柳叶蜡梅挥发油在制备治疗脂多糖诱导炎症的抗炎产品中的应用

摘要

本发明公开柳叶蜡梅挥发油在制备治疗脂多糖诱导炎症的抗炎产品中的应用。采用细胞实验的方法研究了THP‑1单核细胞诱导至巨噬细胞的方法及过程，并研究了柳叶蜡梅挥发油在THP‑1巨噬细胞中对脂多糖诱导炎症的保护作用及其机制。实验中探索了THP‑1单核细胞的生长曲线以及生长状态，将单核细胞诱导成巨噬细胞的佛波酯浓度，LPS对THP‑1巨噬细胞的增殖活性影响，柳叶蜡梅挥发油对THP‑1巨噬细胞的毒性区间，柳叶蜡梅挥发油的保护作用及其机制。基于柳叶蜡梅挥发油良好的抗炎保护作用以及THP‑1单核细胞存在于血液中的细胞特性，其对增强大众尤其是亚健康人员的免疫力、抵抗力等具有广阔前景，为未来柳叶蜡梅的市场推广提供理论基础，并提高柳叶蜡梅相关产业的经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，进一步涉及物质的新的医药用途，具体涉及柳叶蜡梅挥发油在制备治疗脂多糖诱导炎症的抗炎产品中的应用。

背景技术

柳叶蜡梅，又称“香风茶”、“香风草”或“山蜡梅”，具有较高的饮用和观赏价值，卫计委公告2014年第6号名单中把柳叶蜡梅归于新资源食品并逐渐获得人们的重视。中医中记载柳叶蜡梅具有解表祛风、理气化痰的功效，但是目前对于柳叶蜡梅的研究多注重于其不同产地不同处理方式的组成成分、工艺研究等，而关于柳叶蜡梅的生物活性研究较少。挥发油是柳叶蜡梅的重要活性成分之一，但关于柳叶蜡梅挥发油对人单核细胞白血病(THP-1)巨噬细胞的研究还未见报道，深入了解柳叶蜡梅挥发油的生物活性对柳叶蜡梅的药用和食用价值的运用具有重要依据，为未来柳叶蜡梅的产业化应用及相关产品的推广建立扎实的理论基础。

THP-1是一种广泛存在于人体血液中的单核细胞，被广泛用于单核细胞和巨噬细胞相关的机制、信号通路以及营养和药物运输等研究中。有研究表明，在新冠病毒感染中，存在于全身血液中的THP-1也参与炎症的相关免疫机制中，在调控细胞炎症和细胞焦亡中占有重要地位。因此了解THP-1单核细胞到THP-1巨噬细胞的诱导过程，以及活性物质对LPS诱导THP-1巨噬细胞炎症的生理作用，有利于了解活性物质在全身血液中发挥作用的潜力，并借助血液循环系统性地增强普通人群尤其是亚健康人群的免疫力、抵抗力等。

柳叶蜡梅虽然很早之前就被人们认识，但是目前对它的应用多注重于它的饮用价值，且集中于产地，缺乏系统的、规模化的产品认识和生产，依据柳叶蜡梅的功能特点开发出一种有针对性的生物活性产品，有利于柳叶蜡梅的推广以及开发应用，为柳叶蜡梅相关上下游产业带来具有前景的收益。

近年来，柳叶蜡梅的药用价值被广泛研究，比如黎鑫等公开了柳叶蜡梅化学成分及生物活性研究进展，其描述了柳叶蜡梅的药理活性，包括改善肌肉品质和消化道形态、抗氧化活性、抑菌活性、免疫调节作用、降脂作用、保护肠胃和肝脏作用、血管保护、抑制病毒、抗肿瘤活性等，但是该文献未具体描述柳叶蜡梅的作用机制。徐杰等公开了山蜡梅叶挥发油抗急性肺损伤的分子作用机制分析，其基于网络药理学和分子对接技术对山蜡梅叶挥发油(CLO)治疗急性肺损伤(ALI)的作用机制进行预测，通过脂多糖(LPS)诱导建立ALI模型，测定大鼠血清中白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平，免疫组化分析IL-17蛋白在ALI大鼠肺组织中的表达水平，但是目前还没有柳叶蜡梅挥发油对THP-1参与的炎症的相关作用机制研究。

发明内容

针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供柳叶蜡梅挥发油的一种新的医药用途，本发明采用THP-1单核细胞，在佛波酯(PMA)诱导下培养为THP-1巨噬细胞，观察不同时间、不同浓度PMA对不同细胞密度所致的细胞形态；再以不同浓度梯度的LPS孵育后测定THP-1巨噬细胞活性，进而建立THP-1巨噬细胞炎症模型。采用柳叶蜡梅挥发油作为活性物质，探索其对LPS诱导的THP-1巨噬细胞是否具有保护作用，并通过研究活性氧(ROS)，钙离子(Ca

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

柳叶蜡梅挥发油在制备治疗脂多糖诱导炎症的抗炎产品中的应用：所述炎症为LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎症；抗炎产品用于对LPS诱导下的THP-1巨噬细胞起到保护作用。

