羟基喜树碱的用途、羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种羟基喜树碱的用途、羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法与应用，羟基喜树碱纳米脂质体包括羟基喜树碱和脂质膜，羟基喜树碱作为治疗非酒精性脂肪肝及肝炎的药效成分；脂质膜包括二硬脂酰磷脂酰胆碱和聚乙二醇磷脂，其中，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱作为载体材料，所述聚乙二醇磷脂作为膜修饰剂，所述羟基喜树碱负载于所述脂质膜内形成纳米脂质体。本发明将羟基喜树碱用于治疗非酒精性脂肪肝及肝炎的治疗，可有效抑制食欲、治疗非酒精性脂肪肝。此外，纳米粒子体内富集于肝的特性，将羟基喜树碱负载于脂质膜内，解决了肝靶向性差、毒副作用强的问题。而结合腹腔注射方式，可以获得较好的治疗非酒精性脂肪肝效果。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种羟基喜树碱的用途、羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法与应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病成为全球公认的第一大慢性肝病，是导致肝硬化和肝癌病例数日益增长的重要原因。由于生活方式调整和减肥手术在非酒精性脂肪肝(NAFLD)治疗领域有局限性，药物开发被寄予厚望。羟基喜树碱是从中国特有的珙桐科植物喜树中分离出的一种喜树碱类药物，临床被批准以碱性水溶液剂型静脉注射治疗胃癌、大肠癌、肝癌等。

羟基喜树碱较喜树碱毒性低，但是，该药物临床使用仍具有副作用，主要为白细胞下降、胃肠道反应(恶心、呕吐)以及泌尿系统毒性。同时由于该剂型呈碱性，与其他药物混合容易引起pH值改变，与其他药物同时使用需考虑对其他药物的影响。羟基喜树碱肝靶向性差、毒副作用强，削弱其治疗效应。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提出一种羟基喜树碱的用途、羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法与应用。

为实现上述目的，根据本发明的第一个方面，本发明提供了羟基喜树碱在制备治疗非酒精性脂肪肝及肝炎药物中的应用。

根据本发明的一个实施例，所述药物为注射制剂，采用腹腔注射。

根据本发明的第二个方面，本发明提供的羟基喜树碱纳米脂质体，包括：

羟基喜树碱，作为治疗非酒精性脂肪肝及肝炎的药效成分；

脂质膜，所述脂质膜包括二硬脂酰磷脂酰胆碱和聚乙二醇磷脂，其中，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱作为载体材料，所述聚乙二醇磷脂作为膜修饰剂，所述羟基喜树碱负载于所述脂质膜内形成纳米脂质体。

根据本发明的一个实施例，所述羟基喜树碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇磷脂的体积比为1:800～1200：200～400。

根据本发明的一个实施例，所述羟基喜树碱的溶度为1～5mg/ml，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱的溶度为15～25mg/ml，所述聚乙二醇磷脂为20～30mg/ml。

根据本发明的一个实施例，还包括PBS缓冲液，所述PBS缓冲液与所述二硬脂酰磷脂酰胆碱的体积比为1:80～120。

根据本发明的一个实施例，所述脂质膜为双层脂质膜。

根据本发明的第三个方面，本发明提供的羟基喜树碱纳米脂质体制备方法，包括：

称量一定量的羟基喜树碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和聚乙二醇磷脂粉末；

将羟基喜树碱通过第一溶剂溶解，二硬脂酰磷脂酰胆碱和聚乙二醇磷脂粉末分别通过第二溶剂溶解；

分别配置浓度1～5mg/ml的羟基喜树碱溶液，浓度5～25mg/ml的二硬脂酰磷脂酰胆碱溶液，以及浓度20～30mg/ml的聚乙二醇磷脂溶液备用；

按照羟基喜树碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇磷脂体积比1:800～1200：200～400，在试管加入羟基喜树碱溶液、二硬脂酰磷脂酰胆碱溶液和聚乙二醇磷脂溶液；

