法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-08-08
授权
发明专利权授予
2023-06-20
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N 9/12 专利申请号:2023104745120 申请日:20230428
实质审查的生效
2023-06-02
公开
发明专利申请公布
技术领域
本申请涉及生物技术领域,具体涉及一种组合物及研究蛋白质-DNA互作基因文库的构建方法。
背景技术
染色质免疫沉淀(ChIP)是广泛用于研究蛋白质与DNA相互作用的方法,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与大规模平行DNA测序技术相结合,可以让研究者精确绘制感兴趣蛋白的全局DNA结合位点。ChIP的基本流程是:(1)交联:采用甲醛固定组织或细胞,使DNA与蛋白质紧密结合;(2)片段化:该过程破坏染色质,最终获得用于 ChIP 分析的DNA 片段与蛋白复合物;(3)染色质免疫沉淀:通过加入针对目的蛋白的抗体,结合靶蛋白-DNA复合物;(4)DNA回收和纯化:回收纯化富集的DNA片段,通过下游检测技术(定量PCR、基因芯片、测序等)分析靶标蛋白特异结合的DNA序列信息(ParkP.J., et al.ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.NatRev Genet. 2009; 10: 669-680.)(图1)。然而,因ChIP技术需要对组织或细胞进行甲醛交联,然后再进行DNA片段化,这使得该技术需要极高的细胞起始投入量(百万级),并且很可能因为甲醛过度交联使实验结果存在假阳性。
为了弥补ChIP的技术缺陷,研究者通过不断的更新与优化,开发了CUT&Run(Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease)技术和CUT&Tag(Cleavage UnderTargets & Tagmentation)技术。CUT&Tag以及CUT&Run是研究生物活体细胞中蛋白质与DNA相互作用的技术(Skene, P. J. & Henikoff, S. An efficient targeted nucleasestrategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. 2017; eLife 6,e21856. ; Kaya-Okur HS., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling ofsmall samples and single cells. Nat Commun. 2019;10(1):1930.),其通过抗体富集TN5转座酶或Mnase核酸酶,特异切割目的蛋白附近的DNA。再通过对切割后标记的DNA进行文库构建和测序就可以绘制目的蛋白全局的DNA结合位点(图2)。该技术因为不需要交联和物理打断DNA,一定程度的缓解了ChIP技术假阳性和高细胞投入量的缺点。
虽然CUT&Tag和CUT&Run技术相较ChIP有明显提升,但是CUT&Tag和 CUT&Run依赖PA/PG-TN5/MNase融合蛋白与二抗Fc段进行结合,然后将TN5/MNase带到目标蛋白区域附近进行DNA切割。此过程一方面受限于PA/PG蛋白与二抗Fc段的结合能力,另一方面抗体的非特异结合以及染色质的可及性都会影响最后的数据。非特异结合的抗体会引导TN5酶或Mnase酶在非靶点区域发生切割,导致最终的结果出现假阳性。此外,转录因子(transcription factors,TF)主要结合在开放染色质区域的核小体耗尽区(nucleosomedepleted region,NDR)(Maxime M., et al.Chromatin Fiber Invasion and NucleosomeDisplacement by the Rap1 Transcription Factor. Molecular Cell. 2019; 77: 488-500.)(图3),在CUT&Tag或者CUT&Run实验过程中,异常的染色质状态调节会影响该技术对转录因子靶点以及兴奋性组蛋白修饰靶点的检测,故调节CUT&Tag以及CUT&Run技术中的染色质状态以及降低抗体的非特异结合能够有效提升该技术的检测能力和最终测序的数据质量。
发明内容
本申请的目的在于提供一种组合物及一种研究蛋白质-DNA互作的基因文库构建方法,通过降低转座酶结合缓冲液中的盐离子浓度,提升对转录因子靶点以及组蛋白修饰靶点的检测效果,同时降低抗体的非特异结合,减少Cut Tag以及Cut Run实验过程中假阳性。
本申请的第一方面提供一种组合物,其包含缓冲成分,NaCl,KCl,亚精胺,细胞透化剂和蛋白酶抑制剂,所述NaCl的浓度为10-300mM,例如10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM,90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM或300mM。
