蛋白分子HnRNPM在治疗神经元核内包涵体病药物方面的应用

摘要

本发明公开了一种蛋白分子HnRNPM在缓解或治疗神经退行性疾病制剂中的应用，所述神经退行性疾病为神经元核内包涵体病、震颤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、脑白质病变或多系统萎缩。本发明的有益效果为：本发明所述医用基因工程表达载体能表达蛋白质分子HnRNPM，可能能有效清除NOTCH2NLC相关GGC重复扩展疾病患者体内的聚集物，从而改善神经元细胞损伤，进而可能改善患者痴呆、运动障碍等临床表型。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种蛋白分子HnRNPM在治疗神经元核内包涵体病药物方面的应用。

背景技术

神经元核内包涵体病(Neuronal Intranuclear Inclusion Disease，NIID)是一种以广泛存在的神经元核内包涵体为特征的致死性神经退行性疾病

现有发病机制研究提示，NOTCH2NLC基因GGC重复扩展编码产生的NOTCH2NLC-polyG蛋白可造成过表达该突变的小鼠出现神经元丢失、胶质增生等神经退行性病变，导致小鼠出现运动障碍、早死等现象

发明内容

本申请的主要目的在于提供一种蛋白分子HnRNPM在缓解或治疗神经退行性疾病制剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

蛋白分子HnRNPM在缓解或治疗神经退行性疾病制剂中的应用。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，所述神经退行性疾病为神经元核内包涵体病、震颤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、脑白质病变或多系统萎缩。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，所述蛋白质分子HnRNPM的氨基酸序列为：

MAAGVEAAAEVAATEIKMEEESGAPGVPSGNGAPGPKGEGERPAQNEKRKEKNIKRGGNRFEPYANPTKRYRAFITNIPFDVKWQSLKDLVKEKVGEVTYVELLMDAEGKSRGCAVVEFKMEESMKKAAEVLNKHSLSGRPLKVKEDPDGEHARRAMQKVMATTGGMGMGPGGPGMITIPPSILNNPNIPNEIIHALQAGRLGSTVFVANLDYKVGWKKLKEVFSMAGVVVRADILEDKDGKSRGIGTVTFEQSIEAVQAISMFNGQLLFDRPMHVKMDERALPKGDFFPPERPQQLPHGLGGIGMGLGPGGQPIDANHLNKGIGMGNIGPAGMGMEGIGFGINKMGGMEGPFGGGMENMGRFGSGMNMGRINEILSNALKRGEIIAKQGGGGGGGSVPGIERMGPGIDRLGGAGMERMGAGLGHGMDRVGSEIERMGLVMDRMGSVERMGSGIERMGPLGLDHMASSIERMGQTMERIGSGVERMGAGMGFGLERMAAPIDRVGQTIERMGSGVERMGPAIERMGLSMERMVPAGMGAGLERMGPVMDRMATGLERMGANNLERMGLERMGANSLERMGLERMGANSLERMGPAMGPALGAGIERMGLAMGGGGGASFDRAIEMERGNFGGSFAGSFGGAGGHAPGVARKACQIFVRNLPFDFTWKMLKDKFNECGHVLYADIKMENGKSKGCGVVKFESPEVAERACRMMNGMKLSGREIDVRIDRNA。

