降低CCR2含量或活性的物质在治疗或预防发热伴血小板减少综合征中的应用

摘要

本发明公开了降低CCR2含量或活性的物质在治疗或预防发热伴血小板减少综合征中的应用。本发明发现CCR2是一个可以用于防治发热伴血小板减少综合征病毒感染的靶点，揭示了CCR2在发热伴血小板减少综合征病毒感染和增殖的过程中发挥着重要的作用，可作为抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染的靶点，利用CCR2抑制剂作为发热伴血小板减少综合征病毒防治的候选药物用于治疗发热伴血小板减少综合征有着很好的研究前景。本发明为利用CCR2作为发热伴血小板减少综合征治疗的靶点提供了理论依据，对发热伴血小板减少综合征病毒感染的治疗以及治疗发热伴血小板减少综合征病毒感染药物的研发有着重大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域中，降低CCR2含量或活性的物质在治疗或预防发热伴血小板减少综合征中的应用。

背景技术

发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是一种新发病毒性出血热，病死率从12％至50％不等。该病的致病病原体为大别班达病毒(Dabiebandavirus)，也称为SFTSV(SFTS virus)，隶属于白纤病毒科(Phenuiviridae)班达病毒属(Bandavirus)。发热伴血小板减少综合征主要传播媒介为蜱虫，亦有通过密切接触患者分泌物而发生人传人的多起病例报道。因较高的病死率、复杂的致病机制和广泛分布的传播媒介，该病已经引起国际社会的高度关注，SFTS被世界卫生组织列为亟待优先研究的十大传染病之一。目前，针对SFTS患者的临床治疗方案主要以对症支持治疗为主，尚无获批的特异性抗病毒治疗药物或防护性疫苗。因此，明确与发热伴血小板减少综合征病毒感染相关的靶点，将有助于抗病毒治疗药物的研发和应用，并对预防公共卫生事件的爆发具有重大意义。

C-C趋化因子受体2(C-C motif chemokine receptor 2，CCR2)属于G蛋白偶联受体超家族成员，并且是单核细胞趋化蛋白1～4(MCP1～4)的受体，MCP1～4是促炎症反应的化学诱导物。CCR2是炎症单核细胞最早的化学催化受体，在T细胞、树突状细胞和上皮细胞都有表达，通过与配体衔接，CCR2介导炎症细胞迁移和激活。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染或增殖，以及如何治疗或预防发热伴血小板减少综合征。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了降低CCR2(Gene ID:729230,更新日期2023-03-29)含量或活性的物质在制备治疗或辅助治疗或预防或辅助预防发热伴血小板减少综合征产品中的应用。

上述应用中，所述降低CCR2含量或活性的物质可为抑制CCR2蛋白合成或促进CCR2蛋白降解或抑制CCR2蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物。

具体的，所述降低CCR2含量或活性的物质可为CCR2抗体或CCR2抑制剂。

在本发明的一个实施例中，所述CCR2抗体为anti-human CCR2 antibody(BioLegend,Cat.357202)。

所述CCR2抑制剂可为任何可以与CCR2蛋白质结合并抑制CCR2蛋白质活性的物质，只要能抑制CCR2蛋白质的活性，均属于本发明的范围，包括CCR2拮抗剂、CCR2抑制剂。

上述应用中，所述CCR2抑制剂可为RS102895盐酸盐(CCR2 antagonistRS102895Hydrochloride)或CCR2拮抗剂1(CCR2 antagonist 1)。

本发明还提供了降低CCR2基因(Gene ID:729230,更新日期2023-03-29)表达量的物质或敲除CCR2基因的物质在制备治疗或辅助治疗或预防或辅助预防发热伴血小板减少综合征产品中的应用。

上述应用中，所述降低CCR2基因表达量的物质可为特异识别CCR2基因的siRNA；

所述敲除CCR2基因的物质可为利用CRISPR-Cas9系统敲除CCR2基因的物质。

在本发明的一个实施例中，CCR2基因的敲除实现其部分序列(WT序列，SEQ IDNo.13)被编辑为M1序列(SEQ ID No.14)和/或M2序列(SEQ ID No.15)。

在本发明的一个实施例中，利用CRISPR-Cas9系统敲除CCR2基因的sgRNA靶点为SEQ IDNo.9所示的DNA片段。

上述应用中，所述siRNA可为序列表中SEQ ID No.1与其反向互补序列形成的siRNA，或SEQ ID No.2与其反向互补序列形成的siRNA。

所述降低CCR2含量或活性的物质在制备抑制或辅助抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染或增殖产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述降低CCR2基因表达量的物质在制备抑制或辅助抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染或增殖产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述敲除CCR2基因的物质在制备抑制或辅助抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染或增殖产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

