特异性结合KLK8的物质在制备脓毒症预防、治疗或诊断产品中的用途

摘要

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及特异性结合KLK8的物质在制备脓毒症预防、治疗或诊断产品中的用途，所述脓毒症预防、治疗或诊断产品通过以下方式治疗脓毒症：1)降低内皮细胞通透性或改善毛细血管渗漏；2)刺激VE‑cadherin/Akt/FOXM1信号通路；优选的，选自上调FOXM1及其下游靶基因表达水平、上调AKT或p‑AKT蛋白水平或上调VE‑cadherin的蛋白水平；3)提高内皮细胞增殖速度；4)降低内皮细胞死亡率；5)提高内皮细胞活性。本发明为脓毒症并发微血管屏障障碍提供一种新的治疗策略。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及特异性结合KLK8的物质在制备脓毒症预防、治疗或诊断产品中的用途。

背景技术

脓毒症是严重感染、创伤或烧伤患者常见的毁灭性并发症。进行性多器官功能障碍综合征(MODS)累加导致脓毒症的死亡率攀升。人们普遍认为，微血管系统，特别是微血管腔内的内皮细胞，非常容易受到脓毒症的有害后果的影响。在主要器官中，肺不仅是常见的受累器官，也是最容易发生严重脓毒症的器官之一。内皮细胞是脓毒症致肺损伤发病机制中的第一道防线，效应细胞最早发生形态改变、凋亡、细胞间连接破坏，导致内皮细胞高通透性和肺水肿。同时，脓毒症后循环中的大量毒素和炎症介质直接抑制了肺微血管内皮细胞的增殖能力，导致微血管的自我修复功能障碍，进一步加重脓毒症所致的肺损伤。因此，靶向内皮修复机制是恢复脓毒症后肺微血管屏障完整性的一种有前途的治疗策略。然而，KLKs是否参与脓毒症期间肺内皮再生和血管修复的调控仍不清楚。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供特异性结合KLK8的物质在制备脓毒症预防、治疗或诊断产品中的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供KLK8或其编码基因作为靶标在制备脓毒症预防、治疗或诊断产品中的用途。

本发明还提供特异性结合KLK8的物质在制备脓毒症预防、治疗或诊断产品中的用途本发明还提供特异性结合KLK8的物质在制备以下任一项或多项产品中的用途：

1)降低内皮细胞通透性产品或改善毛细血管渗漏产品；

2)刺激VE-cadherin/Akt/FOXM1信号通路产品；优选的，选自上调FOXM1及其下游靶基因表达水平产品、上调AKT产品或上调p-AKT蛋白水平产品或上调VE-cadherin的蛋白水平产品；

3)提高内皮细胞增殖速度产品；

4)降低内皮细胞死亡率产品；

5)提高内皮细胞活性产品。

本发明还提供VE-cadherin/Akt/FOXM1信号通路上调剂在制备治疗脓毒症并发急性肺损伤和/或并发内皮损伤产品中的用途。

如上所述，本发明的特异性结合KLK8的物质在制备脓毒症预防、治疗或诊断产品中的用途，具有以下有益效果：确定了KLK8上调在LPS诱导的肺内皮屏障功能障碍发展中的新作用。通过基因敲除或使用抗KLK8中和抗体抑制KLK8，可显著缓解LPS诱导的内皮高通透性、急性肺损伤和死亡率。在机制方面，本发明发现KLK8诱导的VE-cadherin/Akt/FOXM1通路失活在介导内皮再生损伤和随后的肺血管渗漏中对LPS反应的关键作用。因此，通过中和抗体抑制KLK8可能是恢复脓毒症期间微血管屏障完整性的一种新的治疗策略。

附图说明

图1显示为LPS诱导的脓毒症模型中肺部KLK8表达图，其中：A-B,分别为LPS暴露24小时肺组织(n＝6)或MLVECs(n＝4)中KLKs mRNA水平。C-D,LPS暴露24小时后肺组织(n＝6)或MLVECs(n＝4中KLK8蛋白水平。E-F,内皮细胞标记物CD31(绿色)和KLK8(红色)抗体进行染色,定量测量对照或脓毒症小鼠肺组织切片中KLK8

