一种靶向条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体、其制备方法及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种靶向条纹斑竹鲨IgNAR‑CH1多克隆抗体、其制备方法及其应用。本发明的多克隆抗体是用氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的合成多肽与KLH耦联得到的免疫原免疫动物后得到。本发明的方法，包括如下步骤：序列选取，制备多肽，将多肽与KLH偶联制备免疫原，注射至免疫动物体内，得到IgNAR‑CH1多克隆抗体血清；对IgNAR‑CH1多克隆抗体血清进行亲和纯化，得到多克隆抗体。本发明的应用包括条纹斑竹鲨IgNAR‑CH1多克隆抗体在检测条纹斑竹鲨血清效价中的应用，以及在检测鉴定抗体类型、噬菌体文库建库筛选的研究及质量检测方面的应用。本发明中，由于采用特定的免疫原加上独特的免疫策略，对实验兔的免疫周期更短，21‑24天即可获得纯化抗体，同时获得较好的免疫效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种靶向条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体、其制备方法及其应用，所述的应用包括条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体在检测条纹斑竹鲨血清效价中的应用，以及在检测鉴定抗体类型、噬菌体文库建库筛选的研究及质量检测方面的应用。

背景技术

IgNAR是鲨鱼等软骨鱼类所独有的一种抗体，与骆驼等驼类所拥有的VHH抗体都属于纳米抗体的一种。VHH抗体免疫成熟的过程已经得到了广泛的研究，市场上商业化的VHH检测抗体比比皆是，无论是美洲驼还是骆驼，但凡是能够产生VHH抗体的骆驼科动物在免疫时都能在市场上找到适用的血清检测抗体。

而IgNAR抗体在软骨鱼类生物体内的免疫成熟过程尚不为人们所知，且IgNAR的结构也尚未被研究透彻，所以市面上仅有一两款针对护士鲨等的IgNAR检测抗体，而且这些抗体所针对的鱼类并不是条纹斑竹鲨。

相关文献表明(Roux KH,Greenberg AS,Greene L,Strelets L,Avila D,McKinney EC,Flajnik MF.Structural analysis of the nurse shark(new)antigenreceptor(NAR):molecular convergence of NAR and unusual mammalianimmunoglobulins.Proc Natl Acad Sci U S A.1998Sep 29；95(20):11804-9.doi:10.1073/pnas.95.20.11804.)，在护士鲨中，IgNAR具有5个恒定结构域(CH1-CH5)，而在条纹斑竹鲨中，CH1结构域直接连接到CH4，出现CH2以及CH3结构的缺失。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种靶向条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体、其制备方法及其应用，所述的应用包括条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体在检测条纹斑竹鲨血清效价中的应用，以及在检测鉴定抗体类型、噬菌体文库建库筛选的研究及质量检测方面的应用。

在不确定这些检测抗体是否能够用于条纹斑竹鲨的血清效价检测的情况下，发明人通过分析条纹斑竹鲨体内IgNAR抗体的CH1区序列，找到了其中的保守序列，合成短肽后与KLH偶联并免疫新西兰大白兔产生针对该短肽的兔源多克隆抗体。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体。所述的多克隆抗体是用氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的合成多肽与KLH耦联得到的免疫原免疫动物后得到。

在本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，

S1.制备合成多肽；所述多肽序列来源于条纹斑竹鲨IgNAR-CH1，为保守片段序列，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，多肽氨基酸序列为YSCQVSHSAT；

S2.将步骤S1中制备的多肽与KLH耦联，多肽与KLH的重量比为1：1，制备免疫原，按比例混合后注射入免疫动物的体内，得到Ig NAR多克隆抗体血清；

S3.对Ig NAR-CH1多克隆抗体血清进行亲和纯化，得到多克隆抗体。

进一步地，

所述步骤S2中，得到Ig NAR多克隆抗体血清的具体过程为：

S21.初次免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂混合，使用均质机乳化充分，形成油包水的乳浊液，滴入冰水中五分钟不分散，即得免疫所用注射剂，皮下注射入免疫动物体内；

S22.加强免疫：将免疫原与弗氏不完全佐剂混合，使用均质机乳化充分，形成油包水的乳浊液，滴入冰水中五分钟不分散，即得免疫所用注射剂，皮下注射入免疫动物体内，进行加强免疫若干次；