在一些实施方案中,所述细胞透化剂是例如Tween 20、洋地黄皂苷、皂素、聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇等。
在一些实施方案中,所述缓冲成分是例如HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、Tris、Tris-HCl、MOPS、PBS等。
在一些实施方案中,所述组合物包含HEPES,NaCl,KCl,亚精胺,洋地黄皂苷和蛋白酶抑制剂,所述NaCl的浓度为10-300mM,例如10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM,90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM或300mM。
在一些实施方案中,所述KCl的浓度为50-300mM,例如50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM或300mM。
在一些实施方案中,所述HEPES的浓度为10-100mM,例如10mM、12mM、15mM、18mM、20mM、22mM、25mM、28mM、30mM、35mM、40mM、45mM和50mM。
在一些实施方案中,所述亚精胺的浓度为0.1-5mM,例如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM。
在一些实施方案中,所述洋地黄皂苷(质量体积比,1%=1g/100ml)的浓度为0.01%-0.1%,例如0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%。在一些实施方案中,所述洋地黄皂苷以其能够保持细胞通透性并足以使一抗、二抗及转座体可进入细胞的量存在于组合物中。
在一些实施方案中,所述蛋白酶抑制剂具有广谱的蛋白酶抑制活性,所述蛋白酶抑制剂包括但不限于本领域已知的商品化或非商品化蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor)。
在一些实施方案中,所述蛋白酶抑制剂的用量根据各自的产品说明书指导的量或本领域公知的量加入。
在一些实施方案中,所述组合物包含10-50mM HEPES,50-300mM NaCl,50-300mMKCl,0.1-5mM亚精胺,0.01%-0.1% 洋地黄皂苷和有效量的蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中,所述组合物包含10-30mM HEPES,50-300mM NaCl,50-300mM KCl,0.1-2mM亚精胺,0.01%-0.05%洋地黄皂苷和有效量的蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中,所述组合物包含10-30mM HEPES,50-250mM NaCl,50-250mM KCl,0.1-1mM亚精胺,0.01%-0.05%洋地黄皂苷和有效量的蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中,所述组合物包含20mM HEPES,50-250mMNaCl,50-250mM KCl,0.5mM亚精胺,0.01%洋地黄皂苷和有效量的蛋白酶抑制剂。
“有效量的蛋白酶抑制剂”指能够有效保护反应体系中蛋白质不被水解的一定浓度范围的蛋白酶抑制剂,参考Vazyme TD903 用量。
在一些实施方案中,组合物的各组分浓度是上述各组分浓度的2-50倍,例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。
本申请的第二方面提供一种转座酶孵育系统,其包含转座酶复合物和第一方面的组合物。
在一些实施方案中,所述转座酶复合物为X-转座酶复合物,X例如是Protein A、Protein G或Protein AG,所述转座酶是例如Tn5转座酶,所述Tn5包埋有包含转座子末端序列及标签序列的部分双链寡核苷酸,所述标签序列可用于后续PCR扩增。
在一些实施方案中,所述转座酶复合物在所述转座酶孵育系统中的浓度是0.01-0.08μM,例如0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM或0.08μM。
在一些实施方案中,所述转座酶孵育系统中还包含样本,所述样本为透化的细胞。在一些实施方案中,所述细胞为至少100个、500个、1000个、2000个、5000个、8000个或10000个。
在一些实施方案中,本申请的数值或数值范围包括至多±20%、至多±10%、至多±5%、至多±4%、至多±3%、至多±2%或至多±1%的误差,其中“至多”包含本数。
本申请的第三方面提供一种转座酶反应组合物,其包含第一方面的组合物和二价金属盐。
在一些实施方案中,所述二价金属盐是例如Ca
本申请的第四方面提供一种转座酶反应系统,所述转座酶反应系统包含第二方面的转座酶孵育系统和二价金属盐。
在一些实施方案中,所述二价金属盐是例如Ca
在一些实施方案中,本申请的数值或数值范围包括至多±20%、至多±10%、至多±5%、至多±4%、至多±3%、至多±2%或至多±1%的误差,其中“至多”包含本数。
