基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控三明治酶联免疫法检测平台和应用

摘要

本发明公开了基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控三明治酶联免疫检测平台及方法和应用，该检测平台包括试剂供给单元、微流体通道和废液收集装置，试剂供给单元与微流体通道的入口连接，废液收集装置与微流体通道的出口连接该检测平台基于免疫夹心反应、核酸滚环扩增、酶催化底物生成电化学活性物质通过检测电化学信号强度检测标志物；进样过程可由注射泵控制，全部在微米级的微流控芯片上完成，整个过程重复性好，适合大批量生产，而且该诊断平台可进一步制成便携式诊断装置，进一步实现了床旁检测在家庭或城市地区的临床诊断应用。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白检测领域，具体涉及基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控免疫检测方法和使用的检测装置。

背景技术

即时检测技术(POCT)是现代医学检验领域极具潜力的新型检测技术。与传统临床检验相比，具有检测快速、操作简便、成本低、样品用量少等优点。随着各种生物传感技术如丝网印刷电极、免疫标记、酶联技术、生物芯片技术等在POCT中广泛应用，与传统的生化分析仪相比极大的缩短了分析时间并降低了检测成本，也为患者提供了自身随时监测的方便。目前主要开发公司有瑞士罗氏、德国拜耳、美国雅培、日本京都等。市场容量大的主要产品为血糖试纸条、尿酸试纸条，但市售的大部分血糖、尿酸等检测试纸条都是利用酶生物传感器与丝网印刷技术制造。酶的成本高、固定非常复杂、稳定性较差，且其活性很容易受pH、温度、湿度和有毒化学品等因素的影响，因此，市售的试纸条成本较高且保质期较短，通常要放置在4℃冰箱内进行储存，尤其是在启封后试纸条的保质期仅有三个月。此外，这类试纸条需要病人进行针刺采血测试且不能实现连续动态监测，这都使其在日常生活中的应用受到一定的限制。因此，针对目前酶电化学试纸条在实际应用中存在的问题和挑战，急需开发新一代高性能、低成本、非针刺采血的仿生酶电化学传感芯片。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控三明治酶联免疫法检测平台；本发明的目的之二在于提供利用所述的超灵敏微流控三明治酶联免疫法检测平台检测蛋白标志物的方法；本发明的目的之三在于提供所述基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控免疫检测平台在制成便携式及时诊断装置中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控三明治酶联免疫法检测平台，所述检测平台基于三明治酶联免疫检测方法、核酸滚环扩增信号放大、酶催化底物生成电化学活性物质检测电化学信号并通过调高浓度和调长反应时间实现信号进一步放大；

所述检测平台包括试剂供给单元、微流体通道和废液收集装置，试剂供给单元与微流体通道的入口连接，废液收集装置与微流体通道的出口连接；

所述试剂供给单元包括清洗溶液储存器、待测物储存器、一抗储存容器、滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/二抗复合物储存器、滚环扩增反应液储存器、电化学酶修饰的DNA 片段储存器和底物储存器；所述电化学酶修饰的DNA片段储存器中的电化学酶修饰的DNA 片段能与滚环扩增引发片段互补配对；

所述微流体通道设置有至少一个检测电化学信号的传感电极，传感电极上修饰有特异识别待测物的多肽。

本发明优选的，所述微流体通道由一个或多个进样通道组成，所述进样通道设置有至少一个分流道，修饰多肽的传感电极设置于分流道上。

本发明优选的，所述废液收集装置与微流体通道的出口之间还连接有微流控清洗单元，微流控清洗单元一端与微流体通道出口连接，一端与废液收集装置连接，还设置有与底物储存器连通的管道，用于底物回收并循环利用。

本发明优选的，所述清洗溶液为磷酸缓冲液PBS；所述滚环扩增反应液由三磷酸脱氧核苷酸：牛血清白蛋白：phi29 DNA聚合酶：10×RCA反应缓冲液：H

本发明优选的，所述滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/二抗复合物由以下方法制备：将金纳米粒子加入浓度比为100:1的T1和T2 DNA混合溶液中，震摇后，逐滴加入浓度为 1M的NaCl溶液以除去未反应的DNA，沉淀重溶于PBS溶液中；随后加入CPP溶液，形成T1-金纳米粒子-T2溶液，进一步通过EDC-硫化NHS交联抗体，合成T1-金纳米粒子-T2/抗体溶液，得到滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/二抗复合物；所述T1和T2为DNA连接片段，所述T1上含有与电化学酶修饰的DNA片段的互补序列。