S23.最后一次免疫后，免疫动物颈动脉取血，收集得到靶向IgNAR-CH1的多克隆抗体血清。

更进一步地，

所述免疫原与弗氏完全佐剂以1：1等体积混合乳化，所述免疫原与弗氏不完全佐剂也以1：1等体积混合乳化；所述初次免疫的免疫剂量为1mg/只，所述加强免疫的免疫剂量为0.5mg/只；初次免疫后进行2次加强免疫，间隔1周免疫1次，最后一次免疫7～10天后采用颈动脉取全血。

进一步地，所述步骤S2中，所述的免疫动物为新西兰大白兔。

进一步地，所述步骤S3中，亲和纯化的具体过程为：

S31.将亲和层析柱依次用纯水和pH7.4的1×PBS，流速70mL/h充分清洗，取待纯化的血清于离心管中，用0.45μm滤膜抽滤；

S32.将抽滤过的血清样品以40mL/h流速上样，重复一次；

S33.用pH7.4的1×PBS以70mL/h的流速清洗柱子，10min后连接蛋白检测仪，清洗过程中调节仪器透光率的T档示数为100；

S34.调节蛋白检测仪吸光率的1A档示数为0，此时打开电脑桌面的HD-A电脑采集器，并将满屏量程调到5，用pH 2.7，0.2M的甘氨酸溶液以40mL/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体；在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时调节抗体的pH值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值；

S35.抗体收集完后，调节pH值至7左右，并记录洗脱的抗体体积；

S36.超滤浓缩，即得纯化好的多克隆抗体。

在本发明的第三方面，还提供了如第一方面所述条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体或第二方面所述方法制备的条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体在检测条纹斑竹鲨血清效价中的应用。

检测鲨鱼血清效价的方法，包括如下步骤：

1)包板：用抗原稀释液将已知抗原稀释至1μg/mL，加入酶标板反应孔中，每孔50μL，4℃静置12小时，弃去抗原，用PBST洗3次，每孔200μL；

2)封闭：酶标板反应孔中加入1％ BSA，每孔150μL，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去封闭液；

3)一抗：酶标板反应孔中加入100μL抗原稀释液稀释过的血清(首孔8000倍稀释，后续依次4倍梯度稀释)，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去一抗，PBST洗3次，每孔200μL。

4)二抗：酶标板反应孔中加入100μL用1％BSA进行稀释的羊抗兔-HRP抗体(1:5000)，加入酶标板孔中，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去二抗，PBST洗3次，每孔200μL。

5)每孔加入100μL TMB显色液，室温反应8min。

6)终止：每孔加入100μL 1M硫酸溶液

7)读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据。

在本发明的第四方面，还提供了如第一方面所述条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体或第二方面所述方法制备的条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体在检测鉴定抗体类型、噬菌体文库建库筛选等研究及质量检测方面的应用。

在本发明的第五方面，提供了一种合成多肽，序列来源于条纹斑竹鲨IgNAR-CH1，为保守片段序列，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，具体为YSCQVSHSAT。

在本发明的第六方面，提供了如第四方面所述的合成多肽在制备条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体中的应用。

本发明具有如下技术效果：

1、本发明公开的条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体的制备方法，可制备出用于特异性识别条纹斑竹鲨IgNAR-CH1的多克隆抗体，且可用于条纹斑竹鲨血清效价的检测。

2、本发明提供的合成多肽，可用于制备条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体。

另外，与现有技术(CN 114316069 A等)相比，本发明具有如下预料不到的技术效果：

1.本发明的免疫原中的多肽所选用目的序列为条纹斑竹鲨特征保守序列，(位于CH1区，因为条纹斑竹鲨IgNAR的CH2、CH3区的基因编码会出现剪切缺失，导致部分IgNAR无法被识别该区域的抗体识别。)。

2.本发明中，由于采用特定的免疫原加上独特的免疫策略，对实验兔的免疫周期更短，21-24天即可获得纯化抗体，同时获得较好的免疫效果，抗体效价在1:128万以上。本发明的免疫策略与现有技术的免疫策略不同，主要不同之处为：免疫周期不同，本发明在第1天初次免疫，第7、14天加强免疫，第21-24天取血清。每次免疫的抗原分成10份分别注射免疫动物背部皮下各点，达到最大特异性免疫反应效果，从而达到最大化获取特异性抗体的作用。现有技术中，有一种常规免疫方案是第一天初次免疫，后期每两周加强免疫一次，免疫4-5次，间隔过长；另有一种免疫方案，是第1、7、28天各免疫一次，第35天取血清。也比本发明的方案耗时长。另外本发明抗体效价本方案普遍达到128万以上，较现有技术高出不少。