优选地，所述抗炎产品的保护作用通过提升LPS诱导的THP-1巨噬细胞的活性实现。

优选地，所述抗炎产品的主要活性成分为柳叶蜡梅挥发油。

优选地，所述柳叶蜡梅挥发油浓度为25-200uL/L，最优浓度为50uL/L。

优选地，所述抗炎产品的保护作用通过降低LPS诱导的THP-1巨噬细胞的ROS含量实现。

优选地，所述抗炎产品的保护作用通过降低LPS诱导的THP-1巨噬细胞的Ca

优选地，所述抗炎产品的保护作用通过提升LPS诱导的THP-1巨噬细胞的线粒体膜电位实现。

作为优选，所述抗炎产品适用于LPS诱导的炎症。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明开发了柳叶蜡梅挥发油对LPS诱导THP-1巨噬细胞炎症的保护作用及其机制，柳叶蜡梅挥发油显著改善LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎症；并进一步确认其药理作用是通过增强LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎症的细胞活性，降低细胞内ROS，Ca

(2)本发明确定了利用柳叶蜡梅挥发油制备由LPS所诱导的THP-1巨噬细胞炎症保护药物的新用途，其疗效好，毒副作用小。

(3)基于柳叶蜡梅挥发油良好的抗炎保护作用以及THP-1单核细胞存在于血液中的细胞特性，柳叶蜡梅挥发油对增强大众尤其是亚健康人员的免疫力、抵抗力等具有广阔前景，为未来柳叶蜡梅的市场推广提供理论基础，并提高柳叶蜡梅相关产业的经济效益。

附图说明

图1是本发明具体实施方式中THP-1单核细胞生长曲线(图1A)及细胞培养状态图(图1B)。

图2是本发明具体实施方式中不同浓度PMA诱导THP-1单核细胞不同时间(图2A)、不同细胞密度图(图2B)。

图3是本发明具体实施方式中不同LPS浓度诱导THP-1巨噬细胞的细胞活性图。

图4是本发明具体实施方式中不同柳叶蜡梅挥发油浓度对THP-1巨噬细胞毒性图。

图5是本发明具体实施方式中不同柳叶蜡梅挥发油浓度对LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎症保护作用图。

图6是本发明具体实施方式中不同处理组中THP-1巨噬细胞内ROS含量图。

图7是本发明具体实施方式中不同处理组中THP-1巨噬细胞内Ca

图8是本发明具体实施方式中不同处理组中THP-1巨噬细胞内线粒体膜电位水平图。

具体实施方式

1、实验材料

1.1材料与试剂

柳叶蜡梅由江西省婺源县专业合作社合作进行采集和提供的。柳叶蜡梅挥发油的提取和采集方法：称量剪切后的柳叶蜡梅40g加入挥发油提取器中，加入1升蒸馏水(料液比为1：25)，搭建挥发油提取装置，170℃微沸7h后收集挥发油至EP管中，加入无水硫酸钠干燥且离心后，密封4℃避光保存。

THP-1细胞购自美国ATCC，1640培养基购自GIBCO公司，胎牛血清购自BiologicalIndustries公司，PMA和Rhodamine123购自Sigma公司，LPS和Fluo-3，AM购自北京索莱宝公司，CCK8购自苏州优逸兰迪公司，ROS试剂盒和MTT购自南京碧云天公司。

1.2主要仪器设备

全波长扫描式多功能读数仪(多功能酶标仪)、二氧化碳培养箱从美Thermo公司购买；超纯水仪从美国Mi11ipore公司购买；SKM型数显恒温电热套从山东鄄城华鲁电热仪器有限公司购买。

2、实验方法

2.1细胞培养

THP-1单核细胞使用含有10％胎牛血清、青-链霉素的1640培养基，放入含5％二氧化碳培养箱中进行培养。观察细胞培养状态，待细胞培养基变黄后，将细胞悬液转移至15ml离心管中进行离心或者半换液法进行培养，1000r/min离心5分钟后重悬细胞，调整细胞密度之后用于细胞传代或者用于铺板实验。

2.2 THP-1单核细胞生长曲线的测定

将不同密度的细胞种在96孔板中，经过培养24h，48h和72h后，使用CCK8法测定不同密度细胞的吸光值。培养至指定时间后，按照说明书每孔加入10uLCCK8，使用酶标仪在450nm波长处测定吸光值，吸光值的大小代表细胞活性。

2.3 PMA诱导条件的确定

取5×10

2.4 LPS诱导条件的确定

将5×10

2.5柳叶蜡梅挥发油对THP-1巨噬细胞毒性作用的确定

将5×10

2.6柳叶蜡梅挥发油对LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎症保护作用的测定

将5×10

2.7柳叶蜡梅挥发油对LPS诱导的THP-1巨噬细胞内ROS含量的测定

将5×10

2.8柳叶蜡梅挥发油对LPS诱导的THP-1巨噬细胞内Ca

将5×10

2.9柳叶蜡梅挥发油对LPS诱导的THP-1巨噬细胞内线粒体膜电位水平的测定

将5×10

2.10数据分析

所有数据均使用Prism 9进行统计学分析，采用单因素方差分析和最小显著性差异(LSD)检验来进行多组比较及显著性分析。P＜0.05为具有显著意义；P＜0.01为具有极显著意义。所有数据均以平均值±标准差(S.D.)表示。

