC-SIGN抗体的细胞囊泡及其制备方法和应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，公开了表达中和抗体及DC‑SIGN抗体的细胞囊泡及其制备方法和应用。本发明制备含有针对SARS‑CoV‑2和DC‑SIGN的单链可变片段基因序列的质粒，利用三质粒系统将所得质粒进行慢病毒包装，慢病毒感染靶细胞，然后通过裂解挤压获得表达含有目的抗体的细胞囊泡，用于新型冠状病毒感染患者的治疗。制备的细胞囊泡可特异性中和新型冠状病毒，阻断新型冠状病毒对高表达ACE2的细胞的入侵；同时可将以中和的新型冠状病毒靶向运输至抗原呈递细胞如树突状细胞的位置，增强机体自身的免疫功能。本发明的治疗方法除了可以短时间中和新型冠状病毒，阻止细胞感染外，还可以激活自身主动免疫的功能，形成长期的免疫保护。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及表达中和抗体及DC-SIGN抗体的细胞囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

COVID-19是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的疾病。常见症状包括发烧，咳嗽，疲劳，呼吸急促以及嗅觉和味觉丧失。除开疫苗以外，中和抗体被认为是最有前景的治疗方式之一。中和抗体的主要防御机制是通过中和作用阻止新型冠状病毒感染人体细胞。SARS-CoV-2的刺突蛋白是中和抗体的主要靶标。已经有研究者分离出针对SARS-CoV-2的单克隆中和抗体。然而在使用单克隆抗体治疗的时候，抗体依赖性细胞的细胞毒性和/或吞噬作用，也可能引起一些副作用。

除开短期中和大量SARS-CoV-2外，激活自身的免疫系统产生免疫记忆也被认为是提供长期保护，预防再次感染的重要步骤。DC疫苗在病毒感染以及肿瘤治疗等领域中已经被广泛应用。其主要机制是通过病毒抗原或者肿瘤抗原的活化后，树突状细胞可以通过抗原呈递作用激活下游的免疫细胞，使体内产生相应抗体以及记忆细胞，在治疗的同时可以提供长效保护，防止复发。

发明内容

针对目前现有技术存在的不足，为了能够在短期内中和大量SARS-CoV-2，减少患者体内病毒载量，以及通过活化树突状细胞的方式给新型冠状病毒感染的病人提供长期有效的保护，本发明的目的在于提供一种表达中和抗体及DC-SIGN抗体的细胞囊泡及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的在于提供一种表达中和抗体及针对DC-SIGN抗体的细胞囊泡的制备方法。

本发明的第二个目的在于提供采用上述方法获得的细胞囊泡。

本发明的第三个目的在于提供上述细胞囊泡用于制备抗新型冠状病毒感染的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种表达中和抗体及针对DC-SIGN抗体的细胞囊泡的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备含有针对SARS-CoV-2和DC-SIGN的单链可变片段基因序列的质粒：将能够表达针对SARS-CoV-2和DC-SIGN的单链可变片段的核苷酸序列克隆至含有CD19-CAR的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的质粒中，替换掉CD19CAR中的抗CD19scFv，以获得含有针对SARS-CoV-2和DC-SIGN的单链可变片段基因序列的质粒；

S2、利用三质粒系统包装含有针对SARS-CoV-2和DC-SIGN的单链可变片段基因序列的慢病毒；

S3、将步骤S2所得慢病毒感染靶细胞，使所述靶细胞的细胞表面表达含有针对SARS-CoV-2和DC-SIGN的单链可变片段；

S4、将步骤S3所述靶细胞裂解得到细胞膜，将细胞膜经挤压过滤的方式获得纳米囊泡。

优选地，步骤S1所述的针对SARS-CoV-2的单链可变片段基因序列包括但不限于CB6、4A8、B38、H4、S309、n3130或者n3088。

所述针对DC表面受体的单链可变片段基因序列来自PCT/IB2019/059312。

已有的一些研究表明表达单链可变片段的293T细胞的细胞囊泡，对特定的肿瘤抗原具有良好的靶向性；优选地，步骤S3所述靶细胞包括但不限于293T细胞、健康人的T细胞或者NK细胞。