将试管中的有机溶剂吹干，并在吹干后对试管进行抽真空；

抽真空结束后，在试管中加入PBS缓冲液，PBS缓冲液与二硬脂酰磷脂酰胆碱的体积比为1:80～120，用封口膜将试管的管口封闭，再超声设备进行超声水化,直至试管内的材料完全悬于PBS缓冲液。

根据本发明的一个实施例，所述将试管中的有机溶剂吹干，并在吹干后对试管进行抽真空包括：

先将试管转移至通风厨，用氮气气流吹试管中的有机溶剂直至吹干，再将吹干的试管转移至真空瓶中，利用真空设备对真空瓶抽真空1.5至3小时。

根据本发明的第四个方面，本发明还提供了如上所述的羟基喜树碱纳米脂质体在制备治疗非酒精性脂肪肝及肝炎药物中的应用。

通过上述技术方案，本发明将羟基喜树碱用于治疗非酒精性脂肪肝及肝炎的治疗，可有效抑制食欲、治疗非酒精性脂肪肝。此外，纳米粒子体内富集于肝的特性，将羟基喜树碱负载于脂质膜内，解决了肝靶向性差、毒副作用强的问题。而结合腹腔注射方式，可以获得较好的治疗非酒精性脂肪肝效果。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1是本发明中羟基喜树碱纳米脂质体形成过程的示意图；

图2是本发明中羟基喜树碱纳米脂质体在透射电镜(TEM)和动态光散射仪下的结构表征图；

图3是本发明小鼠治疗实验的体重监测的结果图；

图4是本发明小鼠治疗实验的NASH模型组肝组织对比图；

图5是本发明小鼠治疗实验的肝组织切片油红O染色图；

图6本发明中采血清检测相关指标的结果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明是基于发明人的以下发现及研究完成的。

羟基喜树碱是从中国特有的珙桐科植物喜树中分离出的一种喜树碱类药物，临床被批准以碱性水溶液剂型静脉注射治疗胃癌、大肠癌、肝癌等。发明人发现喜树碱在较低浓度使用可有效抑制食欲、治疗非酒精性脂肪肝。羟基喜树碱较喜树碱毒性低。但是，该药物临床使用仍具有副作用，主要为白细胞下降、胃肠道反应(恶心、呕吐)以及泌尿系统毒性。同时由于该剂型呈碱性，与其他药物混合容易引起pH值改变，与其他药物同时使用需考虑对其他药物的影响。羟基喜树碱肝靶向性差、毒副作用强，削弱其治疗效应。

本发明实施例提供了一种羟基喜树碱在制备治疗非酒精性脂肪肝及肝炎药物中的应用。将羟基喜树碱用于治疗非酒精性脂肪肝及肝炎的治疗，可有效抑制食欲、治疗非酒精性脂肪肝。

由于NAFLD治疗预期疗程较长，给药方式将影响病人配合程度，对是否能完成疗程有极大的影响。较佳地，本申请含羟基喜树碱的药物采用注射制剂，以腹腔注射方式治疗。该给药方式实施技术要求较低，可参考糖尿病患者使用胰岛素笔自行给药，使用的方便性有助于转化和推广。

此外，研究表明粒径大于10nm的粒子靶向肝而不易经肾脏通过尿液排出。为更好发挥羟基喜树碱治疗非酒精性脂肪肝作用，本发明提供一种羟基喜树碱纳米脂质体给药系统。

根据本发明实施例提供的羟基喜树碱纳米脂质体，包括羟基喜树碱和脂质膜。

具体地，羟基喜树碱作为治疗非酒精性脂肪肝及肝炎的药效成分。羟基喜树碱是从珙桐科植物喜树中提取得到的微量生物碱,其性状为黄色冻干疏松块状或粉末，无臭，易溶于水，水溶液pH值为8.0-9.5，其抗瘤谱广,且与其他常用抗肿瘤药无交叉耐药性。对原发性肝癌、胃癌、膀胱癌、直肠癌，头顶部上皮癌、白血病等恶性肿瘤等均有疗效。