图2显示为KLK8过表达后各指标变化图，其中A-C,MLVECs使用KLK8腺病毒(Ad-KLK8)处理48小时(n＝4)。A,Western Blot检测MLVECs中KLK8、CD31、ZO-1和ICAM-1蛋白水平。B,MTT检测MLVECs细胞活力。C，FITC检测MLVECs内皮通透性。D-G，小鼠经气管内灌注Ad-Vector或Ad-KLK8 48小时(n＝6)。D，Western Blot肺组织KLK8、CD31、ZO-1、ICAM-1蛋白水平。E，Evans Blue dye检测肺组织血管渗漏。F-G，HE进行肺组织病理学评价。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05，**p<0.01。

图3显示为抑制KLK8表达后对LPS诱导的肺组织损伤结果图，其中A-C使用Control-siRNA或KLK8-siRNA转染MLVECs 48小时。然后LPS(1,000ng/ml)再处理细胞24小时(n＝4)。A,Western Blot检测MLVECs中CD31、ZO-1和ICAM-1蛋白水平。B,MTT检测MLVECs细胞活力。C，FITC检测MLVECs内皮通透性。D-H、KLK8敲除(KLK8

图4显示为给予抗KLK8抗体后对LPS诱导的肺组织损伤结果图，其中A-D，小鼠经尾静脉注射抗KLK8中和抗体或IgG同型对照抗体。30分钟后，小鼠腹腔注射30mg/kg的LPS，对照组注射等量生理盐水(n＝6)。A,Western Blot检测肺组织CD31、ZO-1、ICAM-1蛋白水平。B，Evans Blue dye肺组织血管渗漏。C-D，HE进行肺组织病理学评价。E，Kaplan-Meier分析生存曲线(n＝30)。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05，**p<0.01。

图5显示为使用Ad-Vector或Ad-KLK8处理MLVECs 48小时，KLK8过表达后对通路中分子的影响。RNA-Seq分析异常基因(n＝4)。A，Ad-KLK8处理的MLVECs中显示差异表达基因的火山图。B,DEGs热图。C，描述异常通路的分子特征，以及每个通路中的基因数量，归一化富集分数(NES)和归一化p值(NOM)。D,IPA预测Ad-KLK8处理的MLVECs中负责基因表达谱改变的上游调控因子。E,IPA数据集中FOXM1及其靶分子的热图。F,Ad-KLK8处理的MLVECs中FOXM1的mRNA和蛋白水平(n＝4)。G-L，MLVECs分别用慢病毒载体(Len-Vector)或FOXM1慢病毒(Len-FOXM1)感染30min，然后用Ad-Vector或Ad-KLK8处理48h。G-H，Edu检测细胞增殖。I,实时荧光定量PCR检测FOXM1靶分子Ccnd1,Cdc20,Ccnf,Bub1b的mRNA水平。J,Western Blot检测MLVECs中FOXM1、CD31、ZO-1和ICAM-1的蛋白水平。K,MTT检测MLVECs细胞活力。L,FITC检测MLVECs内皮通透性。数据以平均值±标准差(n＝4)表示。*p<0.05；**p<0.01。

图6显示为KLK8诱导内皮屏障功能障碍的结果图，其中，A,PI3K-AKT-MTOR信号通路调控基因的基因集富集分析图,FOXM1热图和PI3K-AKT-MTOR信号通路失调靶基因。B，Western Blot检测Ad-KLK8处理MLVECs 48小时后p-Akt和Akt蛋白水平。C，Akt激活剂SC79预处理后，Ad-KLK8处理MLVECs48小时，Western Blot检测MLVECs中p-Akt、Akt和FOXM1的蛋白水平(10M)。D，Western Blot检测Ad-KLK8处理48小时后，MLVECs(n＝4)或肺组织(n＝6)中VE-cadherin的蛋白水平。E,Western Blot检测Ad-KLK8处理48小时后，培养基中N末端VE-cadherin片段(n＝4)。F，使用慢病毒载体(Len-Vector)或VE-cadherin慢病毒(Len-VE-cadherin)感染MLVECs 30min后，Ad-KLK8处理MLVECs 48小时,Western Blot检测MLVECs中VE-cadherin、FOXM1、p-Akt和Akt的蛋白水平(n＝4)。G，Len-VE-cadherin和/或Akt抑制剂AZD5363的情况下，Ad-KLK8处理MLVECs 48小时，Western Blot检测MLVECs中VE-cadherin和FOXM1的蛋白水平(n＝4)。数据以平均值±标准差表示。*p<0.05；**p<0.01。