上述所述的应用，作为一种优选的实施方案，所述蛋白质分子HnRNPM的核苷酸序列为：

ATGGCGGCAGGGGTCGAAGCGGCGGCGGAGGTGGCGGCGACGGAGATCAAAATGGAGGAAGAGAGCGGCGCGCCCGGCGTGCCGAGCGGCAACGGGGCTCCGGGCCCTAAGGGTGAAGGAGAACGACCTGCTCAGAATGAGAAGAGGAAGGAGAAAAACATAAAAAGAGGAGGCAATCGCTTTGAGCCATATGCCAATCCAACTAAAAGATACAGAGCCTTCATTACAAACATACCTTTTGATGTGAAATGGCAGTCACTTAAAGACCTGGTTAAAGAAAAAGTTGGTGAGGTAACATACGTGGAGCTCTTAATGGACGCTGAAGGAAAGTCAAGGGGATGTGCTGTTGTTGAATTCAAGATGGAAGAGAGCATGAAAAAAGCTGCGGAAGTCCTAAACAAGCATAGTCTGAGCGGAAGACCACTGAAAGTCAAAGAAGATCCTGATGGTGAACATGCCAGGAGAGCAATGCAAAAGGTGATGGCTACGACTGGTGGGATGGGTATGGGACCAGGTGGCCCAGGAATGATTACTATCCCACCCAGTATCCTAAATAATCCCAACATCCCAAATGAGATTATCCATGCATTACAGGCTGGAAGACTTGGAAGCACAGTATTTGTAGCAAATCTGGATTATAAAGTTGGCTGGAAGAAACTGAAGGAAGTATTTAGTATGGCTGGTGTGGTGGTCCGAGCAGACATTCTTGAAGATAAAGATGGAAAAAGTCGTGGAATAGGCACTGTTACTTTTGAACAGTCCATTGAAGCTGTGCAAGCTATATCTATGTTCAATGGCCAGCTGCTATTTGATAGACCAATGCACGTCAAGATGGATGAGAGGGCCTTACCAAAAGGAGATTTCTTCCCTCCTGAGCGTCCACAACAACTTCCCCATGGCCTTGGTGGTATTGGCATGGGGTTAGGACCAGGAGGGCAACCCATTGATGCCAATCACCTGAATAAAGGCATCGGAATGGGAAACATAGGTCCCGCAGGAATGGGAATGGAAGGCATAGGATTTGGAATAAATAAAATGGGAGGAATGGAGGGGCCCTTTGGTGGTGGTATGGAAAACATGGGTCGATTTGGATCTGGGATGAACATGGGCAGGATAAATGAAATCCTAAGTAATGCACTGAAGAGAGGAGAGATCATTGCAAAGCAGGGAGGAGGTGGAGGTGGAGGAAGCGTCCCTGGGATCGAGAGGATGGGTCCTGGCATTGACCGCCTCGGGGGTGCCGGCATGGAGCGCATGGGCGCGGGCCTGGGCCACGGCATGGATCGCGTGGGCTCCGAGATCGAGCGCATGGGCCTGGTCATGGACCGCATGGGCTCCGTGGAGCGCATGGGCTCCGGCATTGAGCGCATGGGCCCGCTGGGCCTCGACCACATGGCCTCCAGCATTGAGCGCATGGGCCAGACCATGGAGCGCATTGGCTCTGGCGTGGAGCGCATGGGTGCCGGCATGGGCTTCGGCCTTGAGCGCATGGCCGCTCCCATCGACCGTGTGGGCCAGACCATTGAGCGCATGGGCTCTGGCGTGGAGCGCATGGGCCCTGCCATCGAGCGCATGGGCCTGAGCATGGAGCGCATGGTGCCCGCAGGTATGGGAGCTGGCCTGGAGCGCATGGGCCCCGTGATGGATCGCATGGCCACCGGCCTGGAGCGCATGGGCGCCAACAATCTGGAGCGGATGGGCCTGGAGCGCATGGGCGCCAACAGCCTCGAGCGCATGGGCCTGGAGCGCATGGGTGCCAACAGCCTCGAGCGCATGGGCCCTGCCATGGGCCCGGCCCTGGGCGCTGGCATTGAGCGCATGGGCCTGGCCATGGGTGGCGGTGGCGGTGCCAGCTTTGACCGTGCCATCGAGATGGAGCGTGGCAACTTCGGAGGAAGCTTCGCAGGTTCCTTTGGTGGAGCTGGAGGCCATGCTCCTGGGGTGGCCAGGAAGGCCTGCCAGATATTTGTGAGAAATCTGCCATTCGATTTCACATGGAAGATGCTAAAGGACAAATTCAACGAGTGCGGCCACGTGCTGTACGCCGACATCAAGATGGAGAATGGGAAGTCCAAGGGGTGTGGCGTGGTTAAGTTCGAGTCGCCAGAGGTGGCCGAGAGAGCCTGCCGGATGATGAATGGCATGAAGCTGAGTGGCCGAGAGATTGACGTTCGAATTGATAGAAACGCTTAA。