以CCR2为靶点的治疗或预防发热伴血小板减少综合征的物质或抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染或增殖的物质在制备治疗或预防发热伴血小板减少综合征产品或在制备抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染或增殖产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种产品，所述产品的活性成分为所述降低CCR2含量或活性的物质，或所述降低CCR2基因表达量的物质或所述敲除CCR2基因的物质；

所述产品的功能为如下b1)或b2)：

b1)治疗或预防发热伴血小板减少综合征；

b2)抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染或增殖。

其中，所述感染可为发热伴血小板减少综合征病毒对动物细胞、组织或个体的感染。

本发明中，所述产品可为药物或疫苗。

本发明发现CCR2是一个可以用于防治发热伴血小板减少综合征病毒感染的靶点。首先，本发明通过siRNA敲低THP-1细胞内源CCR2表达会显著抑制发热伴血小板减少综合征病毒基因的表达；CCR2敲除细胞系中发热伴血小板减少综合征病毒的基因表达和复制均受到显著地抑制；CCR2的抑制剂和抗体可以抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染宿主细胞；CCR2敲除能显著降低发热伴血小板减少综合征病毒感染动物的病死率，CCR2抑制剂能显著改善发热伴血小板减少综合征病毒感染动物的生存率。本发明揭示了CCR2在发热伴血小板减少综合征病毒感染和增殖的过程中发挥着重要的作用，可作为抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染的靶点，利用CCR2抑制剂作为发热伴血小板减少综合征病毒防治的候选药物用于治疗发热伴血小板减少综合征有着很好的研究前景。本发明为利用CCR2作为发热伴血小板减少综合征治疗的靶点提供了理论依据，对发热伴血小板减少综合征病毒感染的治疗以及治疗发热伴血小板减少综合征病毒感染药物的研发有着重大的应用价值。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

附图说明

图1为敲低THP-1细胞系CCR2表达量对发热伴血小板减少综合征病毒感染和增殖的抑制效果。A为qPCR检测病毒RNA；B为蛋白免疫印迹检测CCR2与NP表达量。NC、CCR2 KD1、CCR2 KD2、ATF6 KD分别表示转染siNC、CCR2-siRNA-1、CCR2-siRNA-2、siATF6。

图2为CCR2-KO细胞系对发热伴血小板减少综合征病毒不同株系毒株感染和增殖的抑制效果qPCR检测病毒RNA。

图3为CCR2敲除小鼠的骨髓衍生的巨噬细胞BMDM对发热伴血小板减少综合征病毒感染和增殖的抑制效果。A为CCR2基因表达的检测；B为病毒载量检测病毒的增殖；CCR

图4为CCR2抑制剂对发热伴血小板减少综合征病毒感染和增殖的抑制效果。A为RS102895盐酸盐处理的检测结果；B为CCR2拮抗剂1处理的检测结果；C为qPCR检测RS102895盐酸盐处理病毒的RNA；D为qPCR检测CCR2拮抗剂1处理病毒的RNA；E为THP-1细胞中RS102895盐酸盐和CCR2拮抗剂1处理病毒的蛋白免疫印迹；F为huh-7细胞中RS102895盐酸盐和CCR2拮抗剂1处理病毒的蛋白免疫印迹。C、D中Vehicle表示抑制剂的浓度为0，E与F上图各泳道从左至右分别表示RS102895盐酸盐的浓度为0、0.20、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00μM的结果，下图各泳道从左至右分别表示CCR2拮抗剂1的浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μM的结果。

图5为CCR2抗体对发热伴血小板减少综合征病毒感染和增殖的抑制效果。探针法qPCR检测病毒载量，横坐标为抗体浓度，每个浓度下左侧均表示同型对照IgG处理，右侧均表示CCR2抗体处理。

图6为CCR2敲除能显著降低小鼠对发热伴血小板减少综合征病毒感染的病死率。A为接种SFTSV病毒后小鼠的体重变化，将接种前的体重记为100％；B为存活率变化。

图7为CCR2抑制剂RS102895治疗发热伴血小板减少综合征病毒感染显著改善小鼠的生存率。A为血清病毒载量检测结果，V表示Vehicle，RS表示RS102895；B为生存率变化。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置至少三次重复实验。