图7显示为KLK8缺失或阻断后的检测结果，其中，A,C,KLK8敲除小鼠(KLK8

图8显示为KLK8缺失或阻断后的免疫组化检测结果，其中，A，C，KLK8缺陷(KLK8-/-)小鼠和对照组(KLK8+/+)小鼠腹腔注射30mg/kg LPS。C和D，小鼠经尾静脉注射抗klk8中和抗体或IgG同型抗体。30分钟后，小鼠腹腔注射30mg/kg的LPS，对照组注射等量生理盐水,48小时后，收集肺组织切片，进行抗内皮细胞标记物CD31(红色)和细胞增殖标记物Ki-67(绿色)的免疫组化染色。B，D，KLK8

图9显示为本发明的过表达腺病毒载体图谱。

图10显示为本发明的慢病毒载体(Len-Vector)或FOXM1慢病毒(Len-FOXM1)的载体图谱。

具体实施方式

本研究中发现，KLKs家族中的KLK8在LPS暴露的肺组织或MLVECs中表达明显上调。从KLK8敲除、肺内KLK8过表达和KLK8中和抗体处理的小鼠中获得的联合证据表明，KLK8上调有助于LPS诱导的内皮细胞高通透性和急性肺损伤。进一步转录谱分析显示，KLK8诱导的VE-cadherin/Akt/FOXM1通路失活在介导内皮再生损伤和随后的肺血管渗漏中发挥关键作用，这为脓毒症血管保护药物的开发提供了靶点。

本发明提供KLK8或其编码基因作为靶标在制备脓毒症预防、治疗或诊断产品中的用途。

组织激肽素相关肽酶(KLKs)包括15个分泌丝氨酸肽酶，分别为KLK1至KLK15。KLK8，即组织激肽释放酶相关多肽酶8，是一种在中枢神经系统中大量表达的类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

所述KLK8或其编码基因作为靶标在制备浓度症预防、治疗或诊断产品具体是指：将KLK8蛋白或其编码基因作为识别对象，能够降低KLK8水平或抑制KLK8发挥作用的物质。

在本发明的某些实施方式中，所述用途为在制备治疗脓毒症并发急性肺损伤和/或并发内皮损伤产品中的用途。

在一种实施方式中，所述用途为在制备治疗脓毒症并发肺内皮损伤产品中的用途。所述治疗脓毒症并发肺内皮损伤产品可以是肺内皮再生产品或血管修复产品。

所述脓毒症为机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，具体定义和诊断标准参考如下：2016年2月在第45届危重病医学年会上美国重症医学会(SCCM)与欧洲重症医学会(ESICM)联合发布脓毒症的3.0定义及诊断标准。

其中，所述急性肺损伤包括早期阶段的急性肺损伤和重度阶段的急性呼吸窘迫综合征。

所述急性肺损伤的表现包括肺组织血管渗漏等。

内皮损伤表现包括内皮高通透性、内皮标志物例如CD31、ZO-1蛋白水平下调等。

本发明还提供特异性结合KLK8的物质在制备脓毒症预防、治疗或诊断产品中的用途。

在本发明的某些实施方式中，所述用途为在制备治疗脓毒症并发急性肺损伤和/或并发内皮损伤产品中的用途。

在一种实施方式中，所述特异性结合KLK8的物质选自KLK8抑制剂。

KLK8抑制剂指对于KLK8具有抑制效果的分子。对于KLK8具有抑制效果包括但不限于：抑制KLK8的水平或活性。

抑制KLK8活性是指使KLK8活力下降。优选地，相比抑制前，KLK8活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制KLK8水平可以是通过抑制KLK8基因的转录或翻译，具体的，可以是指：使KLK8基因不转录，或降低KLK8基因的转录活性，或者使KLK8基因不翻译，或降低KLK8基因的翻译水平。