2、利用所述的超灵敏微流控三明治酶联免疫法检测平台检测蛋白标志物的方法，包括如下步骤：

(1)三明治酶联免疫法：向微流体通道中通入第一抗体，通入清洗溶液清洗后通入待测蛋白，使待测蛋白与一抗配对结合，然后加入PBS清洗，然后再通入滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/二抗复合物，与待测蛋白配对结合，形成三明治结构，然后通入PBS清洗；

(2)核酸滚环扩增：在固定了滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/二抗复合物的微流体通道内通入滚环扩增反应液，利用其中的DNA聚合酶进行扩增，再通入PBS清洗；

(3)电化学活性物质产生及检测：向滚环扩增反应后的微流体通道内通入与滚环扩增引发片段配对且用电化学酶修饰的DNA片段，充分反应使滚环扩增引发片段与电化学酶修饰的DNA片段配对结合，再通入PBS清洗，然后通入底物并在电化学酶催化下被转化为电化学活性物质，由此调高底物浓度和/或延长反应时间，实现电化学信号双重放大特效，并通过电化学方法检测。

本发明优选的，所述DNA聚合酶为但不限于phi 29DNA聚合酶。

本发明优选的，所述待测物为但不限于蛋白质或核酸。

本发明优选的，所述待测物为但不限于人表皮生长因子2，所述特异识别待测物抗体为但不限于人表皮生长因子2特异性识别多肽。

3、所述基于DNA信号滚环扩增和底物浓度调高和/或反应时间延长，从而产生电化学信号双重放大特效，该超灵敏微流控三明治酶联免疫法检测平台能但不限于广泛应用于便携式及时诊断医疗装置中。

本发明的有益效果在于：本发明公开了基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控免疫检测平台，首先，利用免疫夹心反应将检测目标物与循环放大引发片段结合，固定在芯片基底的检测区域；随后，触发DNA放大过程，产生含有重复单元的长单片段；最后，长单片段与蛋白修饰的DNA片段互补配对，催化底物转化为电化学活性物质，继而用成本低、灵敏度高的电化学工作站或便携式电化学装置即可检测。由于原理的普适性，通过改变相应的抗体，适配体，该平台也可检测其他的蛋白或核酸标志物。整个过程不需使用复杂的仪器，尤其适用于经济水平不发达的国家和地区。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为微流控免疫诊断芯片；

图2为超灵敏微流控免疫检测原理图；

图3为RCA反应过程及表征(A：RCA过程示意图；B：RCA过程的凝胶电泳图；C： RCA产物的三维原子力显微镜图；D：5处RCA产物的高度)。

图4为DNA和抗体修饰的金纳米粒子合成过程及表征(A：合成过程图；B：紫外表征；C：电镜结果)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控免疫检测芯片

基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控三明治酶联免疫诊断芯片，结构如图1 所示，包括试剂供给单元1，微流体通道和废液收集装置3，试剂供给单元与微流体通道的入口连接，废液收集装置与微流体通道的出口连接；

微流体通道设置有至少一个检测电化学信号的传感电极4，传感电极上能修饰特异识别待测物的多肽，如抗体；优选的，所述微流体通道由一个或多个进样通道组成，所述进样通道设置有至少一个分流道，能修饰多肽的传感电极设置于分流道上，由两个以上的进样通道和2个以上的分流道形成阵列结构。

试剂供给单元包括清洗溶液储存器5、待测物储存器7、一抗储存器6、滚环扩增(RCA) 引发片段修饰的金纳米粒子/二抗复合物储存器8、滚环扩增反应液储存器10、电化学酶修饰的DNA片段储存器(该DNA片段与滚环扩增引发片段互补)11和底物储存器9；

废液收集装置与微流体通道的出口之间还连接有微流控清洗单元，微流控清洗单元一端与微流体通道出口连接，一端与废液收集装置3连接，还设置有与底物储存器9连通的管道，用于底物回收并循环利用，经反应液中的将氧化反应产物PQI在电极的作用下还原，生成电活性产物PAP输送回底物储存器，提高检测灵敏度，降低样品用量。

