一个苦瓜象耳豆根结线虫病抗性SNP标记及应用

摘要

本发明公开了一个苦瓜象耳豆根结线虫病抗性SNP标记及应用。本发明通过鉴定不同苦瓜种质对象耳豆根结线虫病的抗性，并结合全基因组重测序技术定位到了一个与象耳豆根结线虫病抗性连锁的SNP标记。该SNP标记在染色体上的位置为Chr8‑32381360，并定位在McRBK2基因的编码区。进一步针对该SNP位点开发了方便检测的专用引物对，经验证该引物对能精确检测不同苦瓜种质在该位点的基因型，可用于苦瓜象耳豆根结线虫病抗性育种的分子标记辅助选择。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一个苦瓜象耳豆根结线虫病抗性SNP标记及应用。

背景技术

根结线虫是一类植物寄生线虫，世界各地都有分布，每年由根结线虫病导致的重要经济作物的损失占总的5％。目前，世界已报道的线虫种类超过100个，寄主植物达到3000种。象耳豆根结线虫是1983年在中国海南儋州象耳豆树上发现的，后续研究发现该线虫也可寄生辣椒、西瓜、黄瓜和苦瓜等多种经济作物。与其它线虫不同的是，象耳豆根结线虫对抗线虫基因不敏感，据报道该线虫能够寄生含有Mi抗线虫基因的番茄植株。象耳豆根结线虫已成为我国南方热带地区的优势线虫种群，如何有效、经济且环保的防治象耳豆根结线虫病是目前叩待解决的问题。

苦瓜是葫芦科苦瓜属的一个栽培种，原产于印度，广泛种植于热带、亚热带和温带地区，是重要的药食同源蔬菜。苦瓜为一年生蔓生草本植物，雌雄同株异花，染色体数2n＝22，别名癞瓜、癞葡萄、凉瓜和锦荔枝等。苦瓜以食用嫩瓜为主，瓜表面有明显的瘤皱，果肉脆嫩，味微苦，有刺激食欲的作用。苦瓜有很高的营养价值，每100克嫩瓜含蛋白质0.9克，并且含有丰富的维生素、多种氨基酸和胡萝卜素等成分。现代医学研究证明苦瓜富含苦瓜素和苦瓜甙，具有降血糖、抗癌、抑菌和消炎等功效，“青则苦寒涤热，明目清心，熟则养血滋肝，润脾补肾”，是对苦瓜功效的描述。

分子标记是以个体间基因组DNA变异为基础的遗传标记，广泛应用于基因作图、基因克隆、遗传多样性和育种研究。分子标记包括RAPD标记、STS标记、SSR标记、AFLP标记、SCAR标记和CAP标记等，这些标记作为分子标记辅助选择技术在育种工作中发挥了巨大的作用，但此类标记数量有限，在一定程度上不能满足科学发展的需要。SNP标记作为第三代分子标记数量巨大，据统计人类基因组大约每1000bp就会出现一次SNP。SNP标记数量多，分布广泛，并且可以高通量检测，在作物育种和功能基因组学的研究中发挥的作用越来越大。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一个苦瓜象耳豆根结线虫病抗性SNP标记及应用。应用本发明在苦瓜苗期通过提取DNA和PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测被检植株是否具有象耳豆根结线虫病的抗性。本发明可为分子标记辅助育种技术在苦瓜育种中的应用提供支撑。

本发明通过对不同苦瓜种质的象耳豆根结线虫病鉴定和全基因组关联分析，发现一个苦瓜象耳豆根结线虫病抗性SNP标记，该SNP标记在染色体上的位置为Chr8-32381360，并定位在McRBK2基因编码区的第1014位碱基(G/T)。

含有上述SNP位点的序列如序列表中SEQ ID NO:4(Seq I)和SEQ ID NO:5(SeqII)所示。SNP位点位于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示序列的第251位。

进一步的，本发明还提供了一种用于扩增上述的SNP标记的引物对，包括引物对I和引物对II，所述引物对I包括引物Chr8-32381360F-G和引物Chr8-32381360R，所述引物对II包括引物Chr8-32381360F-C-T和引物Chr8-32381360R；