3、结果与分析

3.1THP-1单核细胞生长曲线的测定及显微镜观察结果如图1所示。

从图1A中生长曲线可以看出，随着种板细胞密度的增加，吸光值也在逐渐提升，第二天细胞密度在5×10

3.2不同浓度PMA诱导THP-1单核细胞不同时间、不同细胞密度状态如图2所示。

从图2A中的光学显微镜下的图片可以看出，PMA经过24h的诱导后，各组在光镜下没有显著区别，但是经过2天诱导后，可以明显看出低剂量PMA组发生大量的细胞聚团现象，而随着PMA的剂量增加，细胞聚团现象明显减少，因此可以判断PMA的剂量区间在100-200之间较合适。将细胞按照5×10

3.3不同LPS浓度诱导THP-1巨噬细胞的细胞活性如图3所示。

从图3中可以看出，在LPS浓度为0.5ug/ml及以下时，LPS对THP-1巨噬细胞的细胞活性没有显著性差异，但是当LPS浓度为1ug/ml及以上时，则会产生显著性差异，表明在该浓度以上会对细胞正常生长产生影响。因此为了进行后续的实验，我们采用1ug/ml的LPS浓度进行炎症模型的造模。

3.4柳叶蜡梅挥发油对THP-1巨噬细胞毒性如图4所示。

从图4中可以看出，在挥发油浓度为200uL/L及以下时，与正常组相比，柳叶蜡梅挥发油对THP-1巨噬细胞的生长没有显著影响，但是当浓度达到400uL/L时，柳叶蜡梅挥发油则会对THP-1巨噬细胞产生毒性作用，影响细胞生长状态，因此我们后续实验采用的挥发油浓度应控制在200uL/L及以下的浓度。

3.5柳叶蜡梅挥发油对LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎症保护作用如图5所示。

在图5中，THP-1巨噬细胞经过LPS作用后，与正常组相比，LPS组的细胞活性显著降低，表明炎症模型的建立成功。经过挥发油的保护作用之后，与模型组相比，挥发油浓度区间在25-200uL/L时细胞活性显著增强，且挥发油浓度为50uL/L时抗炎保护效果最佳，这为更深入的抗炎机制研究以及产品应用提供了基础理论研究。研究表明25uL/L和50uL/L都能对细胞发挥保护作用并且区别不大，因此我们后续使用浓度较低的挥发油浓度25uL/L探究其保护作用机制。

3.6柳叶蜡梅挥发油降低LPS诱导的THP-1巨噬细胞内ROS含量如图6所示。

在图6中，THP-1巨噬细胞激活经过LPS作用后，可以看出其ROS含量显著提升，表明在THP-1巨噬细胞炎症中ROS含量得到升高，经过挥发油孵育之后，可以看到挥发油显著降低了细胞内ROS的表达水平，表明柳叶蜡梅挥发油能够降低细胞内ROS的含量来发挥其保护作用。

3.7柳叶蜡梅挥发油降低LPS诱导的THP-1巨噬细胞内Ca

在图7中，细胞经过LPS刺激之后，细胞内Ca

3.8柳叶蜡梅挥发油增加LPS诱导的THP-1巨噬细胞内线粒体膜电位水平如图8所示。

在图8中，线粒体膜电位在经过LPS作用之后，可以看到其水平显著降低，线粒体膜电位常与线粒体功能相关，表明LPS损伤了THP-1巨噬细胞的线粒体功能，但是在经过添加挥发油后，挥发油显著增加了线粒体膜电位水平，表明挥发油能够改善LPS诱导的线粒体功能损伤。

4、实验结论

在培养THP-1单核细胞过程中，因为THP-1单核细胞依赖高密度生长，因此在THP-1单核细胞的生长曲线中，可以看到5×10

将THP-1单核细胞诱导为THP-1巨噬细胞过程中，经过不同时间不同浓度的PMA处理不同细胞密度之后，发现5×10

随着目前对天然植物来源活性物质重视的大背景下，寻找有效、经济的抗炎物质来提升自身的免疫力、抵抗力等吸引越来越多人的注意。THP-1单核细胞存在于全身血液中，柳叶蜡梅挥发油拥有良好的抗炎保护作用，因此基于上述背景，开发出柳叶蜡梅挥发油抗炎产品既符合当下增强免疫力的大背景，也能为柳叶蜡梅挥发油的生产应用提供理论基础，为柳叶蜡梅的产业化及其上下游提供经济效益。

上述实施例只为阐述本发明的技术构思及其特点，目的在于相关技术人员能够了解本发明的内容和思路，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。