一种基于微生物生态进化与生境改良的石油烃降解微生物群落筛选方法

摘要

本发明属于土壤污染修复技术领域，公开了一种基于微生物生态进化与生境改良的石油烃降解微生物群落筛选方法。本发明通过联合采用菌源土壤的生境改良处理措施和人工微生物群落筛选技术，筛选高降解性能和土壤适应性的石油降解微生物群落。采用本发明提出的筛选方法得到的降解功能菌群多样性程度高、菌群组成均匀、石油烃降解相关菌属丰富。高度多样性的菌群充分发挥了多菌种间的功能协同及互补作用，菌群的生态功能增加，土壤环境适应性增强，在多种环境因子胁迫下仍保持稳定的降解活性。该方法操作简单，成本低廉，实用性强，在石油污染土壤修复微生物强化技术方面具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于土壤污染修复技术领域，具体涉及一种筛选石油烃高效降解微生物群落的方法。

背景技术

石油作为人类能源供应的主要支柱，需求量及产量持续上升。石油开采、炼化“跑冒滴漏”及事故性排放导致了普遍的石油土壤污染。生物修复(尤其是微生物修复)具有绿色环保、修复费用低、无二次污染等特点，是最具发展前景的石油污染土壤修复策略。生物强化技术是微生物修复技术之一，是指向污染土壤中投加石油烃降解微生物来加快污染物降解。

目前用于污染修复的微生物菌剂主要有两类：单一菌种和复配菌群。已经筛选得到的具备石油烃降解功能的单一菌种多达200余种，归属于70多个属。文献(Tremblay,J.,et al."chemical dispersants enhance the activity of oil-and gas condensate-degrading marine bacteria."ISME Journal,11(2017):2793-2808)报道微生物通常通过氧化反应来降解各种石油烃(如脂肪族和多环芳烃)，然而，不同细菌的加氧酶类型不同，可代谢的成分也不同，单一菌种只能代谢其中的一种或几种物质，几乎没有一种微生物能降解整个石油烃组分。比如文献(Liu,C.,et al."Bioremediation of n-alkanes and theformation of biofloccules by Rhodococcus erythropolis NTU-1under varioussaline conditions and seawater."Biochemical Engineering Journal,45(2009):69-75)发现红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)只能去除部分正构烷烃或支链烷烃。此外，筛选的单一菌种，通常在实验室的液态培养基中表现出良好的降解活性，一旦投加在污染土壤中，降解率显著下降，达不到预期的修复效果。主要原因是单一菌种受生态位竞争、菌间拮抗以及温度、pH、盐度等环境因子的制约，很难在污染土壤中存活并发展成为优势菌种来发挥其降解功能，导致降解效果显著下降。据微生物基因组测试研究，98％以上的菌株为营养缺陷型，它们依赖于外部营养或来自其他细胞的副产物，在自然界中常不能作为单一的菌株存在，而是与其他微生物共同存活，这从本质上解释了单一菌株不能用于土壤修复的原因。经上述分析，构建降解菌群是解决单一菌种不足的有效途径之一。

目前有关石油烃降解菌群的研究主要围绕复配菌群进行。已报道的石油烃降解复配菌群均是按照一定比例将具备石油烃降解相关功能的单一菌种混合而成。文献(Xia,M.,et al."Enhanced crude oil depletion by constructed bacterial consortiumcomprising bioemulsifier producer and petroleum hydrocarbon degraders."Bioresource Technology,282(2019):456-463)评估了3种不同底物利用能力的细菌(Serratia proteamaculans S1BD1(底物谱相对宽)、Alcaligenes sp.OPKDS2(烷烃和苯系物)、Rhodococcus erythropolis OSDS1(苯系物))及其组合体系对石油烃的去除效果。结果显示在原油浓度1％v/v的MSM培养基中，接种15天后，S1BD1，OPKDS2，OSDS1的石油烃降解率分别为68.0％，63.7％，54.9％，而组合菌群的去除率高达85.26±2.56％。构建复配菌群通常是以石油烃降解功能互补或加强为原则，并没有针对性的考虑到环境因子的制约问题，因此复配菌群的确改善了单一菌种对石油烃代谢底物谱窄的问题，但环境适应差的问题并没有得到解决，在石油污染土壤基质中的修复效果并不理想。比如文献(Ghazali,F.M.,et al."Biodegradation of hydrocarbons in soil by microbial consortium."International Biodeterioration&Biodegradation,54(2004):61-67.)考察了复配菌群1(Pseudomonas aeruginosa strains S4.1 and S5.3和Bacillus sp.Strain S3.2.)及菌群2(Pseudomonas aeruginosa strains S4.1 and S5.3 and Bacillus sp.StrainS3.2.Bacillus sp.strains 113i and O63和Micrococcus sp.strain S)对人工柴油和机油污染土壤的修复效果，接种60天后，菌群1和菌群2对污染土壤中C14-C24的去除率分别为9.48％-25.5％及18.57％-52.6％。文献(Wu,M.,et al."Effect of bioaugmentation andbiostimulation on hydrocarbon degradation and microbial community compositionin petroleum-contaminated loessal soil."Chemosphere,237(2019):124456)报道了由Pseudomonas,Achromobacter,Bacillus和Azomonas复配的微生物菌群对原油污染土壤的修复效果，结果显示，在培养12周后，原油的去除率仅为14％。