本申请的第五方面提供一种研究蛋白质-DNA互作的基因文库的构建方法,所述方法包含:
步骤(1)收集细胞样本,透化,加入靶蛋白(例如转录因子)结合一抗和二抗进行孵育,所述靶蛋白结合一抗与靶蛋白结合,所述二抗与靶蛋白结合一抗结合;
步骤(2)加入转座酶复合物与第一方面的组合物,孵育;
步骤(3)加入第三方面的转座酶反应组合物,进行片段化反应从而获得片段化的DNA;其中所述转座酶复合物包含能够与二抗结合的基团或物质、转座酶和含有转座酶识别核心序列(ME序列)和标签序列的寡核苷酸;所述能够与二抗结合的物质例如是Protein A、Protein G或Protein AG;
步骤(4)任选地,纯化片段化的DNA;
步骤(5)对DNA片段连接测序接头;
步骤(6)任选地,对接头连接后的产物进行纯化和/或扩增。
在一些实施方案中,所述步骤(1)还包括将收集的细胞样本与活化的磁珠进行孵育。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是转录因子或组蛋白。
在一些实施方案中,所述活化的磁珠是伴刀豆球蛋白A磁珠。
在一些实施方案中,所述透化包括加入含有细胞透化试剂的抗体孵育缓冲液。
在一些实施方案中,所述细胞透化试剂是洋地黄皂苷或吐温,例如0.01%-0.1%的洋地黄皂苷。
在一些实施方案中,所述细胞样本与靶蛋白结合一抗孵育完成后再与二抗进行孵育。
在一些实施方案中,所述步骤(1)还包括在细胞样本与活化的磁珠孵育完成后分离收集磁珠,和/或,细胞与靶蛋白结合一抗、二抗孵育完成后分离收集磁珠。
在一些实施方案中,所述步骤(2)还包括在孵育完成后分离收集磁珠。
在一些实施方案中,所述转座酶是Tn5转座酶,所述Tn5转座酶是本领域已知的任何Tn5转座酶或其活性突变体。
在一些实施方案中,所述步骤(5)包括加入与标签序列匹配并带有接头序列的引物,通过PCR扩增得到带有测序接头的DNA片段。
在一些实施方案中,所述引物包括带有第一接头序列的第一引物和带有第二接头序列的第二引物。
在一些实施方案中,所述接头序列是当前或将来测序平台(包括但不限于iontorrent平台、illumina平台和华大平台)使用的测序基质相关序列。
在一些实施方案中,所述第一接头序列是Illumina平台的P5接头序列,所述第二接头序列是Illumina平台的P7接头序列,反之亦然。
在一些实施方案中,所述第一接头序列是ion torrent平台的P1衔接头序列,所述第二接头序列是ion torrent平台的A衔接头,反之亦然。
在一些实施方案中,所述第一接头序列是MGI平台的单端标签建库上游夹板序列,所述第二接头序列是MGI平台的单端标签建库下游夹板序列,反之亦然。在一些实施方案中,所述第一接头序列是MGI平台的双端标签建库上游夹板序列,所述第二接头序列是MGI平台的双端标签建库下游夹板序列,反之亦然。
在一些实施方案中,所述引物还包括索引序列(index)。在一些实施方案中,所述索引序列为例如6-8个碱基,优选8个。
在一些实施方案中,所述第一引物是N5引物,所述第二引物是N7引物,反之亦然。
在一些实施方案中,所述步骤(2)中的孵育步骤包括室温孵育0.5-2h,优选室温孵育1-2h,更优选室温旋转孵育1-2h。
在一些实施方案中,所述步骤(3)中的片段化反应包括35-40℃孵育0.5-2h,优选35-38℃孵育1-2h,更优选37℃孵育1-2h。
在一些实施方案中,所述方法还包括终止转座酶片段化反应的步骤,例如使Tn5转座酶失活,例如加入EDTA、SDS或蛋白酶K,优选加入10% SDS。
在一些实施方案中,所述纯化步骤中采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法,优选磁珠法。
本申请的第六方面提供一种抗体孵育组合物,其包含缓冲成分、金属盐、亚精胺、螯合剂、稳定剂、细胞透化剂,以及至少一种非离子表面活性剂。
在一些实施方案中,所述细胞透化剂是例如Tween 20、洋地黄皂苷、皂素、聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇等。
在一些实施方案中,所述缓冲成分是例如HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、Tris、Tris-HCl、MOPS、PBS等。
在一些实施方案中,所述金属盐是例如一价金属盐,例如Na
在一些实施方案中,所述螯合剂是例如乙二胺四乙酸(EDTA)、氨基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二羟乙基甘氨酸(DEG)、柠檬酸(CA)、酒石酸(TA)和葡萄糖酸(GA)等。
在一些实施方案中,所述稳定剂是例如酶的稳定剂,例如BSA(牛血清蛋白)等。
在一些实施方案中,所述非离子表面活性剂是例如聚山梨醇酯-20(Tween20)、聚山梨醇酯-80(Tween80)、聚乙二醇4000(PEG4000)、聚乙二醇8000(PEG8000)、鲸蜡硬脂醇聚醚-10(AEO-10)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。