本领域技术人员可以使用常规方法对KLK8基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

所述基因敲除可以为完全基因敲除或条件型基因敲除。所述条件型基因敲除可以通过Cre/LoxP系统或Gin/Gix系统实现。

优选地，与野生型相比，KLK8基因表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地KLK8基因完全没有表达。

所述KLK8抑制剂包括但不限于：核酸分子、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白、干扰慢病毒、腺相关病毒、纳米颗粒、脂质体、细胞外囊泡或细胞。所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶I II制备的小干扰RNA(siRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。

所述脓毒症预防、治疗或诊断产品必然包括特异性结合KLK8的物质，并以特异性结合KLK8的物质作为有效成分。

在本发明的某些实施方式中，所述KLK8抑制剂为siRNA。所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示。

在本发明的某些实施方式中，所述KLK8抑制剂为抗KLK8中和抗体。

所述脓毒症预防、治疗或诊断产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述脓毒症预防、治疗或诊断产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述脓毒症预防、治疗或诊断产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述脓毒症预防、治疗或诊断产品包括但不限于药物、食品等。

所述脓毒症预防、治疗或诊断产品通过以下任一种或多种方式治疗脓毒症：

1)降低内皮细胞通透性或改善毛细血管渗漏；

2)刺激VE-cadherin/Akt/FOXM1信号通路；优选的，选自上调FOXM1及其下游靶基因表达水平、上调AKT或p-AKT蛋白水平或上调VE-cadherin的蛋白水平；

3)提高内皮细胞增殖速度；

4)降低内皮细胞死亡率；

5)提高内皮细胞活性。

在本发明的某些实施方式中，FOXM1下游靶基因例如为：Ccnd1、Cdc20、Ccnf、Bub1b。

本发明还提供特异性结合KLK8的物质在制备以下任一项或多项产品中的用途：

1)降低内皮细胞通透性产品或改善毛细血管渗漏产品；

2)刺激VE-cadherin/Akt/FOXM1信号通路产品；优选的，选自上调FOXM1及其下游靶基因表达水平产品、上调AKT产品或上调p-AKT蛋白水平产品或上调VE-cadherin的蛋白水平产品；

3)提高内皮细胞增殖速度产品；

4)降低内皮细胞死亡率产品；

5)提高内皮细胞活性产品。

本发明还提供VE-cadherin/Akt/FOXM1信号通路上调剂在制备治疗脓毒症并发急性肺损伤和/或并发内皮损伤产品中的用途。

在本发明的某些实施方式中，所述VE-cadherin/Akt/FOXM1信号通路上调剂选自VE-cadherin上调剂、Akt上调剂或FOXM1上调剂。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1LPS诱导的脓毒症模型中肺部KLK8表达升高

动物实验：

实验动物为SPF级C57小鼠，将实验小鼠随机分为以下2组(每组6只)。

对照组：即LPS 0ng/ml组，正常饲养。

脓毒症组：腹腔注射不同浓度的脂多糖(LPS，30mg/kg)诱导脓毒症模型，干预48小时：

LPS 10ng/ml组

LPS 100ng/ml组

LPS 1000ng/ml组

利用LPS诱导脓毒症模型干预48小时后，麻醉小鼠，取肺组织检测KLK8蛋白水平表达。

体外实验：

提取3-4周龄ICR小鼠原代肺血管内皮细胞(Mouse lung vascular endothelialcells,MLVECs)，LPS剂量(0，10,100,1000ng/ml)干预24小时(每组n＝4)。

结果：如图1所示，LPS处理后在体内外均能显著诱导肺血管内皮细胞KLK8表达。实时荧光定量PCR,Western Blot及免疫组化检测脓毒症小鼠肺组织均表明KLK8表达升高。体外实验同样观察到LPS处理后MLVECs中KLK8表达升高。