本发明通过将针对SARS-CoV-2和DC-SIGN的单克隆抗体序列表达在细胞上，然后再挤取或分离表达SARS-CoV-2和DC-SIGN单克隆抗体序列的细胞囊泡，用于中和和杀死患者体内的SARS-CoV-2。一方面可以在中和SARS-CoV-2的同时避免了抗体增强效应的产生；另一方面，可以已经中和的SARS-CoV-2更好地靶向并活化树突状细胞，以提升自身免疫。该方式不仅可以短期内中和SARS-CoV-2，还可以通过抗原呈递的方式，提升长期免疫保护。

优选地，所述制备方法还包括将佐剂单磷酰脂质A负载到所述纳米囊泡。

优选地，所述细胞囊泡的平均直径为100-200nm。

本发明还提供所述方法获得的表达针对SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡。

本发明还提供了上述表达针对SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡用于制备抗新型冠状病毒感染的药物中的应用。

优选地，所述新型冠状病毒为野生型或奥密克戎突变型。

上述制备的抗新型冠状病毒感染药物至少包括以下功能：

(1)中和新型冠状病毒，阻断新型冠状病毒对高表达ACE2的细胞的入侵；

(2)将以中和的新型冠状病毒靶向运输至抗原呈递细胞如树突状细胞的位置，激活和增强自身的主动免疫。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明通过将针对SARS-CoV-2的单克隆抗体的scFv片段表达在细胞囊泡上，减少SARS-CoV-2在体内的载量，从而缓解病毒对组织的损害；

(2)本发明通过将针对SARS-CoV-2的单克隆抗体的scFv片段表达在细胞囊泡上，减少单纯使用SARS-CoV-2中和抗体所引发的抗体增强效应；

(3)本发明通过将针对DC-SIGN的单克隆抗体的scFv片段表达在细胞囊泡上，增强树突状细胞的抗原呈递功能，协助彻底清除SARS-CoV-2，使人群具有长期的病毒免疫能力；

(4)本发明通过首次制造表达SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡，同时靶向SARS-CoV-2和树突状细胞细胞，在体内直接生产治疗性“新型冠状病毒疫苗”，大大减少了疫苗的生产工序，增加了患者的可接受度；

(5)本发明在短期中和病毒的同时，利用树突状细胞的特征进行抗原呈递，从而长期增强免疫系统，因此，该方法很好地将治疗和疫苗结合在一起，将短期的被动中和病毒能力和长期的主动免疫能力结合在一起。

附图说明

图1为表达嵌合抗原受体的细胞囊泡的制备及其中和新型冠状病毒的原理示意图。

图2为表达SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡的NTA表征结果图。

图3为表达SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡的WB表征结果图。

图4为表达SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡中和野生型新型冠状病毒的结果图。

图5为表达SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡中和奥密克戎突变型新型冠状病毒的结果图。

图6为表达SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡活化树突状细胞的流式结果图。

图7为佐剂单磷酰脂质A加载在细胞囊泡后的吸光度结果图。

图8为佐剂单磷酰脂质A加载或未加载在细胞囊泡内对正常细胞活性影响结果图。

图9为小鼠注射表达SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡后的血清中和新型冠状病毒的结果图。

图10为小鼠注射表达SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡后体内树突状细胞表面分子表达情况的流式统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