在一些实施方案中,所述缓冲液包含HEPES、NaCl、亚精胺、EDTA、BSA、洋地黄皂苷、蛋白酶抑制剂,以及至少一种非离子表面活性剂。
在一些实施方案中,所述缓冲液包含HEPES、NaCl、亚精胺、EDTA、BSA、洋地黄皂苷、蛋白酶抑制剂,以及选自TritonX-100和Tween20中的至少一种非离子表面活性剂。
在一些实施方案中,所述TritonX-100的浓度(体积分数)为0.01-5%,优选0.01-2%,例如0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%和2%。
在一些实施方案中,所述Tween20的浓度(体积分数)是0.1-5%,优选0.1%-3%,例如0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.2%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.2%、2.5%、2.7%、2.8%和3%。
在一些实施方案中,所述HEPES的浓度是10-100mM,优选10-50mM,例如10mM、12mM、15mM、18mM、20mM、22mM、25mM、28mM、30mM、35mM、40mM、45mM和50mM。
在一些实施方案中,所述NaCl的浓度是50-200mM,优选100-200mM,例如100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM,190mM和200mM。
在一些实施方案中,所述亚精胺的浓度是0.1-5mM,优选0.1-2mM,例如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM和2mM。
在一些实施方案中,所述BSA(质量分数)的浓度是0.01-1%,优选0.05-0.5%,例如0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%。
在一些实施方案中,所述EDTA的浓度是1-10mM,优选1-5mM,例如1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM和5mM。
在一些实施方案中,所述洋地黄皂苷(质量体积比,1%=1g/100ml)的浓度是0.01-2%,优选0.01-1%,例如0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%和1%。在一些实施方案中,所述洋地黄皂苷以其能够保持细胞通透性并足以使一抗、二抗及转座体可进入细胞的量存在于组合物中。
在一些实施方案中,所述蛋白酶抑制剂具有广谱的蛋白酶抑制活性,所述蛋白酶抑制剂包括但不限于本领域已知的商品化或非商品化蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor)。
在一些实施方案中,所述蛋白酶抑制剂的用量根据各自的产品说明书指导的量或本领域公知的量加入。
在一些实施方案中,所述抗体孵育组合物包含10-50mM HEPES、100-200mM NaCl、0.1-2mM亚精胺、1-5mM EDTA、0.05-0.5% BSA、0.01-1%洋地黄皂苷、有效量的蛋白酶抑制剂,TritonX-100和Tween20。在一些实施方案中,所述抗体孵育组合物包含20mM HEPES、150mM NaCl、0.5mM亚精胺、2mM EDTA、0.1% BSA、0.05%洋地黄皂苷、有效量的蛋白酶抑制剂,TritonX-100和Tween20。在一些实施方案中,所述抗体孵育组合物包含20mM HEPES、150mM NaCl、0.5mM亚精胺、2mM EDTA、0.1% BSA、0.05%洋地黄皂苷、有效量的蛋白酶抑制剂,0.01-5% TritonX-100和0.1-5% Tween20。在一些实施方案中,所述抗体孵育组合物包含20mM HEPES、150mM NaCl、0.5mM亚精胺、2mM EDTA、0.1% BSA、0.05%洋地黄皂苷、有效量的蛋白酶抑制剂,0.01-2% TritonX-100和0.1-3% Tween20。
“有效量的蛋白酶抑制剂”指能够有效保护反应体系中蛋白质不被水解的一定浓度范围的蛋白酶抑制剂。
在一些实施方案中,抗体孵育组合物的各组分浓度是上述各组分浓度的2-50倍,例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。
本申请的第七方面提供一种抗体孵育系统,其包含第六方面的抗体孵育组合物和靶蛋白结合抗体。
在一些实施方案中,所述靶蛋白结合抗体是例如靶蛋白结合一抗和/或二抗。在一些实施方案中,所述靶蛋白结合一抗和/或二抗的用量根据各自的产品说明书指导的量或本领域公知的量加入。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是转录因子或组蛋白。
在一些实施方案中,所述抗体孵育系统中还包含样本,所述样本为透化或未透化的细胞。在一些实施方案中,所述细胞为至少100个、500个、1000个、2000个、5000个、8000个或10000个。
在一些实施方案中,本申请的数值或数值范围包括至多±20%、至多±10%、至多±5%、至多±4%、至多±3%、至多±2%或至多±1%的误差,其中“至多”包含本数。