以下实施例中的数据定量实验标准差使用SEM，数据间显著性差异采用t-检验。

下述实施例中的SFTSV(发热伴血小板减少综合征病毒，severe fever withthrombocytopenia syndrome virus)毒株HBMC16(Zhang,Y.,Shen,S.,Shi,J.etal.Isolation,characterization,and phylogenic analysis of three new severefever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus strains derived from HubeiProvince,China.Virol.Sin.32,89–96(2017).

https://doi.org/10.1007/s12250-017-3953-3)，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的SFTSV毒株HNXY2017-50、HNXY2017-66、WCH(Li H,Zhang LK,LiSF,et al.Calcium channel blockers reduce severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus(SFTSV)related fatality.Cell Res.2019；29(9):739-753.doi:10.1038/s41422-019-0214-z)，公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

CCR2敲除的小鼠：Jackson实验室，品系为B6.129S4-Ccr2

下述实施例中的人外周血的单核细胞系THP-1、人肝癌细胞系huh-7、非洲绿猴肾细胞Vero均为美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)产品。

实施例1、改变CCR2表达量对发热伴血小板减少综合征病毒感染和增殖的影响。

通过CCR2 siRNA来敲低人外周血的单核细胞系THP-1中CCR2基因(Gene ID:729230,更新日期2023-03-29)的表达量，从而研究宿主细胞内CCR2对发热伴血小板减少综合征病毒感染的影响。

方法：THP-1细胞，铺24孔板，每孔加入1μL siRNA(siRNA1或siRNA2)和1μLRNAiMAX(Invitrogen，Cat.13778150)及48μL Opti-MEM(Gibco，Cat.2085556)，阴性对照组则每孔加入等量的siNC，阳性对照组加入等量的siATF6，利用不添加siRNA作为空白对照(vehicle)，摇晃混匀后放入37℃培养箱培养48～72h，所用培养基为RPMI1640培养基(Gibco，Cat.C11875500BT)，细胞密度为10

其中，siRNA序列如下：

CCR2-siRNA-1：5’-GGCTGTATCACATCGGTTATT-3’(SEQ ID No.1)；

CCR2-siRNA-2：5’-GAGGAUGGAAUAAUUUCCATT-3’(SEQ ID No.2)；

siNC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID No.3)；

siATF6：5’-GCAGCAACCAAUUAUCAGUUU-3’(SEQ ID No.4)。

染料法qPCR所用引物如下：

SFTSV-Forward：5’-CTCACTCATGCCCTCAACGA-3’(SEQ ID No.5)；

SFTSV-Reverse：5’-GATGAACTCACCAGCCCTGC-3’(SEQ ID No.6)；

GAPDH-Forward:5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID No.7)；

GAPDH-Reverse:5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID No.8)。

实时荧光定量PCR(染料法qPCR)检测胞内SFTSV复制的效果：使用细胞总RNA提取试剂盒(天根，Cat.DP430-H)进行细胞核酸提取，具体步骤参照说明书进行；使用实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒(TaKaRa,Cat.066A)进行qPCR检测，具体步骤参考试剂盒说明书进行，所用引物如上所述(SEQ ID No.5～8)。

蛋白免疫印迹所用抗体如下：CCR2抗体(Gibco Invitrogen，Cat.711255)，NP兔血清多抗(以NP蛋白为抗原(可直接合成，也可通过细胞表达得到)，免疫兔得到)，鼠抗GAPDH单克隆抗体(普利莱，Cat.C1312-100)。

NP蛋白：MSEWSRIAVEFGEQQLNLTELEDFARELAYEGLDPALIIKKLKETGGDDWVKDTKFIIVFALTRGNKIVKASGKMSNSGSKRLMALQEKYGLVERAETRLSITPVRVAQSLPTWTCAAAAALKEYLPVGPAVMNLKVENYPPEMMCMAFGSLIPTAGVSEATTKTLMEAYSLWQDAFTKTINVKMRGASKTEVYNSFRDPLHAAVNSVFFPNDVRVKWLKAKGILGPDGVPSRAAEVAAAAYRNL(SEQ ID No.19)。

结果如图1所示，与转染siNC、siATF6的细胞相比，转染CCR2-siRNA-1、CCR2-siRNA-2后，CCR2的表达量均显著下降；与转染siNC的细胞相比，转染CCR2-siRNA-1、CCR2-siRNA-2、siATF6后SFTSV病毒的感染量与病毒基因的表达均显著下降。结果说明，利用siRNA敲低THP-1细胞内源CCR2表达会显著抑制SFTSV基因(即NP蛋白)的表达，抑制病毒的增殖。