首先构建含有CB6和anti-DC-SIGN的单克隆抗体核苷酸序列的慢病毒质粒，然后通过三质粒系统包装相应的慢病毒；通过用含有新型冠状病毒单克隆抗体基因的慢病毒去感染293T细胞，可以使得293T细胞表面表达含有针对新型冠状病毒和树突状细胞的scFv；进一步，将制备好的细胞通过裂解以及利用细胞挤出器挤取细胞便可获得表达针对新型冠状病毒scFv和DC-SIGN的细胞囊泡。由于这些细胞囊泡表面表达有CB6的scFv，因此在人体内可以很好地中和新型冠状病毒，阻止新型冠状病毒入侵高表达ACE2的细胞；另一方面，由于这些细胞囊泡表面还表达针对树突状细胞表面DC-SIGN的scFv，因此可以将被中和的新型冠状病毒靶向运输至树突状细胞，从而更好地发挥树突状细胞的抗原呈递功能，激活自身的免疫系统。与此同时，细胞囊泡内部包裹的佐剂MPLA可以有效促进DC的活化，进一步提升树突状细胞的成熟与活化。

实施例1、表达针对SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡的准备

1.1含有SARS-CoV-2单克隆抗体scFv核苷酸序列质粒的构建

采用已报道的CB6(ShiR,ShanCetal.Ahumanneutralizingantibodytargetsthereceptor-bindingsiteofSARS-CoV-2.Nature.2020Aug；584(7819):120-124.doi:10.1038/s41586-020-2381-y.Epub2020May26.)和DC-SIGN抗体(InternationalPublication Number：WO2020/089811A1)，二者通过(GGGGS)3连接肽连接在一起，其核苷酸的序列合成由华大基因公司完成。

在完成CB6-DCSIGN-scFv的合成后，亚克隆至含有CD19-CAR-T的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的质粒中，代替掉CD19CAR中的抗CD19scFv，从而获得含有CB6-DCSIGN-scFv的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的质粒。其中CD19-CAR的核苷酸序列分别CD19scFv-CD8hinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ。

1.2表达SARS-CoV-2单克隆抗体和针对和DC-SIGN的scFv的细胞的制备

利用上述构建的含有CB6-DCSIGN-scFv的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的质粒，即可进一步制备表达SARS-CoV-2单克隆抗体scFv的细胞。

利用三质粒系统包装慢病毒：三质粒系统分别是含有CB6-DCSIGN-scFv的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的质粒、psPAX2质粒和pMD2.G质粒。本发明中是利用293T细胞包装慢病毒。收集293T培养基上清中的病毒，然后通过超高速离心、重悬，以及后续的慢病毒滴度滴定，即可用于靶细胞的感染。感染的靶细胞是293T细胞：将293T细胞铺于6孔板中，待其长至70％-80％的密度。

慢病毒的包装具体操作如下：

(1)将293T包装细胞以1.3-1.5×10

(2)转染包装细胞：准备3种转染质粒的混合物：250ngpMD2.G质粒、750ngpsPAX2质粒、1μg重组质粒；10-30μLOptiMEM培养基；

(3)用OptiMEM稀释Lipofectamine2000：10μLLipofectamine+90μLOptiMEM，滴加Lipofectamine试剂，并通过旋转尖端或轻拂试管进行混合；在室温下孵育5分钟；

(4)将3种质粒混合物逐滴添加到稀释的Lipofectamine试剂中，并通过旋转尖端进行混合；

(5)在室温下将转染混合物孵育20-30分钟；

(6)小心地将转染混合物转移到接种培养基中的包装细胞中，每块板的转染混合物总体积应为100至125μL；

(7)孵育细胞18小时(37℃，5％CO

(8)孵育细胞24小时(37℃，5％CO

(9)转染后约40小时收获含有慢病毒的培养基，将介质转移到存储管中，更换为6mL Harvest培养基；

(10)每12-24小时重复一次病毒收获，并用6mL收获培养基替换；通常收集总共2-3个时间点；最后一次收获后，丢弃包装细胞；

(11)以1250rpm的转速将含有病毒的培养基旋转5分钟，使上清液通过45μm过滤器，并转移到无菌存储管中；

(12)放置4℃下短时间(数小时至数天)存储，或者在-20℃或-80℃下冷冻以进行长期存储。

通过上述的慢病毒包装，我们获得了含有目的基因的慢病毒。由于不同的细胞感染复数不同，因此有必要进一步确定慢病毒载体的滴度。由于慢病毒带有荧光标记可以使用显微镜来确定荧光细胞的百分比，进而确定慢病毒滴度。