3.本发明中，使用核酸蛋白检测仪进行亲和层析洗脱，所得抗体纯度及浓度更高。

4.本发明制备多克隆兔抗特异性好，与现有商品化抗IgNAR抗体相比，具有更好的特异性识别条纹斑竹鲨IgNAR的能力。本领域技术人员从图2中可清楚发现本发明的抗体的特异性更强。

附图说明

图1是本发明实施例2中条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体效价检测图。

图2是本发明实施例3中条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体特异性结合IgNAR的western-blot鉴定图。

图3是本发明实施例4中使用制备的条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体对条纹斑竹鲨血清效价检测吸光度值曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。

实施例2-4中的鲨鱼血清，均表示条纹斑竹鲨血清。

实施例1条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体的制备

1)条纹斑竹鲨IgNAR抗原多肽的设计

发明人通过分析条纹斑竹鲨体内IgNAR抗体的CH1区序列，找到了其中的保守序列，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，具体为YSCQVSHSAT。

发明人选择上述序列的理由如下：

a.该序列是IgNAR上的一段高度保守的氨基酸序列，具备高度的特异性，可与条纹斑竹鲨的各种IgNAR特异性结合。

b.该序列符合抗原表位的一般化学特征，且序列位于成熟IgNAR三维结构的外侧，具备较好的抗体-抗原识别结合潜力。

c.经文献检索及对已商品化的IgNAR抗体识别序列做对比，该序列未被作为抗原表位进行抗体制备。

2)合成抗原多肽，并将制备的抗原多肽与KLH耦联，制备免疫原，多肽与KLH的重量比为1：1。(抗原多肽和免疫原均由金斯瑞公司合成制备)

3)动物免疫：选用新西兰大白兔为免疫动物(购自杭州科联兔业有限公司)，初次免疫的免疫剂量为1mg/只，将免疫原与等体积弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)混合，加强免疫的免疫剂量为0.5mg/只，将免疫原与等体积弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司)混合；初次免疫后进行2次加强免疫，间隔1周免疫1次，最后一次免疫7天后采用颈动脉取全血。

具体免疫过程如下：

初次免疫：将免疫原(IgNAR-KLH，1mg溶于0.25mL PBS溶液)与弗氏完全佐剂(0.25mL)混合，使用均质机乳化充分，形成油包水的乳浊液，滴入冰水中五分钟不分散，即得免疫所用注射剂，背部皮下多点注射入免疫动物体内；

加强免疫：初次免疫7天后，将免疫原(IgNAR-KLH，0.5mg溶于0.25mL PBS溶液)与弗氏不完全佐剂(0.25mL)混合，使用均质机乳化充分，形成油包水的乳浊液，滴入冰水中五分钟不分散，即得免疫所用注射剂，背部皮下多点注射入免疫动物体内，进行加强免疫。7天后重复加强免疫一次；

最后一次免疫7天后，免疫动物颈动脉取血，室温放置1小时后4℃放置1小时，12000rpm离心10分钟后收集得到靶向IgNAR-CH1的多克隆抗体血清。

4)抗体纯化：将亲和层析柱依次用20mL纯水和1×PBS(pH7.4)，流速70mL/h充分清洗，取待纯化的血清10mL于50mL离心管中，用0.45μm滤膜抽滤。将抽滤过的血清样品以40mL/h流速上样，重复一次。用20mL 1×PBS(pH7.4)以70mL/h的流速清洗柱子，10min后连接蛋白检测仪，清洗过程中调节仪器透光率(T档)示数为100。调节蛋白检测仪吸光率(1A档)示数为0，此时打开电脑桌面的HD-A电脑采集器，并将满屏量程调到5，用甘氨酸溶液(pH2.7，0.2M)以40mL/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体。在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时调节抗体的pH值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值。抗体收集完后，调节pH值至7左右，并记录洗脱的抗体体积，超滤浓缩，即得纯化好的多克隆抗体。