实施例2、慢病毒转染构建CCR2敲除细胞系及CCR2敲除细胞系中SFTSV不同株系的感染和增殖检测。

1、重组质粒构建：根据CCR2基因序列，设计sgRNA靶序列，具体序列如下：

CCR2-sgRNA靶序列：5’-GCAGCAGAGTGAGCCCACAA-3’(SEQ ID No.9)；

对照-sgRNA靶序列：5’-GTATTACTGATATTGGTGGG-3’(SEQ ID No.10)。

合成靶序列，利用BsmBI酶切lentiCRISPR v.2(Addgene，Cat.52961)质粒后将合成的靶序列插入至载体中，分别得到转录靶向CCR2基因sgRNA的重组质粒lentiCRISPR-CCR2与对照质粒lentiCRISPR-CK。

2、慢病毒载体构建：HEK-293T细胞铺板于10cm细胞培养皿，37℃5％ CO

3、慢病毒感染THP-1细胞并筛选稳转细胞：将CCR2-sgRNA慢病毒或对照慢病毒转染THP-1细胞，然后用含4mg/ml的嘌呤霉素的RPMI 1640培养基培养7天，挑选单克隆进行扩大培养。对扩大培养的细胞提取基因组DNA后，利用预先设计的测序引物进行PCR扩增，并将扩增产物送至测序公司测序，获得CCR2敲除的THP-1细胞(记为CCR2-KO细胞系)。

测序引物：CCR2-detect-F：5’-GAGCGGTGAAGAAGTCACCA-3’(SEQ ID No.11)；

CCR2-detect-R：5’-CAGAAGCAAACACAGCCACC-3’(SEQ ID No.12)。

所得细胞系中，CCR2基因序列中的部分序列(WT序列，SEQ ID No.13)被编辑为M1序列(SEQ ID No.14)与M2序列(SEQ ID No.15)，所得细胞系为杂合子。

WT序列：

CTGGTCGTCCTCATCTTAATAAACTGCAAAAAGCTGAAGTGCTTGACTGACATTTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTG

ATCTGCTTTTTCTTATTACTCTCCCATTGTGGGCTCACTCTGCTGCAAATGAGTGGGTCTTTGGGAATGCAATGTG(SEQ ID No.13)；

M1序列：CTGGTCATCCTCATCTTTGGTCTTTGGGAATGCTGGTCTTTGGGAATGCAATGTG(SEQ IDNo.14)；

M2序列：CTGGTCGTCCTCATCTTAATAAACTGCAAAAAGCTGAAGTGCTTGACTGACATTTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTG ATCTGCTTTTTCTTATTACTCTCCCATTGGGGCTCACTCTGCTGCAAATGAGTGGGTCTTTGGGAATGCAATGTG(SEQ ID No.15)。

4、CCR2敲除细胞系中SFTSV不同株系的感染和增殖检测

分别用HBMC16、HNXY2017-50、HNXY2017-66和WCH四个SFTSV不同株系的毒株感染CCR2-KO细胞系，病毒添加量为MOI＝0.1，细胞密度为2×10

实时荧光定量PCR(染料法qPCR)检测胞内SFTSV病毒的基因表达方法同实施例1。

结果如图2所示，与WT细胞相比，CCR2 KO细胞系中SFTSV 4个毒株的感染和增殖过程均受到显著的抑制。

实施例3、CCR2 KO的小鼠骨髓衍生的巨噬细胞BMDM对SFTSV感染和增殖的检测。

一、小鼠骨髓衍生的巨噬细胞原代分离培养

取6周龄的C57BL/6J小鼠(野生型小鼠，WT)及CCR2敲除的小鼠(CCR2

二、BMDM对SFTSV感染和增殖的检测

将分离培养得到的BMDM铺板，用SFTSV毒株HBMC16感染，病毒添加量为MOI＝0.1，细胞密度为1.5×10

探针法qPCR所用引物如下：

SFTSV-S-Forward：5’-AGCCTAATTGGATATGTCAAATTGC-3’(SEQ ID No.16)；

SFTSV-S-Reverse：5’-CGGGTGAAGTGGCTGAAGG-3’(SEQ ID No.17)；

探针：5’-6-FAM-AGCAGCAGCAGCAACCTCAGCAGC-BHQ1-3’(SEQ ID No.18)。

细胞上清中病毒基因的检测：使用病毒RNA提取试剂盒(天根，Cat.DP315-R)进行细胞上清核酸提取，具体步骤参照说明书进行；使用探针法qPCR试剂盒(TaKaRa,Cat.064A)进行qPCR检测，具体步骤参考试剂盒说明书进行，所用引物如上所述(SEQ ID No.16～18)。