本申请的第二方面，提供蛋白分子HnRNPM在制备清除NOTCH2NLC-polyG蛋白聚集物制剂中的应用。

本申请的第三方面，提供一种用于缓解或治疗神经退行性疾病的医用基因工程表达载体，所述医用基因工程表达载体上包含蛋白质分子HnRNPM。

上述一种医用基因工程表达载体，作为一种优选的实施方案，所述医用基因工程表达载体能表达蛋白质分子HnRNPM。

上述一种医用基因工程表达载体，作为一种优选的实施方案，所述医用基因工程表达载体为腺病毒载体。

上述一种医用基因工程表达载体，作为一种优选的实施方案，所述神经退行性疾病为神经元核内包涵体病、震颤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、脑白质病变或多系统萎缩。

本发明的有益效果为：本发明所述医用基因工程表达载体能表达蛋白质分子HnRNPM，可能能有效清除NOTCH2NLC相关GGC重复扩展疾病患者体内的聚集物，从而改善神经元细胞损伤，进而可能改善患者痴呆、运动障碍等临床表型。

附图说明

图1为实施例1所述NOTCH2NLC-98GGC转基因小鼠大脑不同脑区广泛存在polyG聚集物荧光显微扫描图；

图2为实施例1所述NOTCH2NLC-98GGC转基因小鼠神经元丢失荧光显微扫描图；

图3为实施例1所述NOTCH2NLC-98GGC转基因小鼠运动行为受损统计图；

图4为实施例2所述蛋白分子HnRNPM在小鼠脑内表达的荧光显微扫描图；

图5为实施例2所述注射了AAV-HnRNPM病毒的小鼠大脑中polyG聚集物的红色荧光显微扫描图；

图6为实施例2所述注射了AAV-HnRNPM病毒的小鼠小脑中Calbindin免疫阳性神经元的红色荧光显微扫描图；

图7为实施例2所述注射了AAV-HnRNPM病毒的小鼠在开场实验和转棒实验中运动能力统计图；

图8A为实施例3所述立体定位注射(注射量5*10

图8B为实施例3所述立体定位注射AAV病毒到小鼠小脑时，小鼠神经元丢失荧光显微扫描图；

图8C为实施例3所述侧脑室注射AAV-GFP病毒的小鼠大脑荧光显微扫描图；

图8D为实施例3所述侧脑室注射AAV-hnRNPM病毒的小鼠大脑荧光显微扫描图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合案例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

本发明提供了蛋白分子HnRNPM在缓解或治疗神经退行性疾病制剂中的应用。优选地，所述神经退行性疾病为神经元核内包涵体病、震颤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、脑白质病变或多系统萎缩。

本发明所描述蛋白分子HnRNPM的氨基酸序列为：

MAAGVEAAAEVAATEIKMEEESGAPGVPSGNGAPGPKGEGERPAQNEKRKEKNIKRGGNRFEPYANPTKRYRAFITNIPFDVKWQSLKDLVKEKVGEVTYVELLMDAEGKSRGCAVVEFKMEESMKKAAEVLNKHSLSGRPLKVKEDPDGEHARRAMQKVMATTGGMGMGPGGPGMITIPPSILNNPNIPNEIIHALQAGRLGSTVFVANLDYKVGWKKLKEVFSMAGVVVRADILEDKDGKSRGIGTVTFEQSIEAVQAISMFNGQLLFDRPMHVKMDERALPKGDFFPPERPQQLPHGLGGIGMGLGPGGQPIDANHLNKGIGMGNIGPAGMGMEGIGFGINKMGGMEGPFGGGMENMGRFGSGMNMGRINEILSNALKRGEIIAKQGGGGGGGSVPGIERMGPGIDRLGGAGMERMGAGLGHGMDRVGSEIERMGLVMDRMGSVERMGSGIERMGPLGLDHMASSIERMGQTMERIGSGVERMGAGMGFGLERMAAPIDRVGQTIERMGSGVERMGPAIERMGLSMERMVPAGMGAGLERMGPVMDRMATGLERMGANNLERMGLERMGANSLERMGLERMGANSLERMGPAMGPALGAGIERMGLAMGGGGGASFDRAIEMERGNFGGSFAGSFGGAGGHAPGVARKACQIFVRNLPFDFTWKMLKDKFNECGHVLYADIKMENGKSKGCGVVKFESPEVAERACRMMNGMKLSGREIDVRIDRNA。