本实施例试剂供给单元可由注射泵控制，全部在微米级的微流控芯片上完成，整个过程重复性好，适合大批量生产，而且该诊断平台可进一步制成基于DNA信号放大和便携式电化学装置的超灵敏微流控便携式诊断装置。此外，通过改变特异性抗体或适配体，该平台可以应用于其他蛋白或核酸标志物的检测，实现了床旁检测在家庭或城市地区的临床诊断应用。

实施例2、基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控三明治酶联免疫检测的方法

基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控三明治酶联免疫检测方法，其原理如图2所示，包括如下步骤：

(1)免疫夹心反应：向微流体通道中连通一抗储存器通入一抗(羊抗鼠IgG)，使微流体通道中修饰特异识别待测物的抗体(一抗)，然后向修饰有特异识别待测物抗体的微流体通道中通入待测物(鼠IgG)使抗体捕获待测物，然后加入清洗溶液PBS，再通入滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/二抗复合物(T1/锁挂DNA-金纳米粒子-T2/鼠抗鼠IgG抗体)并停留30分钟完成T1/锁挂DNA-金纳米粒子-T2/抗体固定，然后通入清洗溶液PBS；

(2)核酸滚环扩增：在固定了T1/锁挂DNA-金纳米粒子-T2/抗体的微流体通道内通入RCA 反应液，停留30分钟，利用RCA反应液中的DNA聚合酶进行扩增，再流入清洗溶液PBS；

(3)电化学活性物质产生及检测：向RCA反应后的微流体通道内通入与锁挂DNA互补且用电化学酶修饰的DNA片段，充分反应使锁挂DNA与DNA片段互补，再通入催化底物使电化学酶将底物转化为电活性物质，反应液流出后通过电化学工作站检测。

本实施例中，T1/锁挂DNA-金纳米粒子-T2/抗体合成步骤如下：15nm的金纳米粒子加入 T1和T2混合溶液(浓度比100:1)，震摇20h后，逐滴加入一定体积的NaCl(C＝1M)溶液，离心(12000rpm)15分钟以除去未反应的DNA，沉淀重溶于PBS溶液中。随后加入一定浓度的CPP溶液，形成T1/锁挂DNA-金纳米粒子-T2溶液，进一步通过EDC-硫化NHS交联抗体，合成T1/锁挂DNA-金纳米粒子-T2/抗体溶液。

其中T1的核苷酸序列为：5’-tttttttttttttttaaggcgaaga caggtgttagtcga-3’；

T2的核苷酸序列为：5’-tttttttttttttttttttt-3’。

RCA反应液体积比包括但不限于三磷酸脱氧核苷酸:牛血清白蛋白:phi29 DNA聚合酶:10 ×RCA反应缓冲液:H

电化学酶修饰的DNA片段中酶为碱性磷酸酶，DNA片段序列为： 5’-gtttcctttccttgaaacttcctttcga-3’。

底物为氨基苯基磷酸酯，在检测中，碱性磷酸酶(ALP)对氨基苯基磷酸酯(PAPP)进行酶促转化生成对氨基苯酚(PAP)，PAP是电化学活性物质，通过以参比电极为基准向工作电极施加电压，PAP被氧化为对苯醌亚胺(PQI)，产生电子，实现电化学检测。

实施例3、基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控免疫检测人表皮生长因子2

HER2是一种与乳腺癌相关的跨膜酪氨酸激酶受体，当血液中HER2水平超过15.0ng/mL 时，预示患者有可能存在乳腺癌潜在风险。本实施例构建基于DNA信号放大和电化学检测的超灵敏微流控免疫检测人表皮生长因子2(HER2)的平台，包括如下步骤：

使用如图1所示的微流控免疫检测芯片，在芯片基底的超薄玻璃上修饰HER2特异性识别多肽，往芯片的样品池中依次注入通入HER2样品，PBS，T1/锁挂DNA-金纳米粒子-T2/抗体溶液，PBS，RCA反应液，PBS，T3-酶复合物，PBS，和底物溶液，然后进行用电化学工作站进行检测。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。