实施例2.KLK8过表达对肺的影响

体外实验：

MLVECs以不同MOI(1,3 10)分别处理48小时，分组如下：

Ad-vector组，过表达腺病毒载体图谱如图9所示。

Ad-KLK8 1MOI组，过表达腺病毒载体图谱如图9所示，插入基因编码片段为KLK8编码序列(NM_008940)

Ad-KLK8 3MOI组

Ad-KLK8 10MOI组

MLVECs以不同MOI(1,3 10)分别处理48小时后，Western Blot检测KLK8、CD31、ZO-1、ICAM-1蛋白水平，MTT检测细胞活性，FITC检测内皮通透性。

动物实验：

实验动物为SPF级小鼠。气管滴注构建肺组织KLK8过表达模型，气管滴注48小时。实验小鼠随机分为以下2组(每组6只)：

Ad-Vector组：气管滴注Ad-Vector，10

Ad-KLK8组：气管滴注Ad-KLK8，10

气管滴注腺病毒48小时后取肺组织，Western Blot检测KLK8、CD31、ZO-1、ICAM-1蛋白水平，Evans Blue dye检测肺组织血管渗漏，HE形态学检测进行肺组织病理学评价。

结果如图2所示，KLK8过表达导致内皮细胞CD31、ZO-1、ICAM-1蛋白水平下降，细胞活力降低，细胞通透性增加。KLK8过表达导致小鼠肺组织CD31、ZO-1、ICAM-1蛋白水平下降，肺毛细血管渗漏增加，肺组织损伤评分增高，即KLK8过表达会导致急性肺损伤。

实施例3.抑制KLK8表达后减轻了LPS诱导的肺组织损伤

体外实验：

MLVECs以siRNA预处理48小时后，LPS干预24小时。

分组：Control siRNA组，Control siRNA的序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO.1)，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.2)

KLK8 siRNA组，KLK8 siRNA序列：5’-CCUGGAUCAAGAAGACCAUTT-3’(SEQ ID

NO.3)，5’-AUGGUCUUCUUGAUCCAGGTT-3’(SEQ ID NO.4)

Control siRNA+LPS组

KLK8 siRNA+LPS组

细胞转染siRNA 48小时后，LPS处理24小时。Western Blot检测CD31、ZO-1、ICAM-1蛋白水平，MTT检测细胞活性，FITC检测内皮通透性。

动物实验：

实验动物为SPF级KLK8敲除小鼠，LPS诱导脓毒症小鼠模型。KLK8敲除小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司构建，构建步骤大致如下：应用Cre-loxp系统KLK8-flox标签小鼠，进而利用KLK8-flox标签小鼠与EIIa-Cre转基因小鼠交配，从而获得KLK8敲除小鼠。KLK8flox/flox；EIIa-Cre(+)(KLK8-/-)，与年龄匹配的KLK8flox/flox；EIIa-Cre(-)同窝小鼠(KLK8+/+)作为对照，研究KLK8缺失的影响。将基因型相同的小鼠按1:1的比例随机分配给KLK8敲除组和KLK8敲除+LPS组。野生型实验小鼠随机分配。每组6只。

野生型对照组：腹腔注射等剂量生理盐水。

野生型LPS组：腹腔注射LPS(30mg/kg)诱导脓毒症模型，造模时间为48小时。

KLK8敲除组：腹腔注射等剂量生理盐水。

KLK8敲除+LPS组：腹腔注射LPS(30mg/kg)诱导脓毒症模型，造模时间为48小时。

LPS诱导脓毒症小鼠模型24小时后，Western Blot检测CD31、ZO-1、ICAM-1蛋白水平，Evans Blue dye检测肺组织血管渗漏，LPS诱导脓毒症小鼠模型48小时后，HE形态学检测进行肺组织病理学评价，Kaplan-Meier分析脓毒症小鼠生存情况。

结果如图3所示：

1.抑制MLVECs中KLK8表达显著改善了LPS诱导的内皮标志物CD31、ZO-1蛋白水平下调，降低了ICAM-1的表达，细胞活性显著增高，细胞通透性明显下降。