微生物群落由具有不同基因和功能的微生物构成，结构稳定、生态功能丰富，生产力较高，抵抗环境胁迫能力强。文献(Isbell,F.,et al."Biodiversity increases theresistance of ecosystem productivity to climate extremes."Nature,526(2015):574-577)发现微生物多样性越高，群落生态功能越丰富，受外界环境胁迫的影响越小。目前已报道的复配菌群通常由10个以内的单一菌种构成，菌群的多样性程度很低，生态功能薄弱，无法抵抗外界环境的胁迫，在污染土壤基质中适应性差，因此筛选多样性程度高、生态功能丰富的降解微生物群落，是构建高降解性能、土壤适应性的石油降解微生物群落的一个科学策略和有效途径。

人工微生物群落筛选方法是一种具有巨大应用前景的微生物群落构建技术，被推荐为未来微生物污染修复的主要研究方向。该方法利用微生物生态进化原理，在群落水平上通过人工选择来筛选具有最高群落功能的群落，技术操作简单，已被应用于生物工程、生物化工领域，但在环境污染修复领域几乎还未得到应用。

目前石油降解功能微生物筛选的方法，均是以石油污染的土壤为菌种来源，经富集驯化培养后，进行分离纯化，最终获得石油污染降解的单一菌种。然而值得关注的是，微生物群落的结构和功能与生境条件密切相关。文献(Shahsavari E.,et al.,"Plantresidues--a low cost,effective bioremediation treatment for petrogenichydrocarbon-contaminated soil."Science of the Total Environment,443(2013):766-774)发现土壤被石油污染后，其微生物多样性及活性显著减少。以此为菌源会对后续高效降解菌种的筛选产生严重的负面影响，尤其是对高度多样性菌群的筛选工作。文献(Huang J.,et al."Enrichment of the soil microbial community in thebioremediation of a petroleum-contaminated soil amended with rice straw orsawdust."Chemosphere,224(2019):265-271)提到向石油污染土壤中添加秸秆等有机残体，可增加土壤保水性能、改善土壤透气与机械结构，还能通过分解释放木质素等组分以补充土壤微生物的营养物质，增加污染土壤中微生物总体丰度和活性，以及TPHs、PAHs等污染物降解菌的丰度或降解功能基因拷贝数。土壤微生物群落及生态功能与土壤温度紧密相关，通常表现出明显的季节性特征。文献(Buckeridge KM.,et al."The seasonal patternof soil microbial community structure in mesic low arctic tundra."SoilBiology&Biochemistry,65(2013):338-347)表明中高纬度地区的土壤微生物群落在冬季时生物量较高、生物多样性高，以适应低温的微生物为主，真菌占比较高，而在其他季节时菌落结构相似，以细菌为主。文献(Sun X.,et al."Hydrocarbon-degrading microbialcommunities are site-specific and their activity is limited by synergies intemperature and nutrient availability in surface ocean waters."Applied AndEnvironmental Microbiology,85(2019):e00443-19)报道，热带、亚热带和极地环境样品的土著微生物保持TPHs降解活性的温度范围分别为19℃-38℃、19℃-38℃和4℃-30℃，极地样本的土著微生物具有低温适应性且同等条件下降解活性最高。据以上分析可知，秸秆加入、菌源土壤低温季节采集或筛选等生境改良处理，使土壤微生物筛选与富集条件更接近于土壤实际条件，可激活土壤中降解功能微生物及其紧密联系的微生物，可能有利于筛选与富集具有石油烃降解功能的微生物，提高所筛选微生物群落的降解活性和生境适应性。目前并没有与菌源土壤改良相关的报道。

因此，本发明围绕高效石油降解微生物的筛选及土壤适应性问题，提出联合采用菌源土壤的生境改良处理措施和人工微生物群落筛选技术，构建高降解性能和土壤适应性的石油降解微生物群落。本发明为高效石油降解微生物筛选提供新的技术思路，助推石油污染土壤微生物修复的技术突破与应用推广。