脂质膜包括二硬脂酰磷脂酰胆碱和聚乙二醇磷脂，其中，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱作为载体材料，所述聚乙二醇磷脂作为膜修饰剂，所述羟基喜树碱负载于所述脂质膜内形成纳米脂质体。较佳地的，脂质膜为双层脂质膜。

二硬脂酰磷脂酰胆碱是领域应用较为广泛的一种合成磷脂。DSPC的尾部基团是饱和烷烃链，熔点为-54℃，呈圆柱状形态，在脂质纳米粒中形成层状结构，使脂质纳米粒的结构更为稳定。

DSPE-PEG2000是一种PEG化磷脂，PEG化磷脂对脂质纳米粒的特性有着多重影响，PEG化磷脂的用量影响着脂质纳米粒的粒径和电位，减少粒子聚集而提高脂质纳米粒的稳定性，延长粒子的循环时间，表面的官能团可以用配体修饰，提高靶向递送能力。DSG-PEG2000是中性磷脂，饱和烷基链的长度长，从脂质纳米粒中更快地分离，利于细胞对纳米粒的摄取和内涵体逃逸，递送效率高。

优选地，羟基喜树碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇磷脂的体积比为1:800～1200：200～400。所述羟基喜树碱的溶度为1～5mg/ml，所述二硬脂酰磷脂酰胆碱的溶度为15～25mg/ml，所述聚乙二醇磷脂为20～30mg/ml。二硬脂酰磷脂酰胆碱及聚乙二醇磷脂的用量影响脂质纳米粒的特性，采用上述体积比及溶度，可以确保该羟基喜树碱纳米脂质体具有良好的靶向递送能力及效率。

在本发明的一个实施例中，还包括PBS缓冲液，所述PBS缓冲液与所述二硬脂酰磷脂酰胆碱的体积比为1:80～120。如上所述，羟基喜树碱呈碱性，与其他药物混合容易引起pH值改变，本实施例中，添加PBS缓冲液，其具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，并且不会破坏生物蛋白的结构及生物特性，在平衡PH值的同时，能够保证羟基喜树碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇磷脂完整的特性，通过超声薄膜分散的方法制备优质的脂质体纳米粒子。

本发明还提供了一种羟基喜树碱纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：

1)称量一定量的羟基喜树碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和聚乙二醇磷脂粉末。

2)将羟基喜树碱通过第一溶剂溶解，二硬脂酰磷脂酰胆碱和聚乙二醇磷脂粉末分别通过第二溶剂溶解。优选地，所述第一溶剂包括甲醇和氯仿，所述甲醇和氯仿的体积比例为1:1，所述第二溶剂为氯仿。

3)分别配置浓度1～5mg/ml的羟基喜树碱溶液，浓度5～25mg/ml的二硬脂酰磷脂酰胆碱溶液，以及浓度20～30mg/ml的聚乙二醇磷脂溶液备用。

4)按照羟基喜树碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇磷脂体积比1:800～1200：200～400，在试管加入羟基喜树碱溶液、二硬脂酰磷脂酰胆碱溶液和聚乙二醇磷脂溶液。

5)将试管中的有机溶剂吹干，并在吹干后对试管进行抽真空。具体地，先将试管转移至通风厨，用氮气气流吹试管中的有机溶剂直至吹干，再将吹干的试管转移至真空瓶中，利用真空设备对真空瓶抽真空1.5至3小时。

6)抽真空结束后，在试管中加入PBS缓冲液，PBS缓冲液与二硬脂酰磷脂酰胆碱的体积比为1:80～120，用封口膜将试管的管口封闭，再超声设备进行超声水化,直至试管内的材料完全悬于PBS缓冲液。