本申请的第八方面提供一种研究蛋白质-DNA互作的基因文库的构建方法,所述方法包含:
步骤(1)收集细胞样本,加入靶蛋白结合一抗和第六方面的抗体孵育组合物进行孵育,透化细胞,所述靶蛋白结合一抗与靶蛋白结合;
步骤(2)加入二抗进行孵育,所述二抗与靶蛋白结合一抗结合;
步骤(3)加入转座酶复合物与反应缓冲液,进行片段化反应从而获得片段化的DNA;其中所述转座酶复合物包含能够与二抗结合的基团或物质、转座酶和含有转座酶识别核心序列(ME序列)和标签序列的寡核苷酸;所述能够与二抗结合的物质例如是Protein A、Protein G或Protein AG;
步骤(4)任选地,纯化片段化的DNA;
步骤(5)对DNA片段连接测序接头;
步骤(6)任选地,对接头连接后的产物进行纯化和/或扩增。
在一些实施方案中,所述靶蛋白是转录因子或组蛋白。
在一些实施方案中,所述步骤(1)的孵育包括0-4℃孵育6-24h,优选0-4℃孵育8-12h,最优选4℃孵育8-12h。
在一些实施方案中,所述步骤(1)还包括将收集的细胞样本与活化的磁珠进行孵育。
在一些实施方案中,所述活化的磁珠是伴刀豆蛋白A磁珠。
在一些实施方案中,所述步骤(1)还包括在细胞样本与活化的磁珠孵育完成后分离收集磁珠,和/或,细胞与靶蛋白结合一抗孵育完成后分离收集磁珠。
在一些实施方案中,所述步骤(2)还包括在孵育完成后分离收集磁珠。
在一些实施方案中,所述反应缓冲液包括转座酶孵育缓冲液和转座酶反应缓冲液。
在一些实施方案中,所述步骤(3)包括加入转座酶复合物与转座酶孵育缓冲液,孵育,加入转座酶反应缓冲液,进行片段化反应。
在一些实施方案中,所述转座酶孵育缓冲液是例如本申请第一方面所述的组合物。
在一些实施方案中,所述转座酶反应缓冲液是例如本申请第三方面所述的转座酶反应组合物。
在一些实施方案中,所述转座酶是Tn5转座酶,所述Tn5转座酶是本领域已知的任何Tn5转座酶或其活性突变体。
在一些实施方案中,所述步骤(5)包括加入与标签序列匹配并带有接头序列的引物,通过PCR扩增得到带有测序接头的DNA片段。
在一些实施方案中,所述引物包括带有第一接头序列的第一引物和带有第二接头序列的第二引物。
在一些实施方案中,所述接头序列是当前或将来测序平台(包括但不限于iontorrent平台、illumina平台和华大平台)使用的测序基质相关序列。
在一些实施方案中,所述第一接头序列是Illumina平台的P5接头序列,所述第二接头序列是Illumina平台的P7接头序列,反之亦然。
在一些实施方案中,所述第一接头序列是ion torrent平台的P1衔接头序列,所述第二接头序列是ion torrent平台的A衔接头,反之亦然。
在一些实施方案中,所述第一接头序列是MGI平台的单端标签建库上游夹板序列,所述第二接头序列是MGI平台的单端标签建库下游夹板序列,反之亦然。在一些实施方案中,所述第一接头序列是MGI平台的双端标签建库上游夹板序列,所述第二接头序列是MGI平台的双端标签建库下游夹板序列,反之亦然。
在一些实施方案中,所述引物还包括索引序列(index)。在一些实施方案中,所述索引序列为例如6-8个碱基,优选8个。
在一些实施方案中,所述第一引物是N5引物,所述第二引物是N7引物,反之亦然。
在一些实施方案中,所述步骤(2)中的孵育步骤包括室温孵育0.5-2h,优选室温孵育1-2h,更优选室温旋转孵育1-2h。
在一些实施方案中,所述步骤(3)中的片段化反应包括35-40℃孵育0.5-2h,优选35-38℃孵育1-2h,更优选37℃孵育1-2h。
在一些实施方案中,所述方法还包括终止转座酶片段化反应的步骤,例如使Tn5转座酶失活,例如加入EDTA、SDS或蛋白酶K,优选加入10% SDS。
在一些实施方案中,所述纯化步骤中采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法,优选磁珠法。
本申请的第九方面提供一种研究蛋白质-DNA相互作用的方法,所述方法包括:对本发明第五方面或第八方面构建的文库进行上机测序。
本申请的第十方面提供一种试剂盒,所述试剂盒包含本申请第一方面所述的组合物、第三方面所述的转座酶反应组合物和第六方面所述的抗体孵育组合物中的至少一种、两种或三种。
在一些实施方案中,所述试剂盒用于实施本发明第五方面、第八方面和/或第九方面提供的方法。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包含其他辅助检测试剂,例如转座酶复合物、细胞透化试剂、纯化磁珠、测序接头、DNA聚合酶、扩增缓冲液、扩增引物和无核酸酶水。
本申请能够实现如下的有益效果:
1.通过修改转座酶孵育的盐浓度,提升了染色质可及性,导致文库小片段占比显著提升,表明回收了更多NDR区域的片段信号(附图4A-1、附图4A-2、附图4A-3、附图4A-4、附图4A-5、附图4B)。
2.通过修改转座酶孵育的盐浓度,提升了最终对转录因子靶点以及兴奋性组蛋白修饰靶点的检测效果(附图5A-5B、附图6A-6B)。
3.修改抗体孵育缓冲液,添加Tween20,TritonX-100等添加剂,TSS 富集信号值明显提升,frip score提高说明了阳性检出率明显提升(附图7A-7B)。
附图说明
图1显示ChIP技术原理图。