本实施例中慢病毒滴度滴定的具体操作如下：

(1)将75,000个细胞接种到6孔培养皿的每个孔中；

(2)将细胞孵育过夜；

(3)若使用新鲜病毒，可通过0.45μm聚醚砜过滤器进行过滤，以除去细胞和碎片；如果使用冷冻病毒，须在温水中搅拌，在37℃下快速融化慢病毒；

(4)将慢病毒稀释液制备到含有10μg/mL聚乙烯的DMEM中，充分混合稀释液；

(5)从细胞中轻轻吸出培养基，向每孔中加入1.5mL病毒稀释液，孵育48-72小时；

(6)轻轻吸出培养基，并用1mLPBS代替；

(7)计算每个孔中荧光阳性细胞的百分比。

计算滴度时，仅考虑荧光阳性细胞少于40％的孔。滴定方法假设每个单元有1个积分事件。当百分比超过40％时，可能会对带有多个整合事件的细胞进行计数，这会导致低估真正的效价。

使用稀释因子(方法1)或病毒体积(方法2)计算每mL的转导单位(TU/mL)：

方法1：TU/mL＝(转导的细胞数×荧光百分率×稀释因子)/(转导体积(mL)；

方法2：TU/mL＝(转导的细胞数x荧光百分比)/(病毒体积(mL))。

通过上述步骤确定好慢病毒的滴度后，即可使用慢病毒感染靶细胞(例如293细胞或T细胞等)，进而获得稳定表达嵌合抗原受体的293细胞或T细胞。

慢病毒感染细胞的具体步骤如下：

(1)通过将20μL的10mg/mL的聚乙烯稀释到20mL的溶剂中，制备一批DMEMComplete+10μg/mL的聚乙烯；

(2)在37℃下快速融化慢病毒；

(3)在DMEMComplete+10μg/mL聚乙烯中准备一系列慢病毒稀释液，充分混合；

(4)通过将细胞接种到6孔培养皿中，将这些细胞添加到已经含有0.5mL各种稀释度的病毒溶液的孔中，确保在此步骤中使用含聚乙烯的介质制作细胞溶液；

(5)用病毒孵育细胞48-72小时；

(6)轻轻吸出细胞中的培养基，加入1.5mL含有适当抗生素的DMEM溶液；

(7)每天观察，确保未转导慢病毒的孔中的细胞即将死亡，定期进行液体更换，监测细胞的生长；

(8)随着耐药细胞的多克隆种群开始汇合，可扩展成更大的容器；6孔培养皿的融合孔可以扩展为10平方厘米培养皿；可以将融合的10平方厘米培养皿扩展到两个75平方厘米的培养皿中。

