LHPP基因在肝癌免疫治疗中的应用及肝癌免疫治疗药物

摘要

本发明提供了LHPP基因在肝癌免疫治疗中的应用及肝癌免疫治疗药物。促进LHPP基因表达的试剂可用于制备肝癌免疫治疗药物。本发明还提供了一种mRNA纳米药物，其由以下方法制备获得：将Meo‑PEG‑Dlink

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及LHPP基因在肝癌免疫治疗中的应用及肝癌免疫治疗药物。

背景技术

化疗是肿瘤治疗的基石，但是化疗药物缺乏靶向性，肿瘤细胞被杀伤的同时正常细胞受到极大损害(肝肾功能障碍/骨髓移植等)，这导致部分患者无法耐受化疗副作用而中断治疗。肿瘤细胞中有多种癌抑制相关基因，抑癌基因在正常细胞中高表达，和肿瘤的发生/发展，侵袭/转移密切相关。现阶段，针对肝癌相关基因的药物主要有小分子激酶抑制剂，如针对多靶点的酪氨酸激酶抑制剂(索拉菲尼，瑞格菲尼，乐伐替尼)。

传统化疗药物缺乏靶向性，易出现副作用，易发生耐药；其它可选的治疗方法(经动脉化疗栓塞，经皮热频消融等)均为有创治疗；而针对肝癌驱动相关基因的小分子激酶抑制剂药效不高，并且容易造成耐药，制备成本高，患者经济负担重。因此，缺乏有效的治疗手段已成为肝癌预后差的原因。

肝癌已被证明具有免疫原性，并且已经为肝癌治疗引入了免疫治疗策略，旨在通过诱导或增强现有的肿瘤特异性免疫反应来选择性地靶向肿瘤细胞。但是肝脏主要倾向于耐受，这在一定程度上可能会对肝癌的免疫治疗带来挑战，这可能跟某些重要基因的缺失相关。因此，寻找肝癌免疫耐受中关键的一些基因，在此基础上寻找解决方案对于肝癌免疫治疗至关重要。

mRNA技术通过核酸在细胞内表达外源蛋白，也就是表面抗原，激活细胞的免疫反应或者以此得到正常的功能蛋白，修复受损基因。但是外源性RNA到达体内肿瘤细胞中需要克服多重生理屏障。因此需要寻找高效率的递送系统帮助mRNA进入细胞。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供LHPP基因在肝癌免疫治疗中的应用及肝癌免疫治疗药物。LHPP可参与肝癌的免疫治疗，其通过影响自噬调节IFN-β的表达，进而增强STAT1入核，促进肝癌细胞分泌的T细胞相关的趋化因子的表达，最终促进CD8

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。

促进LHPP基因表达的试剂在制备肝癌免疫治疗药物中的应用。

在一些实施例中，所述肝癌免疫治疗药物为肝癌T细胞免疫治疗药物。

在一些实施例中，所述药物可以促进CD8

在一些实施例中，所述药物具有以下效果中的至少一种：(1)促进细胞自噬；(2)促进IFN-β的表达；(3)激活JAK-STAT1信号通路；(4)促进STAT1入核；(5)促进以下趋化因子中的一种或多种的表达：CXCL10、CXCL11。

在一些实施例中，所述促进LHPP基因表达的试剂选自激动剂、过表达质粒载体、载有LHPP基因mRNA的纳米颗粒。

在一些实施例中，所述药物还包含PD1抗体。

本发明还提供了一种肝癌免疫治疗药物，所述药物包含促进LHPP基因表达的试剂及药物学上可接受的辅料。

在一些实施例中，所述药物还包含PD1抗体。

在一些实施例中，所述促进LHPP基因表达的试剂为纳米颗粒，其由以下方法制备获得：将Meo-PEG-Dlink

在一些实施例中，所述PEG-Dlink

在一些实施例中，所述阳离子脂质体通过以下方法制备获得：将1，2-环氧十四烷加入到0代PAMAM树枝状聚合物中，混匀，在搅拌条件下于90℃反应2天，反应产物通过硅胶色谱分离；所述1，2-环氧十四烷和0代PAMAM树枝状聚合物的摩尔比为7：1。将所述阳离子脂质体命名为G0-C14，使用所述G0-C14制备纳米药物可以提高转染效率。

在一些实施例中，所述Meo-PEG-Dlinkm-PLGA溶液的溶剂为二甲基甲酰胺。

在一些实施例中，所述搅拌的转速为1000±200rpm。

本发明首次发现了LHPP可参与肝癌的免疫治疗，并且和肝癌的生存预后相关。LHPP通过影响自噬调节IFN-β的表达，进而增强STAT1入核，促进肝癌细胞分泌的T细胞相关的趋化因子的表达，最终促进CD8