图2显示Cut&Tag技术原理图。
图3显示TF主要结合在NDR区示意图。
图4A-1至图4A-5分别显示不同盐离子浓度的转座酶结合缓冲液(Dig-buffer)对H3K4me3靶点建库峰图的影响;图4B显示不同盐离子浓度的Dig-buffer对H3K4me3靶点180-350bp小片段占比的影响。
图5A显示不同盐离子浓度的Dig-buffer对CTCF靶点的文库测序结果Heatmap图;图5B显示不同盐离子浓度的Dig-buffer对CTCF靶点的文库测序结果的FRip score。
图6A显示不同盐离子浓度的Dig-buffer对H3K4me3靶点的文库测序结果Heatmap图;图6B显示不同盐离子浓度的Dig-buffer对H3K4me3靶点的文库测序结果的FRip score。
图7A显示不同抗体孵育缓冲液(Antibody buffer)对H3K4me3靶点的文库测序结果Heatmap图;图7B显示不同抗体孵育缓冲液(Antibody buffer)对H3K4me3靶点的文库测序结果的FRip score。
实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案,但下述的实例仅仅是本申请的简易例子,并不代表或限制本申请的权利保护范围,本申请的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中,若无特殊说明,所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商;若无特殊说明,所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
Binding Buffer:取30 μL 10× Binding Buffer(Vazyme#TD903),加ddH
50×蛋白酶抑制剂:取一片蛋白酶抑制剂混合片剂(Sigma-Aldrich,5056489001)溶于1 mL ddH
Wash Buffer:取0.4 mL 10×Wash Buffer(-)(HEPES 200 mM,NaCl 1.5 M,spermidine 5mM),加入80μL 50×蛋白酶抑制剂,加ddH
Dig-wash Buffer:取2.97 mL前述部分配制的Wash Buffer,加入30 μL 5%Digitonin(洋地黄皂苷),混匀。
Antibody Buffer1(对照组Control):混合1 μL 0.5 M EDTA, 0.8 μL30% BSA和250 μL Dig-wash Buffer。
Antibody Buffer2,混合1 μL 0.5 M EDTA,0.8 μL 30% BSA和250 μL Dig-washBuffer,添加TritonX-100与Tween20至终浓度为0.05%与0.5%。
Antibody Buffer3,混合1 μL 0.5 M EDTA,0.8 μL 30% BSA和250 μL Dig-washBuffer,添加TritonX-100与Tween20至终浓度为0.5%与1%,置于冰上冷却,现配现用。
Antibody Buffer4,混合1 μL 0.5 M EDTA,0.8 μL 30% BSA和250 μL Dig-washBuffer,添加TritonX-100与Tween20至终浓度为0.1%与1.5%。
10× Dig-400 Buffer (-):200M HEPES,NaCl 4M,5mM spermidine(亚精胺),KCl4M。
10× Dig-300 Buffer (-):200M HEPES,NaCl 3M,5mM spermidine,KCl 3M。
10× Dig-250 Buffer (-):200M HEPES,NaCl 2.5M,5mM spermidine,KCl 2.5M。
10× Dig-150 Buffer (-):200M HEPES,NaCl 1.5M,5mM spermidine,KCl 1.5M。
10× Dig-50 Buffer (-):200M HEPES,NaCl 500mM,5mM spermidine,KCl500mM。
1× Dig-400 Buffer:取0.4 mL 10 × Dig-400 Buffer(-),加8 μL 5%Digitonin和80 μL 50×蛋白酶抑制剂,加ddH
1× Dig-300 Buffer:取0.4 mL 10 × Dig-300 Buffer(-),加8 μl 5%Digitonin和80 μL 50×蛋白酶抑制剂,加ddH
1× Dig-250 Buffer:取0.4 mL 10 × Dig-250 Buffer(-),加8 μL 5%Digitonin和80 μL 50×蛋白酶抑制剂,加ddH
1× Dig-150 Buffer:取0.4 mL 10 × Dig-150 Buffer(-),加8 μL 5%Digitonin和80 μL 50×蛋白酶抑制剂,加ddH
1× Dig-50 Buffer:取0.4 mL 10× Dig-50 Buffer(-),加8 μL 5% Digitonin和80 μL 50×蛋白酶抑制剂,加ddH