核苷酸序列为：

ATGGCGGCAGGGGTCGAAGCGGCGGCGGAGGTGGCGGCGACGGAGATCAAAATGGAGGAAGAGAGCGGCGCGCCCGGCGTGCCGAGCGGCAACGGGGCTCCGGGCCCTAAGGGTGAAGGAGAACGACCTGCTCAGAATGAGAAGAGGAAGGAGAAAAACATAAAAAGAGGAGGCAATCGCTTTGAGCCATATGCCAATCCAACTAAAAGATACAGAGCCTTCATTACAAACATACCTTTTGATGTGAAATGGCAGTCACTTAAAGACCTGGTTAAAGAAAAAGTTGGTGAGGTAACATACGTGGAGCTCTTAATGGACGCTGAAGGAAAGTCAAGGGGATGTGCTGTTGTTGAATTCAAGATGGAAGAGAGCATGAAAAAAGCTGCGGAAGTCCTAAACAAGCATAGTCTGAGCGGAAGACCACTGAAAGTCAAAGAAGATCCTGATGGTGAACATGCCAGGAGAGCAATGCAAAAGGTGATGGCTACGACTGGTGGGATGGGTATGGGACCAGGTGGCCCAGGAATGATTACTATCCCACCCAGTATCCTAAATAATCCCAACATCCCAAATGAGATTATCCATGCATTACAGGCTGGAAGACTTGGAAGCACAGTATTTGTAGCAAATCTGGATTATAAAGTTGGCTGGAAGAAACTGAAGGAAGTATTTAGTATGGCTGGTGTGGTGGTCCGAGCAGACATTCTTGAAGATAAAGATGGAAAAAGTCGTGGAATAGGCACTGTTACTTTTGAACAGTCCATTGAAGCTGTGCAAGCTATATCTATGTTCAATGGCCAGCTGCTATTTGATAGACCAATGCACGTCAAGATGGATGAGAGGGCCTTACCAAAAGGAGATTTCTTCCCTCCTGAGCGTCCACAACAACTTCCCCATGGCCTTGGTGGTATTGGCATGGGGTTAGGACCAGGAGGGCAACCCATTGATGCCAATCACCTGAATAAAGGCATCGGAATGGGAAACATAGGTCCCGCAGGAATGGGAATGGAAGGCATAGGATTTGGAATAAATAAAATGGGAGGAATGGAGGGGCCCTTTGGTGGTGGTATGGAAAACATGGGTCGATTTGGATCTGGGATGAACATGGGCAGGATAAATGAAATCCTAAGTAATGCACTGAAGAGAGGAGAGATCATTGCAAAGCAGGGAGGAGGTGGAGGTGGAGGAAGCGTCCCTGGGATCGAGAGGATGGGTCCTGGCATTGACCGCCTCGGGGGTGCCGGCATGGAGCGCATGGGCGCGGGCCTGGGCCACGGCATGGATCGCGTGGGCTCCGAGATCGAGCGCATGGGCCTGGTCATGGACCGCATGGGCTCCGTGGAGCGCATGGGCTCCGGCATTGAGCGCATGGGCCCGCTGGGCCTCGACCACATGGCCTCCAGCATTGAGCGCATGGGCCAGACCATGGAGCGCATTGGCTCTGGCGTGGAGCGCATGGGTGCCGGCATGGGCTTCGGCCTTGAGCGCATGGCCGCTCCCATCGACCGTGTGGGCCAGACCATTGAGCGCATGGGCTCTGGCGTGGAGCGCATGGGCCCTGCCATCGAGCGCATGGGCCTGAGCATGGAGCGCATGGTGCCCGCAGGTATGGGAGCTGGCCTGGAGCGCATGGGCCCCGTGATGGATCGCATGGCCACCGGCCTGGAGCGCATGGGCGCCAACAATCTGGAGCGGATGGGCCTGGAGCGCATGGGCGCCAACAGCCTCGAGCGCATGGGCCTGGAGCGCATGGGTGCCAACAGCCTCGAGCGCATGGGCCCTGCCATGGGCCCGGCCCTGGGCGCTGGCATTGAGCGCATGGGCCTGGCCATGGGTGGCGGTGGCGGTGCCAGCTTTGACCGTGCCATCGAGATGGAGCGTGGCAACTTCGGAGGAAGCTTCGCAGGTTCCTTTGGTGGAGCTGGAGGCCATGCTCCTGGGGTGGCCAGGAAGGCCTGCCAGATATTTGTGAGAAATCTGCCATTCGATTTCACATGGAAGATGCTAAAGGACAAATTCAACGAGTGCGGCCACGTGCTGTACGCCGACATCAAGATGGAGAATGGGAAGTCCAAGGGGTGTGGCGTGGTTAAGTTCGAGTCGCCAGAGGTGGCCGAGAGAGCCTGCCGGATGATGAATGGCATGAAGCTGAGTGGCCGAGAGATTGACGTTCGAATTGATAGAAACGCTTAA。