进一步地，本发明还发现，促进LHPP基因表达的试剂与PD1抗体联合使用能产生协同作用，增加对肝癌的免疫治疗效果。

本发明通过原料优化制备获得了一种载有LHPP基因mRNA的纳米药物，Meo-PEG-Dlink

本发明通过过表达LHPP靶基因可增加肝癌免疫治疗，减少传统治疗副作用，为临床肝癌患者提供新的治疗方案。

附图说明

图1为载有LHPP基因mRNA的纳米粒子的尺寸分布图。

图2为载有LHPP基因mRNA的纳米粒子的电势图。

图3为载有mRNA的纳米粒子在不同pH溶液中释放曲线。

图4为Cy5-EGFP Dm-NPs分别在pH 7.4和6.5条件下孵育HepG2和Bel-7402细胞24小时的CLSM图像。

图5为EGFP Dm-NPs分别在pH 7.4和6.5条件下孵育HepG2和Bel-7402细胞24小时的流式细胞仪轮廓和平均荧光强度(MFI)。

图6为弱酸微环境响应纳米载体的药代动力学情况。

图7为弱酸微环境响应纳米载体在各个器官及肿瘤部位的富集。

图8为TCGA数据库中T细胞相关的趋化因子CCL5、CXCL10、CXCL11与CD3和CD8呈正相关。

图9为LHPP在肝癌肿瘤组织中明显低表达，且在TCGA数据中LHPP低表达预示更差的OS和DFS。

图10为LHPP高表达肝癌患者CD8的浸润量和CCL5、CXCL10、CXCL11的表达增加。

图11为LHPP在常见肝癌细胞系中的表达。

图12为过表达LHPP后T细胞迁移情况。

图13为过表达LHPP后趋化因子的RNA和Elisa表达情况。

图14为过表达LHPP后STAT1入核和自噬的蛋白表达变化。

图15为各治疗组肿瘤的生长曲线以及肿瘤重量。

图16为各治疗组肿瘤CD8、GranzymB和Perforin的表达情况。

图17为各治疗组肿瘤的ki67和TUNEL的表达情况。

图18为各治疗组肿瘤的LHPP、p-STAT1以及LC3B的蛋白表达情况。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1载有mRNA的纳米颗粒制备及性能检测

使用纳米沉淀法制备载有LHPP基因mRNA的纳米粒子。选取二甲基甲酰胺作为溶剂，配置Meo-PEG-Dlink

使用Nano-ZS ZEN3600型粒径仪测定纳米粒子的尺寸以及电势。载有mRNA的纳米粒子的尺寸分布和电势分别见图1和图2。

下面以Cy5-EGFP mRNA为模板mRNA研究纳米粒子的mRNA的控制释放曲线和细胞摄取能力：按照上述方法制备载有荧光染料标记的EGFP的mRNA的纳米粒子(Cy5-EGFP Dm-NPs)。多次洗涤后，将其分散在1mL PBS中。将该纳米粒子溶液转移至透析管中，随后将透析管放置于室温,不同pH溶液中(pH浓度分别为6.5和7.4)。在指定的时间点，取出5μL纳米粒子溶液并加入到100μL二甲亚砜溶液。使用荧光分光光度计测量荧光染料的荧光强度。mRNA的累计释放率按下面公式计算：累计释放量(％)＝(M

在成功制备了Cy5-EGFP Dm-NPs并验证了它的pH响应后，我们接下来评估了所述纳米粒子是否可以利用其pH响应特性来增强对包裹的mRNA的细胞摄取能力。使用Cy5-EGFPDm-NPs与HepG2和Bel-7402细胞在pH 6.5或7.4下孵育24h。如图4所示，与在pH 7.4条件下和Cy5-EGFP Dm-NPs孵育的细胞相比，在pH 6.5条件下和Cy5-EGFP Dm-NPs孵育的细胞中Cy5-EGFP mRNA对应的更强的红色荧光和绿色荧光，表明在pH 6.5时可以转染更多负载mRNA的纳米粒子。流式细胞仪分析结果显示Dm-NPs可以显著促进包裹的EGFP mRNA的基因转染，HepG2和Bel-7402细胞在pH 6.5时对EGFP Dm-NPs的摄取比pH 7.4时高3倍以上，如图5。这些结果表明，在pH 6.5时，从Dm-NPs中分离PEG链确实可以促进细胞对囊化mRNA的摄取。

实施例2弱酸微环境响应载体载有mRNA的纳米颗粒的药代动力学和肿瘤富集

在成功验证了载有mRNA的弱酸微环境响应的纳米粒子的性能和处理细胞后增强摄取能力后，我们进一步检测它在动物体内的药代动力学和在肿瘤部位的富集。健康小鼠随机分为2组(n＝3)。每只小鼠静脉注射10ug mRNA，(i)游离的Cy5-EGFP mRNA(NakedmRNA)；(ii)载Cy5-EGFP mRNA的纳米粒子(Dm-NPs)。在预定的时间间隔内用含肝素的导管取眶静脉血。按压伤口几秒钟止血。应用酶标仪检测血液Cy5-EGFP mRNA荧光强度。如图6所示，与快速从血液中清除的Naked mRNA组相比，Dm-NPs(cy5-EGFP-mRNA)组的mRNA循环时间明显延长。