Tagmentation Buffer 400:取300 μL Dig-400 Buffer,加入3 μL 1 M MgCl
Tagmentation Buffer 300:取300 μL Dig-300 Buffer,加入3 μL 1 M MgCl
Tagmentation Buffer 250:取300 μL Dig-250 Buffer,加入3 μL 1 M MgCl
Tagmentation Buffer 150:取300 μL Dig-150 Buffer,加入3 μL 1 M MgCl
Tagmentation Buffer 50:取300 μL Dig-50 Buffer,加入3 μL 1 M MgCl
以10000个hela细胞(海星生物公司,货号TCH-C193)转录因子CTCF和兴奋性组蛋白修饰靶点H3K4me3为靶标进行Cut & Tag实验,将细胞染色质进行片段化,其中使用的CTCF靶标抗体来自abcam(ab126778),H3K4me3靶标抗体来自abcam(ab8580),具体步骤如下:
(一)、ConA Beads(Vazyme#TD903)处理
1.取一支8联管,每个样本加入100 μL Binding Buffer。
2.使用移液器充分重悬ConA Beads ,取出10 μL ConA Beads 至步骤1的BindingBuffer中,混合均匀,置于磁力架上,待溶液澄清后,弃尽上清。
3.将8联管从磁力架上取下,加入100 μL Binding Buffer,用移液器轻轻吹打混匀。
4.将8联管置于磁力架上,待液体澄清后,弃尽上清,加入10 μL Binding Buffer重悬ConA Beads。
(二)、细胞收集
室温收集细胞并计数。
2. 取实验所需数量的细胞于1.5 mL EP管中,室温下2,500 rpm(600×g)低速离心5 min,弃上清。
3. 室温条件下加入500 μL Wash Buffer重悬细胞,2,500 rpm(600×g)低速离心5 min,弃尽上清。
4. 每个样本加入100 μL Wash Buffer重悬细胞。
(三)、细胞与ConA Beads 孵育
1. 将100 μL细胞转移至含有活化ConA Beads的8联管中,上下颠倒混匀后,室温孵育10 min,期间颠倒混匀2 - 3次。
2. 瞬时离心(<100×g)收集反应液,将8联管置于磁力架上,待溶液澄清后,弃尽上清。
(四)、一抗孵育
1. 每个样本加入50 μL预冷的Antibody Buffer1重悬细胞-磁珠复合物。
2. 参照抗体说明书推荐的浓度(1:100)向8联管中加入抗体,上下颠倒混匀。
3. 瞬时离心收集液体于管底,将8联管置于4℃静置过夜。
(五)、二抗孵育
1.用Dig-wash Buffer按照1:100的体积比稀释二抗(abcam,ab6702)(常规推荐使用1:100比例稀释),每个样本50 μL。
2.取步骤(四)一抗孵育中的8联管,瞬时离心收集反应液,将8联管置于磁力架上,待溶液澄清后,弃尽上清。
3.加入步骤(五)二抗孵育步骤1中稀释好的二抗,上下颠倒数次,使抗体与细胞-磁珠复合物混合均匀,室温下旋转孵育30 - 60 min。
4. 瞬时离心收集反应液,将8联管置于磁力架上,待溶液澄清后,弃尽上清。
5. 向8联管中加入200 μL Dig-wash Buffer,上下颠倒数次,确保Buffer与细胞-磁珠复合物充分混合。
6. 重复步骤4 - 5两次(共3次)。
(六)、pA/G-Tnp(Vazyme#TD903)孵育
1.取2 μL pA/G-Tnp加入98 μL Dig Buffer混合(不同的实验组用不同的DigBuffer孵育,具体为Dig 400 Buffer-Dig 50 Buffer),终浓度为0.04 μM。
2.取步骤(五)二抗孵育中的8联管,瞬时离心收集反应液,将8联管置于磁力架上,待溶液澄清后,弃尽上清。
3.每个样本加入100 μL 步骤(六)pA/G-Tnp Pro孵育步骤1中稀释好的pA/G-TnpPro转座子,上下颠倒数次,使转座子与细胞磁珠复合物混合均匀。
4.室温下旋转孵育1 h。
5.瞬时离心,将8联管置于磁力架上,待液体澄清后,弃尽上清。
6.向8联管中加入200 μL Dig-Buffer(不同的实验组用不同的Dig Buffer孵育,具体为Dig 400 Buffer-Dig 50 Buffer),上下颠倒数次,确保Buffer与细胞-磁珠复合物充分混合均匀。
7.重复步骤5 - 6两次(共3次)。
(七)、片段化
1.取50μL Tagmentation Buffer(不同的实验组用不同的Tagmentation Buffer孵育,具体为Tagmentation Buffer 400-Tagmentation Buffer 50,与Dig 400 Buffer-Dig 50 Buffer对应),吹打混合均匀,置于冰上备用。
2.取步骤(六)pA/G-Tnp Pro孵育中的8联管,瞬时离心收集反应液,将8联管置于磁力架上,待液体澄清后,弃尽上清。
3.每个样本加入50μL步骤(七)片段化步骤1中准备好的Tagmentation Buffer(不同的实验组用不同的Tagmentation Buffer孵育,具体为Tagmentation Buffer 400-Tagmentation Buffer 50),混合均匀。