结果如图3中B所示，与WT小鼠相比，CCR2敲除小鼠的BMDM中SFTSV的感染和增殖受到显著的抑制。

实施例4、CCR2抑制剂和抗体对SFTSV的感染和增殖的抑制效果检测。

一、CCR2抑制剂处理

在huh-7细胞中，针对CCR2的两种抑制剂RS102895盐酸盐(CCR2 antagonistRS102895Hydrochloride)(MedChemExpress，Cat.No.:HY-18611；CAS No.:1173022-16-6)和CCR2拮抗剂1(CCR2 antagonist 1)(MedChemExpress,Cat.No.:HY-112792；CAS No.:1683534-96-4)的细胞毒性进行检测。具体步骤如下：

Huh-7细胞按1×10

人外周血的单核细胞系THP-1或人肝癌细胞系huh-7铺板，THP-1所用培养基为RPMI 1640培养基(Gibco，Cat.C11875500BT),huh-7所用培养基为DMEM培养基(Gibco,Cat.11965092)，加入针对CCR2的两种抑制剂RS102895盐酸盐和CCR2拮抗剂1处理THP-1和huh-7细胞；RS102895盐酸盐的浓度设置为0、0.20、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00μM，所用溶剂为含2％胎牛血清的RPMI 1640培养基或DMEM培养基，细胞密度为1×10

实时荧光定量PCR(qPCR)检测胞内SFTSV复制的效果：使用细胞总RNA提取试剂盒(天根，Cat.DP430-H)进行细胞核酸提取，具体步骤参照说明书进行；使用实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒(TaKaRa,Cat.066A)进行qPCR检测，具体步骤参考试剂盒说明书进行，所用染料法引物见实施例1(SEQ ID No.5～8)，蛋白免疫印迹方法同实施例1中所述。

结果如图4中C～F所示，CCR2的两种抑制剂RS102895盐酸盐和CCR2拮抗剂1处理后，细胞内SFTSV的基因表达量显著降低，CCR2的两个抑制剂对SFTSV的复制均具有显著的抑制作用，并且这种抑制效果呈剂量依赖的趋势。

二、CCR2抗体处理

人外周血的单核细胞系THP-1或人肝癌细胞系huh-7铺板，THP-1所用培养基为RPMI 1640培养基(Gibco，Cat.C11875500BT),huh-7所用培养基为DMEM培养基(Gibco,Cat.11965092)，加入针对CCR2的抗体anti-human CCR2 antibody(BioLegend,Cat.357202)或同型对照IgG isotype control(BioLegend,Cat.400201)，抗体浓度设置为0.05、0.5、5μg/ml，细胞密度为1×10

病毒载量的检测：使用病毒RNA提取试剂盒(天根，Cat.DP315-R)进行细胞上清核酸提取，具体步骤参照说明书进行；使用探针法qPCR试剂盒(TaKaRa,Cat.064A)进行qPCR检测，具体步骤参考试剂盒说明书进行，所用引物探针同实施例3(SEQ ID No.16～18)。

结果如图5所示，CCR2抗体处理后，其上清病毒载量显著降低，说明针对CCR2的抗体对SFTSV的感染和增殖也具有显著的抑制作用，进一步说明CCR2是SFTSV的感染和增殖的重要靶点。

实施例5、CCR2敲除小鼠模型检测SFTSV感染情况。

方法：取饲养于SPF环境的5周龄CCR2敲除的雌性小鼠(CCR2

结果如图6所示，SFTSV感染第一天后小鼠体重出现下降，但在感染第6天后，小鼠体重逐渐回升，其中CCR2敲除的小鼠体重回升更快，并且其存活率显著高于WT小鼠，说明CCR2基因敲除能显著提升SFTSV感染小鼠的存活率。

实施例6、CCR2抑制剂对SFTSV感染小鼠的治疗效果检测。

取饲养于SPF环境的5周龄野生型C57BL/6J小鼠，设置对照组5只，SFTSV+Vehicle组13只，SFTSV+RS102895组13只。各组小鼠腹腔注射Ⅰ型干扰素封闭抗体(IFNAR1)，1.7mg/只，预处理24h；然后SFTSV+Vehicle组与SFTSV+RS102895组小鼠腹腔接种SFTSV毒株HBMC16病毒100μL/只(2×10

血清病毒载量检测：检测方法同实施例3。

结果如图7所示，与溶剂组(SFTSV+Vehicle)相比，SFTSV+RS102895组(治疗组)小鼠在病毒感染第3天和第5天的血清病毒载量显著降低，并且治疗组生存率得到显著改善。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。