实施例2利用实施例1制备的条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体进行效价检测

1)包板：将鲨鱼血清稀释至1μg/mL，加入酶标板反应孔中，每孔50μL，4℃静置12小时，弃去血清，用PBST洗3次，每孔200μL。

2)封闭：酶标板反应孔中加入1％ BSA(m/v)，每孔150μL，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去封闭液。

3)一抗：酶标板反应孔中加入100μL封闭液稀释过的纯化多克隆抗体，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去一抗，PBST洗3次，每孔200μL。

4)二抗：酶标板反应孔中加入100μL用1％BSA进行稀释的羊抗兔-HRP抗体(1:5000)，加入酶标板孔中，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去二抗，PBST洗3次，每孔200μL。

5)每孔加入100μL TMB显色液，室温反应8min。

6)终止：每孔加入100μL 1M硫酸溶液。

7)读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(Biotech公司，450nm)进行读数，保存数据，计算效价。

图1是本实施例中条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体效价检测图。

从图1可以看出：所制备的兔多克隆抗体在稀释128万倍后仍然具备抗原识别结合能力(与阴性血清同比例稀释测量读数>2.1)，在稀释512万倍后显示与阴性血清同比例稀释测量读数<2.1。

同时可以证明，由于采用特定的免疫原加上独特的免疫策略，本发明的多克隆抗体工艺流程仅需21-24天即可获得高效价的抗体，与现有制备工艺(如专利CN 114316069A等)相比时间缩短近一倍。

实施例3利用western-blot鉴定实施例1制备的条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体的特异性

1)取2μL鲨鱼血清与5x loading buffer混合制样，金属浴100℃，10min，使用8％SDS-PAGE gel电泳，蛋白上样量为3μL。

2)将PAGE gel转膜至0.45μm的PVDF膜上，转膜条件为110v，90min。

3)转膜完毕裁剪目的条带位置，1×TBST洗涤3次，每次5min。

4)加入5％脱脂奶粉溶液4℃封闭过夜。

5)弃封闭液，TBST洗涤3次，每次10min。

6)加入1:1000稀释的一抗(实施例1制备所得条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体)，室温孵育2h，对照组加入1:5000稀释的一抗(商品化抗角鲨IgNAR)

7)弃去一抗TBST洗涤3次，每次10min。

8)加入稀释好的二抗(HRP标记的山羊抗兔抗体)，室温孵育1h。

9)弃去二抗TBST洗涤3次，每次15min。

10)在PVDF膜上滴上显色液于超灵敏化学发光仪下拍摄观察。

图2是本实施例中条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体特异性结合IgNAR的western-blot鉴定图。

如图2所示，本发明制备的条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体与商品化角鲨IgNAR(商品化抗IgNAR抗体是Invitrogen的)相比，具有明显的目的条带，具有较好的特异性。

实施例4使用制备的条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体对条纹斑竹鲨血清效价检测

1)包板：将已知抗原稀释至1μg/mL，加入酶标板反应孔中，每孔50μL。4℃静置12小时，弃去抗原，用PBST洗3次，每孔200μL。(这里“已知抗原”即用来免疫鲨鱼产生相应IgNAR抗体的抗原，在用间接法ELISA时作为已知抗原包被)

2)封闭：酶标板反应孔中加入1％ BSA，每孔150μL，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去封闭液。

3)鲨鱼血清：酶标板反应孔中加入100μL抗原稀释液稀释过的血清(首孔8000倍稀释，后续依次4倍梯度稀释)，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去鲨鱼血清，PBST洗3次，每孔200μL。

4)一抗：酶标板反应孔中加入100μL用1％BSA进行稀释的制备所得条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去一抗，PBST洗3次，每孔200μL。

5)二抗：酶标板反应孔中加入100μL用1％BSA进行稀释的HRP-标记羊抗兔抗体，置于37℃培养箱孵育1小时，弃去二抗。

6)每孔加入100μL TMB显色液，室温反应8min。

7)终止：每孔加入100μL 1M硫酸溶液。

8)读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据，计算效价。

图3是本实施例中使用制备的条纹斑竹鲨IgNAR-CH1多克隆抗体对条纹斑竹鲨血清效价检测吸光度值柱状图。

从图3可以看出：所制备的兔多克隆抗体对于鲨鱼血清中目的IgNAR的动态浓度变化具有较高的灵敏性和特异性亲和力。

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。