引物Chr8-32381360F-G的核苷酸序列为：CTGTTTGATGCAGATACTTCGCG；

引物Chr8-32381360R的核苷酸序列为：AGAGGCTTTGCCTGAAATGA；

引物Chr8-32381360F-C-T的核苷酸序列为：CTGTTTGATGCAGATACTCCGCT。

进一步的，本发明提供所述的SNP标记或所述的引物对在鉴定苦瓜象耳豆根结线虫病抗性方面的应用。

判断苦瓜对象耳豆根结线虫病抗性的方法包括：利用所述的引物对扩增苦瓜基因组DNA，若引物对I扩增的产物有条带而引物对II扩增产物无条带时说明待测DNA样本为G/G基因型，待测材料为感病(低抗病)，引物对I扩增的产物无条带而引物对II扩增产物有条带时说明待测DNA样本为则为T/T基因型，待测材料为高抗病；引物对I扩增的产物有条带，引物对II扩增产物也有条带时说明待测DNA样本为G/T基因型，待测材料感病(抗性中等)。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明获得了一个苦瓜象耳豆根结线虫病抗性SNP标记，该SNP标记位于苦瓜RBK2基因编码区的第1014位碱基，具体位置为Chr8-32381360。利用本发明所提供的SNP标记，可快速准确的分析不同苦瓜种质对象耳豆根结线虫病的抗性，加速分子标记辅助选择技术在苦瓜抗病育种中的应用。

附图说明

图1：PCR扩增产物电泳图。利用Chr8-32381360F-G与Chr8-32381360R组成的引物对和Chr8-32381360F-C-T与Chr8-32381360R组成的引物对扩增不同苦瓜种质的基因组DNA。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

苦瓜象耳豆根结线虫病抗性鉴定：

将苦瓜种子置于温水过夜泡种，再用湿布包裹放置于37℃培养箱催芽2～3天，出芽后播种于穴盘育苗。象耳豆根结线虫采用易感空心菜根际进行扩繁培养，待到卵块接近成熟时，将卵块从空心菜根部取下培养成二龄幼虫，并将二龄幼虫配制浓度为600头/ml的悬浮液。待苦瓜幼苗长至两叶一心时移植到装有灭菌营养土的小塑料盒中(长6cm×宽6cm×高7.5cm)，并将配制好的象耳豆根结线虫悬浮液通过根际打孔法接种。每盒1株，每份材料5次重复。将小塑料盒完全随机放置于托盘上，放置28℃温室培养，每天检查土壤湿度，保持湿润。培养45天后，用自来水清洗苦瓜根部，统计根结占根部百分比。0级；整株根系无根结；1级：1％～5％的根系有根结；2级：6％～25％的根系有根结；3级：26％～50％的根系有根结；4级：51％～75％的根系有根结；5级：75％以上的根系有根结。参考Nyczepir等(1999)计算根结指数(gall index,GI)；

根结指数(GI)＝单株苦瓜根结数量/单株苦瓜根系鲜重。

实验步骤

(1)利用CTAB法提取待测苦瓜种质的基因组DNA，将DNA浓度调整为50ng/μL。

(2)在上海生工生物公司合成引物对I(Chr8-32381360F-G/Chr8-32381360R)和引物对II(Chr8-32381360F-C-T/Chr8-32381360R)，并将引物稀释为10μmol/L，以基因组DNA为模板，分别利用引物对I和引物对II进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)，扩增获得PCR产物。

引物Chr8-32381360F-G的核苷酸序列为：CTGTTTGATGCAGATACTTCGCG；

引物Chr8-32381360R的核苷酸序列为：AGAGGCTTTGCCTGAAATGA；

引物Chr8-32381360F-C-T的核苷酸序列为：CTGTTTGATGCAGATACTCCGCT。

(3)20μL的PCR反应体系包含：2×

(4)PCR扩增反应程序:95℃预变性5min；95℃变性30S，63℃退火30S，72℃延伸40S，35个循环；72℃延伸10min，16℃5min。

(5)将扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。对同一个DNA样本，先上样引物对I扩增的产物，再上样引物对II的扩增产物。引物对I扩增的产物有条带而引物对II扩增产物无条带时说明待测DNA样本为G/G基因型，待测材料为感病，引物对I扩增的产物无条带而引物对II扩增产物有条带时说明待测DNA样本为则为T/T基因型，待测材料为抗病；引物对I扩增的产物有条带，引物对II扩增产物也有条带时说明待测DNA样本为G/T基因型，待测材料感病。

表1.不同苦瓜材料检测结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。