本发明还提供了蛋白分子HnRNPM在制备清除NOTCH2NLC-polyG蛋白聚集物制剂中的应用。

此外，本发明还提供了用于缓解或治疗神经退行性疾病的医用基因工程表达载体，所述医用基因工程表达载体上包含蛋白质分子HnRNPM。

优选地，所述医用基因工程表达载体能表达蛋白质分子HnRNPM，进一步优选地，所述医用基因工程表达载体为腺病毒载体。

实施例1

1、建立NOTCH2NLC相关GGC重复扩展疾病的转基因小鼠模型

本实施例采用CRISPR/Cas9技术建立Rosa26定点转基因小鼠模型，具体技术路线如下：

①针对Rosa26位点设计gRNA靶序列，体外转录获得gRNA；

②构建含CAG-LSL-NOTCH2NLC(exon1，携带17次GGC或者98次GGC)-WPRE-polyA的donor重组质粒；

③将体外转录的Cas9 mRNA、gRNA及donor重组质粒进行受精卵注射，获得F0代小鼠；

④通过PCR及测序的方法对获得的F0代小鼠进行基因型鉴定；

⑤F0代小鼠与WT小鼠繁殖，获得阳性F1代杂合子小鼠。将阳性F1代杂合子小鼠与EIIa-cre工具鼠杂交，获得NOTCH2NLC全身表达的转基因小鼠模型。

该模型小鼠的特征包括：1、广泛存在的核内聚集物，如图1所示：在荧光显微镜下可见海马、小脑、皮层、纹状体等脑区广泛存在的核内聚集物(绿色荧光所示)。

2、神经元丢失，如图2所示：在荧光显微镜下可见，与对照组(GGC17)小鼠相比，NOTCH2NLC-98GGC转基因浦肯野细胞(绿色荧光所示)数量显著减少。

3、运动行为受损，如图3所示：与野生型小鼠和GGC17对照小鼠相比，NOTCH2NLC-98GGC转基因小鼠在开场实验的运动总距离更少，停留在转棒上的时间更短。

经研究发现所建模型能够很好的模拟该类疾病的典型病理表型和临床表型。

备注：Rosa26位点位于小鼠6号染色体上，在该位点敲入外源基因，不会影响其他内源性基因的表达和功能发挥，且在所有细胞类型和发育阶段均有广泛表达，因此是定点敲入外源基因时最经典的安全位点。