发明内容

本发明针对现有石油烃污染土壤修复微生物土壤适用性差的问题，提出了一种筛选石油烃高效降解微生物菌群的方法。该方法联合采用菌源土壤的生境改良处理措施和人工微生物群落筛选技术，筛选与构建高效石油降解微生物群落。

本发明的技术方案如下：

一种基于微生物生态进化与生境改良的石油烃降解微生物群落筛选方法，步骤如下：

(1)选择在冬季采集石油污染土壤

气温要求为日均温-20℃-5℃，当气温保持该温度范围30-90天后，可采集石油污染土壤。

(2)添加玉米秸秆或其他农林废弃物对石油烃污染土壤进行改良预处理

将晾干后的玉米秸秆或其他农林废弃物，裁剪成1–3cm碎片，均匀混入风干过筛后的污染土壤中，秸秆添加量为土壤质量的0.5％-2％，调节土壤含水量为其饱和持水量的75％-90％，放入人工气候箱中培养，培养条件为20℃-35℃，培养周期3–5个月。期间注意观察土壤湿度情况，及时补充水分，使土壤含水率基本维持恒定(饱和持水量的75％-90％)。

(3)石油烃降解人工微生物群落的筛选

将上述改良培养后的土壤放置于以柴油或原油为唯一碳源的无机盐培养基(MSM)中进行培养，柴油或原油的添加量为无机盐培养基体积的1％-5％。使柴油或原油为唯一的碳源，在恒温振荡培养箱中进行培养，培养条件为15℃-37℃，5d-10d为一个培养周期，共需培养7–10个周期，即可获得稳定的降解菌群。每代培养结束时，用二氯甲烷对残余石油烃进行萃取，采用重量法对残余石油烃含量进行测定，评估其降解能力。当连续3次检测的降解率稳定时，即可直接收集菌液，进行菌种保藏，获得石油烃降解人工微生物群落。

所述的无机盐培养基(MSM)含有MgSO

本发明的有益效果：本发明通过联合采用菌源土壤的生境改良处理措施和人工微生物群落筛选技术，筛选高降解性能和土壤适应性的石油降解微生物群落。首先选择在冬季采集石油污染土壤，可以采集到温度适应范围广(尤其是低温适应性)，且石油烃降解活性高的相关微生物；其次向采集的石油污染土壤中添加玉米秸秆或其他农林废弃物可以明显提高污染土壤中微生物的生物量、多样性及活性，并且可以富集得到石油烃降解相关菌属。最后以上述两个步骤改良后的土壤为菌源土壤，利用人工微生物群落筛选技术进行石油烃降解菌群筛选，该筛选技术利用微生物生态进化原理，可直接在群落水平上通过人工选择筛选得到具备最高群落功能的群落，无需进行分离、纯化、复配等操作。采用本发明提出的筛选方法得到的降解功能菌群多样性程度高、菌群组成均匀、石油烃降解相关菌属丰富。高度多样性的菌群充分发挥了多菌种间的功能协同及互补作用，菌群的生态功能增加，土壤环境适应性增强，在多种环境因子胁迫下仍保持稳定的降解活性。该方法操作简单，成本低廉，实用性强，在石油污染土壤修复微生物强化技术方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是筛选的石油烃降解人工微生物群落结构图。

图2是筛选的石油烃降解人工菌群对柴油及原油的降解效果图。

图3是筛选的石油烃降解人工菌群的降解效果图，(a)是在温度影响下，(b)

是在盐度影响下，(c)是在pH值影响下。

图4是筛选的石油烃降解人工菌群对石油烃污染土壤的修复效果图。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的实施方式。

实施例1生境改良处理对石油污染土壤微生物菌群结构的改良效果

在冬季采集石油污染土壤，将采集的污染土壤在室内自然风干，称取200g风干并20目过筛的石油污染土壤放入方形塑料盒中，称取1g裁剪为1～3cm碎片的玉米秸秆，均匀混入土壤中。添加80ml超纯水，调整土壤含水率为其饱和持水量的80％-90％。放入人工气候箱中培养，培养条件为28℃，湿度80％，无光照，培养周期2个月。每隔3天，补充适量的水，维持相对恒定的土壤含水量。以不加秸秆处理的土壤为对照，按上述步骤进行培养。待培养结束后，取2g污染土壤，进行高通量扩增子测序，对土壤微生物菌群结构进行分析。CK(对照组-未进行秸秆处理)和CK.S(秸秆处理组)的α多样性指数Shannon，Chao1，ACE分别为5.148，1531.964，1596.814和9.241，2692.496，2709.364，土壤微生物群落的多样性及均匀度增加45％左右。结果表明秸秆添加处理可改善石油污染土壤的微生态，显著增加土壤中微生物群落物种多样性及均匀度。由物种注释结果发现，在属水平，CK组以Sporosarcina为优势菌属，Galbitalea，Pedobacter，Lactobacillus为主要菌属。而CK.S组，未被注释的菌属占绝大数比例，在已注释菌属中，Subgroup_10，Sphingomonas，Pseudomonas，Bacillus，Altererythrobacter为主要菌属，其中除Subgroup_10外，其余4个主要菌属均具备石油烃降解功能，表明填埋秸秆有助于富集石油烃降解相关微生物。