2.KLK8敲除小鼠中，LPS诱导的肺组织内皮标志物CD31、ZO-1蛋白水平明显升高，ICAM-1的表达下降，改善了肺毛细血管渗漏，减轻了LPS诱导的肺组织损伤。

综上，KLK8可改善LPS引起的内皮高通透性和急性肺损伤，降低系统性LPS引起的死亡。

实施例4.给予抗KLK8抗体后减轻了LPS诱导的肺组织损伤

实验动物为SPF级C57小鼠，尾静脉注射anti-KLK8中和抗体(M081-3M2,MBLInternational；20μg/kg)或IgG同型(MBL International；20μg/kg)，30分钟后，腹腔注射LPS构建脓毒症模型。实验小鼠随机分为以下4组(每组6只)48小时后取肺组织。

IgG组：腹腔注射等剂量生理盐水。

IgG+LPS组：腹腔注射LPS(30mg/kg)诱导脓毒症模型，共48小时。

Anti-KLK8组：腹腔注射等剂量生理盐水。

Anti-KLK8+LPS组：腹腔注射LPS(30mg/kg)诱导脓毒症模型，共48小时。

LPS诱导脓毒症小鼠模型24小时后，Western Blot检测CD31、ZO-1、ICAM-1蛋白水平，Evans Blue dye检测肺组织血管渗漏，LPS诱导脓毒症小鼠模型48小时后，HE形态学检测进行肺组织病理学评价，Kaplan-Meier分析脓毒症小鼠生存情况。

结果如图4所示，尾静脉注射KLK8中和抗体抑制体内KLK8表达的脓毒症小鼠肺组织内皮标志物CD31、ZO-1蛋白水平显著改善，ICAM-1的表达下降，肺毛细血管渗漏降低，LPS诱导的肺组织损伤减轻，并降低系统性LPS引起的死亡率。

实施例5.KLK8过表达引起FOXM1的表达下降，FOXM1过表达逆转了KLK8过表达引起的肺损伤

MLVECs经AdKLK8(3MOI)腺病毒处理48小时，进行RNA-Seq分析。

Ad-Vector组

Ad-KLK8组

结果如图5中A-F所示，通过RNA-Seq分析得出Ad-KLK8过表达后MLVECs中的异常基因，异常通路的分子特征，以及每个通路中的基因数量，使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)预测得出Ad-KLK8处理的MLVECs中负责基因表达谱改变的上游调控因子。实验结果显示Ad-KLK8处理的MLVECs中FOXM1的mRNA和蛋白水平表达显著下降。

MLVECs分别用慢病毒载体(Len-Vector)或FOXM1慢病毒(Len-FOXM1)以10MOI感染30min，然后用Ad-Vector或Ad-KLK8(3MOI)处理48h。Len-Vector、Len-FOXM1载体表达图谱如图10所示，Len-FOXM1插入基因编码序列为NM_008021。

Len-Vector+Ad-Vector组

Len-Vector+Ad-KLK8组

Len-FOXM1+Ad-Vector组

Len-FOXM1+Ad-KLK8组

结果如图5中G-L所示，FOXM1过表达显著逆转了KLK8过表达引起的细胞增殖下降和FOXM1下游靶基因(Ccnd1,Cdc20,Ccnf,Bub1b)降低，有效改善了内皮标志物损伤，增加了细胞活性，降低了内皮通透性。

实施例6.KLK8通过抑制VE-cadherin/Akt/FOXM1信号通路介导的内皮细胞增殖诱导内皮屏障功能障碍

MLVECs经AdKLK8腺病毒处理48小时，进行基因集富集分析(Gene Set EnrichmentAnalysis,GSEA)分析，查找调控FOXM1上游信号通路。