本发明还提供了如上所述的羟基喜树碱纳米脂质体在制备治疗非酒精性脂肪肝及肝炎药物中的应用。

通过上述技术方案，利用纳米粒子体内富集于肝的特性，将羟基喜树碱负载于脂质膜内，解决了肝靶向性差、毒副作用强的问题。而结合腹腔注射方式，可以获得较好的治疗非酒精性脂肪肝效果。

实施例

1、羟基喜树碱纳米脂质体溶液(HCPT@LIPO)的制备：

精密称量一定量羟基喜树碱(HCPT)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和聚乙二醇磷脂(DSPE-PEG2000)粉末。DSPC和DSPE-PEG2000粉末分别在1.5mlEP管中用氯仿溶解，HCPT粉末用甲醇和氯仿以1:1的比例溶解。各粉末加入溶剂后，通过超声清洗仪超声溶解3min。

分别配置HCPT浓度为2mg/ml，DSPC浓度为20.63mg/ml，DSPE-PEG2000浓度为26.33mg/ml备用。取灭菌好的玻璃试管若干根放置于试管架，每支试管加入100ul已配好的HCPT溶液、104.3ml已配好的DSPC氯仿溶液和32.2ml已配好的DSPE-PEG2000氯仿溶液。

将上述试管迅速转移至通风厨，用氮气调整至小气流吹试管中的有机溶剂，直至吹干，约1h。再将吹干的试管转移至真空瓶中，连接真空泵抽真空2h左右。抽真空结束后，将试管取出后进行水化步骤，即加入1ml PBS缓冲液，用封口膜将试管的管口封闭，切勿摇晃试管。再将加入PBS缓冲液的试管放置在事先加热好的60°超声清洗仪超声水化,直至材料完全悬于PBS缓冲液且试管的管底没有明显残留，约5min。

2、羟基喜树碱纳米脂质体表征

使用透射电镜(TEM)进行结构表征(如图2中A所示),显示HCPT@LIPO为球形。使用动态光散射检测HCPT@LIPO粒径，约为150nm(如图2中B所示)。

3、小鼠脂肪肝炎模型治疗实验

使用高糖高脂饮食(HFD)建立小鼠脂肪肝炎(NASH)模型，其中，健康对照组(Ctrl-ND)、高糖高脂饮食组(NASH+HFD)、调整饮食组(NASH+ND)、高糖高脂饮食治疗组(NASH+HFD+HCPT)、调整饮食治疗组(NASH+ND+HCPT)，调整饮食为正常饮食，高糖高脂饮食治疗组和调整饮食治疗组均使用HCPT@LIPO，采用腹腔注射模式治疗，每周2次，共4周。其后使用HCPT@LIPO以及调整饮食组(ND)减轻症状。

如图3所示，体重监测显示HCPT@LIPO有一定的减轻体重作用，为高糖高脂饮食组(NASH+HFD)的89.8％。仅调整饮食(NASH+ND)降至86.5％，HCPT@LIPO治疗的调整饮食治疗组(NASH+ND+HCPT)降至82.6％。

如图4所示，高糖高脂饮食组(NASH+HFD)肝组织呈明显发白，脂肪组织较大。治疗组与健康对照组(Ctrl-ND)相近。将肝组织与脂肪组织分别称重。调整饮食组(NASH+ND)及HCPT@LIPO治疗均可使肝的重量恢复，但调整饮食与HCPT@LIPO联合治疗(即(NASH+ND+HCPT)组)可使脂肪组织(Adipose Tissue,AT)进一步降低。

如图5所示，肝组织切片油红O染色显示饮食调整联合HCPT@LIPO治疗能显著减少肝细胞脂滴积累。

如图6所示，采血清检验指标显示肝功能经治疗后显著恢复(ALT\AST),胆固醇(CHO)恢复至健康对照组水平。

综上，本发明表明使用脂质纳米粒子载药系统递送羟基喜树碱，以每周2次、共治疗4周的腹腔给药治疗方案，将获得较好的治疗非酒精性脂肪肝效应。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。