4.将8联管置于PCR仪中37℃孵育60 min。
5.瞬时离心,加入2μL 10% SDS,上下颠倒混匀,55℃孵育10 min,其间颠倒混匀2- 3次。
6.瞬时离心,将8联管置于磁力架上,静置约2 - 3 min,小心转移上清至新的8联管中,丢弃磁珠。
(八)、DNA提取(试剂来自Vazyme#TD903)
1. 向片段化后的样本中加入5 μl Proteinase K、100 μl Buffer L/B和20 μlDNA Extract Beads,充分涡旋混匀,55℃孵育10 min,其间颠倒混匀2 - 3次。
2.瞬时离心,将8联管置于磁力架上,静置约2 - 3 min,小心移除上清。
3.将上述样本取下磁力架,加入200 µl Buffer WA(使用前请确认已加入无水乙醇),充分涡旋混匀,瞬时离心收集反应液,将8联管置于磁力架上,静置2 min,弃尽上清。
4.将上述样本取下磁力架,加入200 µl Buffer WB(使用前请确认已加入无水乙醇),充分涡旋混匀,瞬时离心收集反应液,将8联管置于磁力架上,静置2 min,弃尽上清。
5.重复步骤4一次。
6.开盖室温晾置5 - 10 min,直至管内无液体残留,磁珠表面无反光。
7.将上述样本取下磁力架,加入22 μl灭菌超纯水,用移液枪吹打混匀,室温洗脱5min,其间轻轻振荡2 - 3次。
8.将8联管置于磁力架上,待溶液澄清后(约1 min),吸取20 μl上清至新的8联管中,样本可置于-30 ~ -15℃长期保存,避免反复冻融。
(九)、文库扩增
文库扩增及纯化:取15μL上阶段的DNA产物,以包含N5/N7的引物进行文库扩增,并采用VAHTS DNA Clean Beads(Vazyme #N411)对扩增产物进行纯化(详见Vazyme TD903步骤08-10)。
(十)、对纯化产物进行Agilent 2100 Bioanalyzer峰型检测,并对文库进行测序,结果如图4A-1至图4A-5、图4B、图5A-5B、图6A-6B所示。
结果分析:
如图4A-1至图4A-5、图4B所示:以H3K4me3为靶点,修改Dig Buffer中的NaCl和KCl浓度能有效改变文库片段大小分布,具体表现为:随着NaCl和KCl浓度的降低,文库的小片段占比提高(4%-27%),表明修改盐浓度能够调节染色质可及性,从而获得更多的NDR(nucleosome depleted region)区域信息。
如图5A-5B所示:对CTCF组各自的文库进行高通量测序,并进行TSS heatmap富集信号分析展示,TSS heatmap表明对转录因子CTCF的检测结果随着NaCl和KCl浓度的降低而升高,TSS heatmap signal由8升至20,表明富集了更多的阳性信号。FRiP Score指的是特异富集的Reads占整个文库Reads的占比,其值越高,表明富集程度越好,信号更加真实,随着NaCl和KCl浓度的降低,FRiP Score由0.07升至0.27。
如图6A-6B所示:对H3K4me3各自的文库进行高通量测序,并进行TSS heatmap富集信号分析展示,TSS heatmap表明对兴奋性组蛋白修饰靶点H3K4me3的检测结果随着NaCl和KCl浓度的降低而升高,TSS heatmap signal由30升至50,表明富集了更多的阳性信号。FRiP Score指的是特异富集的Reads占整个文库Reads的占比,其值越高,表明富集程度越好,信号更加真实,随着NaCl和KCl浓度的降低,FRiP Score由0.21升至0.37。
在实施例2中,以10000个Hela细胞(海星生物公司,货号TCH-C193)转录因子CTCF和兴奋性组蛋白修饰靶点H3K4me3和为靶标进行Cut&Tag实验。
Dig Buffer选用Dig-300 Buffer,Tagmentation Buffer 选用TagmentationBuffer 300进行实验,除antibody buffer不同,其它操作与实施例1保持一致,不同的实验组用不同的Antibody Buffer1-4孵育,实验结果如图7A-7B所示。
结果分析:
如图7A-7B所示:对H3K4me3各实验组的文库进行高通量测序,并进行TSS heatmap富集信号分析展示,TSS heatmap表明对兴奋性组蛋白修饰靶点H3K4me3的检测结果随着Tween 20和Triton X-100的浓度升高而升高,TSS heatmap singnal由40升至80,表明富集了更多的阳性信号。FRiP Score指的是特异富集的Reads占整个文库Reads的占比,其值越高,表明富集程度越好,信号更加真实,随着Tween 20和Triton X-100的添加以及浓度升高,FRiP Score由0.27升至0.45。
机译: 一种产生重组病毒的方法,所述重组病毒包含编码全部或部分异源蛋白质,DNA构建体的核苷酸序列,所得重组病毒和包含此类重组病毒的疫苗组合物,以针对黄病毒和/或其他病原体进行免疫。
机译: 组合物,核苷酸片段,重组DNA构建体,蛋白质的生产方法,药物组合物及其使用方法,制剂,药物组合物的施用方法,预防和控制与葡萄球菌相关的感染的方法
机译: 一种选择与感兴趣的诱饵多肽相互作用的猎物多肽的快捷方法:在构建互作蛋白多肽的应用中的应用