实施例2采用人工微生物菌群筛选技术进行高效降解菌群的筛选

称取5g改良后的土壤，放置50ml无机盐培养基(MSM)中，添加1％v/v柴油，使柴油为唯一的碳源，在恒温振荡培养箱中进行培养，培养条件为28℃，180rpm，培养时间为7d。培养结束后，取500μl的培养液于50ml新鲜的MSM中，继续进行培养。7天为一个培养周期，进行传代培养，传代培养7-10次，即可获得稳定的降解菌群。每代培养结束时，用二氯甲烷对残余石油烃进行萃取，采用重量法对残余石油烃含量进行测定，当连续3次检测的降解率稳定时，取500μl的菌液于新鲜的100ml LB培养基中。在恒温振荡培养箱中进行培养，培养条件为28℃，180rpm，培养期间每隔两小时，取样，用紫外分光光度计，在波长600nm下，检测其OD

所述LB培养基配方为：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，用超纯水定容至1L。

实施例3筛选的高效降解菌群对柴油及原油的降解情况

取出-80℃保存菌种，取100μl至10ml LB培养基中，在28℃、180rpm的条件下进行复苏，待OD

实施例4筛选的高效降解菌群对环境因素耐受性实验

(1)温度对筛选高效菌群柴油降解效果的影响

添加8000mg/L的柴油至MSM培养基中，以5％(v/v)的接种量进行微生物接种，分别在10℃，15℃，20℃，28℃，35℃，180rpm下培养，在培养的第7天，14天，21天，30天进行取样，检测总石油烃的去除率。结果如图3(a)所示，培养30天后，在培养温度为10℃-35℃时的去除率为60.5％-92.9％。表明筛选菌群具有宽泛的温度耐受范围，尤其是低温。对照菌群在培养温度为10℃-35℃时的去除率为15.5％-78.9％，当温度低于20℃时的降解率均在35％以下。

(2)盐度对筛选高效菌群柴油降解效果的影响

添加8000mg/L的柴油至MSM培养基中，添加一定量的NaCl，使得培养基NaCl浓度分别为10、20、40、60、80g/L，以5％(v/v)的接种量进行微生物接种，在28℃、180rpm下培养14d后，检测总石油烃的去除率。结果如图3(b)所示，盐度浓度为0～80g/L时的去除率为24.6％-92.3％，当盐浓度为40g/L时，对应的去除率为69.9％，而当盐浓度上升至60g/L时，去除率降为27.1％，说明筛选菌群可耐受60g/L以下的盐度。对照菌群在盐度浓度为0～80g/L时的去除率为9.3％-65.3％，可耐受20g/L以下的盐度。

(3)pH值对筛选高效菌群柴油降解效果的影响

添加8000mg/L的柴油至MSM培养基中，设置培养基初始pH值分别为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11、12，以5％(v/v)的接种量进行微生物接种，在28℃、180rpm下培养14d后，检测总石油烃的去除率。结果如图3(c)所示，筛选菌群在中性、碱性甚至强碱性环境下，其降解不受pH变化的影响(P＝0.121)，培养14天后，总石油烃去除率均在90％以上，在pH＝11条件下的去除率最高，可达98.8％。对照菌群仅在pH＝6.5–8.5内，表现出降解活性。

实施例5筛选的高效降解菌群对石油烃污染土壤的修复效果

选择了6种不同污染程度的土壤(CR(原油)、DS-1(柴油)、DS-2(柴油)为人工污染土壤；PJ-1、PJ-2采集自盘锦油井区，DL采集自大连某石化场地)。用实施例3中所述的筛选菌液复苏及扩培的方法，准备好菌液。以10％的接种量进行接种，在培养30d和60d后取样，检测残余总石油烃含量。检测结果显示，在接种30d和60d后，筛选菌群对CR、DS-1、DS-2、PJ-1、PJ-2、DL中总石油烃的去除率分别为90.3％和92.1％，80.9％和84.1％，72.4％和77.1％，75.1％和79.2，76.1％和81.7％，81.6％和88.9％。筛选菌群在接种30d后的总石油烃去除率已基本达到稳定。对照菌群对以上六种污染土壤的总石油烃降解率为25.3％-45.6％。