将装载Cy5-EGFP mRNA的纳米粒子注射到HepG2异种移植荷瘤小鼠(每只小鼠10ug)中，检测纳米粒子在各个器官及肿瘤中的富集程度。荷瘤小鼠随机分为2组(n＝3)，(i)游离的Cy5-EGFP mRNA(Naked mRNA)；(ii)载Cy5-EGFP mRNA的纳米粒子(Dm-NPs)。注射24小时后采集肿瘤及主要脏器，采用IVIS Lumina III成像系统成像。为了量化mRNA在肿瘤和器官中的积累，使用Image-J软件对每个组织的荧光强度进行量化。如图7所示，小鼠肿瘤中mRNA负载NPs的浓度明显高于裸mRNA。

实施例3在随机对照临床研究中肝癌患者组织中LHPP明显下调，并且其下调与肝癌患者更短的生存时间相关

如图8所示，TCGA数据库显示，肝癌T细胞相关的趋化因子CCL5、CXCL10、CXCL11的表达与CD3和CD8呈正相关。LHPP在肝癌肿瘤组织中明显低表达，且LHPP低表达预示着肝癌患者更短的总生存时间(OS)及无疾病进展时间(DFS)，如图9所示。在之前研究中，LHPP主要调控肿瘤生长和转移，我们是第一个次发现该基因和T细胞免疫治疗相关。我们从101例肝癌患者肿瘤切片中发现，LHPP高表达的患者CD8

实施例4NPs(LHPP)处理肝癌细胞后，通过增强自噬促进IFN-β表达进而增强T细胞浸润

LHPP在肝癌细胞系HepG2和Bel-7402相对低表达，如图11。将人肝癌细胞HepG2和Bel-7402接种在6孔板(每孔100,000个细胞)中，加入2mL含10％胎牛血清的培养基孵育24小时，让其充分贴壁。随后分别在pH6.5和7.4条件下加入NPs(LHPP)与HepG2和Bel-7402肝癌细胞共孵育24h后换成正常培养基继续培养48h。之后在孔径0.5微米的transwell小室的上室中加入50万激活后的人的T细胞，12h后收集下室中所有培养基，离心后与人的CD8流式抗体孵育。通过流式细胞仪分析CD8

我们分别用STAT1抑制剂(Fludarabine)和自噬抑制剂(chloroquine)处理肝癌细胞，发现抑制剂处理后趋化因子显著降低，且自噬抑制剂处理后IFN-β的RNA和Elisa水平均降低。

为了进一步研究LHPP是如何增强T细胞浸润，我们进一步通过KEGG分析及GSEA分析LHPP过表达后转录组情况。测序结果显示，LHPP可能通过JAK-STAT和自噬通路发挥作用。我们进一步研究发现，LHPP过表达可增强自噬，促进IFN-β升高，激活JAK-STAT1通路，促进STAT1入核，进而促进T细胞相关趋化因子升高。因此可以通过设计弱酸响应的纳米载体递送LHPP增强T细胞的浸润，达到肝癌免疫治疗的效果。图14为过表达LHPP后STAT1入核和自噬蛋白表达情况。

实施例5荷瘤小鼠治疗模型：包载LHPP mRNA的纳米粒子发挥治疗肝癌作用

我们在体内验证载LHPP基因mRNA的纳米粒子的作用，把40只NCG雄性小鼠随机分5组，在背部皮下种植人的肝癌肿瘤组织，同时每只鼠尾静脉注射5百万～1千万人外周血单核细胞(PBMC)，等待瘤子长大到体积约150mm

图15为各治疗组肿瘤的生长曲线及肿瘤重量。我们发现NPs(LHPP)联合PD1组药物产生了协同作用，治疗效果最好，肿瘤生长明显被抑制；且NPs(LHPP)比NPs(EGFP)组有明显的治疗效果。

收集肿瘤后，将肿瘤消化成单个细胞，与人的CD45、CD3、CD8、颗粒酶B(GranzymB，GZMB)和穿孔素(Perforin)抗体共孵育。通过流式细胞仪分析不同处理组的CD8、GranzymB和Perforin的表达情况。图16为各治疗组肿瘤CD8、GranzymB和Perforin的浸润表达。图17为各治疗组肿瘤的ki67和TUNEL的表达情况。图18为各治疗组肿瘤的LHPP、p-STAT1以及LC3B的蛋白表达情况。结果表明，NPs(LHPP)联合PD1组的ki67表达量明显减少，且TUNEL表达量增多。免疫荧光(IF)分析表明，LHPP过表达可增强p-STAT1和LC3II/I的表达。

综上所述，本发明首次发现了LHPP可参与了肝癌的免疫治疗，并且和肝癌的生存预后相关。LHPP通过影响自噬调节IFN-β的表达，进而增强STAT1入核，促进肝癌细胞分泌的T细胞相关的趋化因子的表达，最终促进CD8

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。