一旦多克隆种群生长良好并充分扩展，准备细胞储备和/或收获以测试蛋白质表达。

1.3表达针对SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡的准备

具体操作如下：

(1)收集细胞，700×g离心5分钟；

(2)离心后，弃去上清液，并将沉淀用1×PBS洗涤3次；

(3)将细胞沉淀物分散在由1mMNaHCO

(4)将该混合物加载到杜恩斯匀浆器中，并通过反复研磨20次来破坏细胞；

(5)破裂后，将混合物以800×g的速度旋转5分钟以清除大碎片；

(6)收集上清液，并再次以10000×g离心25分钟，弃去沉淀物；上清液以100000×g离心30分钟，弃去上清液，收集质膜，为灰白色沉淀；

(7)将膜沉淀物分散在pH＝7.4的PBS中，并用轻柔的超声处理重悬以进行后续实验。

膜蛋白含量用BCA测定法定量。

实施例2、佐剂单磷酰脂质A(MPLA)加载到囊泡

(1)通过用紫外线照射1分钟电穿孔比色皿(0.4厘米比色皿)，然后将它们放在冰上(若比色皿比较脏则放入70％乙醇中，然后在双蒸水中冲洗)；

(2)标记好样品管；

(3)当分离外泌体进行电穿孔时，将囊泡沉淀重悬于CytoMix缓冲液中，重悬外泌体沉淀物后，读取外泌体浓度，使其终浓度为0.25-1μg/μL；

(4)每个样品添加90μL外泌体和10μg的MPLA，将两者混匀后转移至0.4cm电穿孔比色皿中，然后在150V和100uF下电穿孔；

(5)将混合物在37℃孵育30分钟，以确保囊泡的质膜完全恢复；

(6)洗涤和离心：将所有外泌体重悬于20mL含1％(wt/vol)BSA的PBS中，在4℃下以120,000g超速离心70分分钟。

通过使用分光光度计检测MPLA的吸光度，对装载MPLA的囊泡进行定量，结果如图7，MPLA在210nm处有特异性的吸收峰，因此可以通过检测MPLA在210nm处的吸光度大小，计算出装载在细胞囊泡中MPLA的质量。

实施例3、细胞囊泡的生物安全性评估

为了保证细胞囊泡对于正常细胞的安全性，我们将制备的细胞囊泡和HEK293T细胞进行共孵育，检测细胞和囊泡共孵育之后细胞活性是否会受到影响，具体步骤如下

(1)接种HEK293T细胞：按照2～3×10

(2)加入细胞囊泡：向每个孔中加入100μl用含5％FBSDMEM培养基稀释成相应浓度(10μg/μL、25μg/μL、50μg/μL、100μg/μL和200μg/μL)的载有或未载有MPLA的细胞囊泡；对照孔加入不含细胞囊泡的5％FBSDMEM培养基100μl。

(3)呈色：培养24小时后，每孔加入MTT溶液20μl，在37℃，5％CO2培养条件下继续孵育4小时，然后终止培养，弃去孔内培养上清液，每孔加入150μl

DMSO，摇床低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

4)测光吸收值：选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光值(A值)。

5)计算细胞活性：细胞活性＝(实验组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值)×100％。

如图8所示，本实例中，检测结果显示本细胞囊泡载入佐剂MPLA前后均对正常细胞没有产生毒性，证明该囊泡具有良好的安全性。

实施例4、表达针对SARS-CoV-2和和DC-SIGN抗体的细胞囊泡对新型冠状假病毒的中和能力

为了验证细胞囊泡对新型冠状病毒的中和能力，我们将制备的细胞囊泡和S蛋白假病毒共孵育，检测细胞囊泡能否阻断S蛋白假病毒入侵高表达ACE2的293T细胞。由于本实例中制备的S蛋白假病毒含有荧光素酶基因，当S蛋白假病毒进入高表达ACE2的293T细胞后，会表达荧光素酶；因此，可以通过检测高表达ACE2的293T细胞里面的荧光素酶表达量，反应进入细胞的S蛋白假病毒量。细胞囊泡对新型冠状病毒的中和能力通过半抑制浓度(IC50)的数值表示，IC50的数值越小，说明中和一定量的S蛋白假病毒需要的细胞囊泡量越少，细胞囊泡的中和能力越强。

本实例中，高表达ACE2的293T细胞通过常规的稳转细胞株构建的方法获得，即：首先通过PCDH-ACE2质粒和慢病毒辅助质粒(psPAX2，pMD2.G)共转染到239T细胞中获得包含ACE2基因的慢病毒颗粒，然后使用该病毒感染293T细胞，48h小时后开始添加嘌呤霉素进行筛选，大约2周后即可获得稳定高表达ACE2的293T细胞。

本实例中，S蛋白假病毒购买自商品化试剂，分为野生型和突变型(奥密克戎)两种。具体操作步骤如下：

(1)将1×10

(2)将滴度为1x10

(3)48h后，采用Bright-Glo荧光素酶测定系统检测293T-ACE2细胞中荧光素酶的表达强度；即加入30uL荧光素酶试剂，混合后将混合物转至黑底96孔板，避光孵育2min后测量发光度；荧光素酶通过EnVisionMultilabelPlateReader进行检测。