实施例2

蛋白分子HnRNPM在缓解或治疗神经退行性疾病制剂中的应用。

发明人通过免疫沉淀技术、蛋白质谱分析技术、分子生物学技术等从NOTCH2NLC-polyG蛋白的相互作用蛋白中鉴定出一个调控RNA转录的蛋白分子HnRNPM。

利用实施例1所述NOTCH2NLC-98GGC TG小鼠模型16只，随机平均分成2组，其中一组注射AAV-hnRNPM病毒，另一组注射AAV-GFP病毒(作为对照组)。

具体为将HnRNPM通过腺相关病毒(AAV)载体以眼眶静脉注射的方式递送至小鼠全身(注射量为：1.25*10

备注：现有研究表明过表达GFP通常不会造成细胞损伤，是学界最常用的对照组。

具体操作为：

①avertin麻醉小鼠，固定其头和四肢，开胸腔暴露心脏。灌注针插入左心室，右心耳剪开口后，先灌注生理盐水后灌注4％多聚甲醛。解剖脑组织浸泡于4％多聚甲醛中，于4摄氏度下摇床上处理24小时，再更换溶液为30％蔗糖溶液脱水处理48小时。

②制备冰冻切片。OCT包埋脱水处理后的脑组织，置于-20摄氏度冰冻切片机平衡1小时。准备干净的12孔板，孔内加入含防腐剂的PBS缓冲液。设置切片厚度为30um，连续切片。每8片收集在同一孔内，连续收集目标脑区前后所有切片。

③免疫荧光染色。取脑片用PBS洗3次，每次10分钟；0.3％PBST透化1小时；用含3％BSA+2％NGS+0.1％PBST室温封闭1小时；加入一抗，4℃孵育过夜；PBS洗3次，每次10分钟；加荧光二抗和Dapi 30分钟，避光，4℃；PBS洗3次，每次10分钟；抗淬灭封片剂封片后，荧光显微镜观察结果并拍照，结果如图4和图5所示。

从图4可以看出：在荧光显微镜下可见，AAV-HnRNPM(红色荧光所示)在皮层、海马、纹状体、小脑等脑区成功表达。

从图5可以看出：注射了AAV-HnRNPM病毒的小鼠大脑中polyG聚集物(红色荧光所示)显著低于AAV-GFP对照组。过表达蛋白分子HnRNPM能够有效清除NOTCH2NLC-polyG蛋白聚集物。

从图6可以看出：注射了AAV-HnRNPM病毒的小鼠小脑中Calbindin免疫阳性(红色荧光所示)的浦肯野细胞数目显著高于AAV-GFP对照组。过表达蛋白分子HnRNPM能够有效改善神经元丢失。

从图7可以看出：注射了AAV-HnRNPM病毒的小鼠在开场实验和转棒实验中，表现均优于AAV-GFP对照组。过表达蛋白分子HnRNPM能够显著改善小鼠运动障碍。

上述实验结果证明，HnRNPM能够有效的清除NOTCH2NLC-polyG蛋白聚集物，改善神经元丢失、运动功能障碍等表型。

实施例3

蛋白分子HnRNPM在缓解或治疗神经退行性疾病制剂中合适剂量的研究

HnRNPM是一种调控mRNA剪接的蛋白，含量过量或者计量不足均有可能导致转录失调。本实施例利用小鼠模型，探索了过表达不同剂量hnRNPM对小鼠的影响。

当定点注射1ul滴度为5*10

从图8A和图8B可以看出：局部表达hnRNPM含量过高时会造成细胞毒性。

当调整AAV-HnRNPM病毒的注射浓度和注射方式(10ul，1*10

从图8C和图8D可知：注射较高剂量AAV-HnRNPM病毒(10ul，1*10

当采用眼眶静脉注射AAV-HnRNPM病毒(10ul，1*10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。