使用Akt激活剂SC79(10μM)预处理MLVECs，随后Ad-KLK8(3MOI)处理MLVECs48小时，分组如下：

Ad-Vector组

Ad-KLK8组

SC79+Ad-Vector组

SC79+Ad-KLK8组

实验动物为SPF级小鼠。气管滴注构建肺组织KLK8过表达模型，气管滴注48小时。实验小鼠随机分为以下2组(每组6只)。

Ad-Vector组

Ad-KLK8组

使用VE-cadherin慢病毒(10μM，载体表达图谱如图10所示，插入基因编码序列为NM_009868)预处理MLVECs，随后Ad-KLK8(3MOI)处理MLVECs48小时，分组如下：

Len-Vector+Ad-Vector组

Len-Vector+Ad-KLK8组

Len-VE-cadherin+Ad-Vector组

Len-VE-cadherin+Ad-KLK8组

使用Akt抑制剂AZD5363(10μM)预处理MLVECs，随后Ad-KLK8(3MOI)处理MLVECs48小时，分组如下：

Ad-Vector组

Ad-KLK8组

AZD5363+Ad-Vector组

AZD5363+Ad-KLK8组

结果如图6所示：

1.GSEA筛选结果表明AdKLK8处理后MLVECs中PI3K-AKT-MTOR信号通路下调，Western Blot结果显示p-Akt和Akt蛋白水平下降。使用Akt激活剂SC79预处理MLVECs，随后Ad-KLK8处理MLVECs，Western Blot结果表明p-Akt、Akt和FOXM1的蛋白水平均显著改善。这些结果表明KLK8可能通过诱导Akt信号失活负向调控FOXM1表达。

2.Ad-KLK8处理后的MLVECs或肺组织中VE-cadherin的蛋白水平明显降低。Ad-KLK8处理48小时后，MLVECs培养基中N末端VE-cadherin片段显著增加。KLK8作为一种分泌的丝氨酸蛋白酶，已有研究表明KLK8能够介导VE-cadherin的外膜脱落，从而在糖尿病诱导的心脏纤维化发病过程中促进心肌EndMT的启动。VE-cadherin的断裂可使内皮细胞中的Akt信号通路失活。过表达VE-cadherin能够显著逆转Ad-KLK8诱导的MLVECs中VE-cadherin、FOXM1、p-Akt和Akt的蛋白水平的降低。AKT抑制剂AZD5363预处理消除了VE-cadherin对Ad-KLK8诱导的MLVECs中VE-cadherin和FOXM1下调的保护作用。

实验结果提示，KLK8可能通过抑制VE-cadherin/Akt/FOXM1信号通路介导的内皮细胞增殖诱导内皮屏障功能障碍。

实施例7.KLK8缺失或阻断可改善内皮损伤和细胞增殖

动物实验一：

实验动物为SPF级KLK8敲除小鼠，LPS诱导脓毒症小鼠模型。实验小鼠随机分为以下4组(每组6只)：

野生型对照组：腹腔注射等剂量生理盐水。

野生型LPS组：腹腔注射LPS(30mg/kg)诱导脓毒症模型，造模时间为48小时。

KLK8敲除组：腹腔注射等剂量生理盐水。

KLK8敲除+LPS组：腹腔注射LPS(30mg/kg)诱导脓毒症模型，造模时间为48小时。

动物实验二：

实验动物为SPF级C57小鼠，尾静脉注射anti-KLK8中和抗体，30分钟后，腹腔注射LPS构建脓毒症模型。实验小鼠随机分为以下4组(每组6只)48小时后取肺组织：

IgG组：腹腔注射等剂量生理盐水。

IgG+LPS组：腹腔注射LPS(30mg/kg)诱导脓毒症模型，共48小时。

Anti-KLK8组：腹腔注射等剂量生理盐水。

Anti-KLK8+LPS组：腹腔注射LPS(30mg/kg)诱导脓毒症模型，共48小时。

结果如图7所示，Western Blot和实时荧光定量PCR结果显示KLK8缺失或阻断可改善VE-cadherin/Akt/FOXM1信号通路，上调FOXM1下游靶基因(Ccnd1,Cdc20,Ccnf,Bub1b)表达水平，促进内皮细胞再生。

免疫组化结果如图8所示，KLK8缺失或阻断可改善内皮损伤和细胞增殖。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。