如图4和图5所示，本实例中，检测结果显示无论是对于野生型还是突变型，该囊泡具有良好的中和S蛋白假病毒的能力，其中对野生型的IC50为16.85μg/mL，对奥密克戎的IC50为21.76μg/mL。

实施例5、表达针对SARS-CoV-2和和DC-SIGN抗体的细胞囊泡对树突状细胞的活化能力

为了验证细胞囊泡对树突状细胞的活化作用，我们将制备的细胞囊泡、S蛋白假病毒和树突状细胞共孵育。树突状细胞和免疫细胞的相互作用中，高表达B7家族分子(CD80\CD86)，为活化免疫细胞提供足够的第二信号。文献中通常检测CD80/86二者或者其中一种共刺激分子的表达含量来检测树突状细胞的活化程度，本发明中通过检测树突状细胞上共刺激分子的表达变化来反应其活化程度。

本实例中，树突状细胞来源于人体血液中PBMC的诱导。通过人体分离血液中的PBMC后，加入细胞因子IL4(100ng/mL)和GM-CSF(100ng/mL)；72小时后进行半换液，48h后加入细胞因子TNF-α(10ng/mL)，吸走上清，贴壁的细胞即为树突状细胞。

具体操作步骤如下：

(1)将1×10

(2)将滴度为1x10

(3)72h后，收取不同组的细胞分别进行CD80或CD86的流式抗体染色，然后上机检测共刺激分子表达情况。

如图6所示，本实例中，检测结果显示该囊泡和S蛋白假病毒共孵育树突状细胞可以有效刺激CD80和CD86的表达。

实施例6、表达针对SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡对小鼠抗病毒的激活作用

本实例中，为了验证细胞囊泡可以促进小鼠的抗病毒免疫，我们将细胞囊泡和表达S蛋白的假病毒共同注入小鼠体内，一段时间后检测小鼠血清中是否仍含有抗新型冠状病毒的中和血清来验证囊泡对小鼠抗病毒免疫的激活和促进作用，具体操作步骤如下：

(1)将滴度为1x10

(2)每组小鼠有4只，每只小鼠注射3次，每次间隔2周；

(3)将1×10

(4)取第三次免疫两周后的小鼠血清，将滴度为1×10

(5)48h后，采用Bright-Glo荧光素酶测定系统检测293T-ACE2细胞中荧光素酶的表达强度，即加入30uL荧光素酶试剂，混合后将混合物转至黑底96孔板，避光孵育2min后测量发光度，荧光素酶通过EnVisionMultilabelPlateReader进行检测，对比各组小鼠血清的中和效果。

如图9所示，本实例中，检测结果显示载入佐剂MPLA的双特异性囊泡注射后的小鼠，在免疫后两周，血清仍有较强的中和效果，且效果好于单独使用双特异性囊泡或单独使用佐剂。

实施例7、表达针对SARS-CoV-2和DC-SIGN抗体的细胞囊泡对小鼠体内DC细胞的活化作用

本实例中，为了验证细胞囊泡可以促进小鼠体内树突状细胞的活化，和实例5一样，我们将细胞囊泡和表达S蛋白的假病毒共同注入小鼠体内，一段时间后检测小鼠体内树突状细胞上共刺激分子的表达变化来反应其活化程度，具体操作步骤如下：

(1)和实例5步骤一样对小鼠进行分组和处理方式，每组小鼠有4只，每只小鼠注射3次，每次间隔2周；

(2)取第三次免疫两周后的各组小鼠的淋巴结分别进行组织研磨，然后进行CD80或CD86的流式抗体染色，上机检测共刺激分子表达情况。

如图10所示，本实例中，检测结果显示载入佐剂MPLA的双特异性囊泡注射后的小鼠，在免疫后两周，体内树突状细胞的活化程度仍很高，且效果好于单独使用双特异性囊泡或单独使用佐剂。

显然，以上所述的具体实施方案，只是对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。