细粒棘球绦虫抗原Fis1的CD4+T表位肽的应用

摘要

本发明公开了一种细粒棘球绦虫抗原Fis1的CD4+T表位肽在制备治疗哮喘药物中的应用，该CD4+T表位肽的序列如Seq ID No：1所示，该CD4+T表位肽能有效升高Th1、Treg和M2型巨噬细胞的数量，降低M1型巨噬细胞和Th2型细胞因子数量，降低哮喘中的炎症因子，能对哮喘起到很好的预防、干预和/或缓解效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一种细粒棘球绦虫抗原Fis1的CD4+T表位肽的应用。

背景技术

哮喘是一种异质性的慢性气道炎症性疾病，在我国，哮喘的患病率高达4.2％，且很多患者治疗不充分或者未接受治疗，这给许多家庭甚至社会带来了沉重负担。哮喘通常是偶发性的，其环境触发因素，不同患者中各不相同，包括病毒、过敏原、烟雾、运动和温度变化等。此外，哮喘的发病机制复杂，患者的临床表现、治疗方式及预后等各有不同。

现如今对于哮喘的治疗主要是采用扩张支气管、抗炎和抗过敏的药物，如糖皮质激素、长效β2受体激动剂、抗IgE的单克隆抗体以及一些急救药物等。这些治疗可以通过有效管理，实现对过敏性哮喘的暂时控制，但药物的副作用以及耐药性等问题尚不能很好的解决。因此，开发新的哮喘治疗靶点迫在眉睫。

已经有研究表明，蠕虫的感染对过敏性疾病具有保护作用，并且蠕虫的衍生成分也可达到相同效果。然而，感染性蛋白或全蛋白可能会对患者产生副作用，因此从蠕虫中寻找小分子物质，如肽，作为免疫调节物质是预防和治疗哮喘的新方向。

发明内容

为克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种细粒棘球绦虫抗原Fis1的CD4+T表位肽在制备治疗哮喘药物中的应用。

本发明是这样实现的，一种细粒棘球绦虫抗原Fis1的CD4+T表位肽在制备治疗哮喘药物中的应用，该CD4+T表位肽的序列如Seq ID No：1所示。

优选地，所述治疗包括预防、干预和/或缓解。

优选地，所述药物还含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体；所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。

本发明克服现有技术的不足，提供一种细粒棘球绦虫抗原Fis1的CD4+T表位肽的应用。本发明来自细粒棘球绦虫抗原Fis1(EgFis1，NCBI的基因登录号为CDS20063.1)，EgFis1的抗原表位预测本实验室已完成(参考文献：肖静，曲晨，赵嘉庆.细粒棘球绦虫抗原Fis1的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志，2022，17(02):191-194.)，在预测的基础上合成了CD4+T表位肽，序列为Seq ID No：1：LIALANTKMGAIECCDNLLA。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明细粒棘球绦虫抗原Fis1的CD4+T表位肽用于制备治疗哮喘药物，该药物能有效升高Th1和Treg细胞数量，降低Th2型细胞因子和哮喘中的相关炎症因子，能对哮喘起到很好的预防、干预和/或缓解效果，并且，该药物还具有副作用小、耐药性低的特点。

附图说明

图1是本发明实施例的实验操作流程图；

图2是发明实施例OVA诱导的哮喘小鼠模型造模方法；

图3是肺部的病理切片染色图；其中，A为HE(苏木素-伊红)染色用于检测后的气道和肺泡周围炎细胞浸润情况，B为MASSON(马松)染色用于检测胶原沉积的情况，C为PAS(过碘酸-雪夫)染色用于检测的支气管杯状细胞化生程度；

图4是肺组织嗜酸性粒细胞数量；

图5是脾组织Th1细胞数量；

图6是脾组织Treg细胞数量；

图7是脾组织M1型巨噬细胞的数量；

图8是M2型巨噬细胞的数量；

图9是Th2型细胞因子IL-4/IL-6的数量；

图10是血清中OVA特异性IgE的数量；

图3～10中，B为空白对照组，C为哮喘模型组，T为哮喘模型加肽干预组。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、技术路线

如图1所示，取6～8周的雌性BALB/C雌鼠分为3组，每组4只。OVA诱导的哮喘小鼠模型造模后的第28天剖杀小鼠后，提取脾、右肺、骨的单个核细胞做流式分析，保留左肺做病理切片，保留血清做ELISA检测IgE以及CBA测Th1/2/17。

1、单个核细胞做流式分析

肺嗜酸性粒细胞(EOS)：CD11c

对肺组织单细胞悬液进行流式表面染色，向单细胞悬液中加入流式表面染色抗体，冰上避光孵育30min，染色缓冲液洗涤两次后，上机检测。

脾Treg:CD4

脾巨噬细胞(M1型巨噬细胞：CD11b

(1)表面染色：CD11b

(2)4℃避光染色30min；

(3)加入staining buffer 3mL，4℃，450g离心5min；

(4)弃去上清将细胞涡旋起来；

(5)加入600uL 4％的多聚甲醛重悬室温放置10min；

(6)加入破膜液2mL，4℃，450g离心5min；

(7)弃去上清将细胞涡旋起来；

(8)加入破膜液3mL，4℃，450g离心5min；

(9)弃去上清将细胞涡旋起来；

(10)胞内染色：CD206；

(11)加入staining buffer 3mL，4℃，450g离心5min；

(12)弃去上清将细胞涡旋起来，上机即可。

脾Th1:CD3

(1)调整细胞浓度至1×10

(2)每个流式管加入200uL细胞，加入3mL完全培养基4℃，450g离心8min；

(3)弃去上清将细胞涡旋起来；

(4)表面染色：CD3，CD4；

(5)4℃避光染色30min；

(6)加入staining buffer 3mL，4℃，450g离心5min；

(7)弃去上清将细胞涡旋起来；

(8)加入600uL 4％的PFA重悬室温放置10min；

(9)加入破膜液2mL，4℃，450g离心5min；

(10)弃去上清将细胞涡旋起来；

(11)加入破膜液3mL，4℃，450g离心5min；

(12)弃去上清将细胞涡旋起来；

(13)胞内染色：IFN-r；

(14)加入staining buffer 3mL，4℃，450g离心5min；

(15)弃去上清将细胞涡旋起来，上机即可。

2、病理切片的具体操作

左肺组织经4％多聚甲醛固定，修取下叶，常规石蜡包埋，5μm厚切片，经梯度乙醇脱水后，进行HE染色、MASSON染色和PAS染色，分别观察小鼠肺组织炎症细胞浸润、纤维化和糖原沉积程度。

3、用ELISA测血清中的OVA特异性的IgE

(1)取材

杀鼠时，用离心管收集血清。血样凝集30分钟后，2000×g离心10分钟。吸取血清样本。

(2)试剂准备

1)用前，所有的组分都要至少复温30min，确保充分复温到室温；

2)浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。

(3)检测步骤

1)试剂、样本平衡：检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温，标准品、质控品和样品，做2个复孔；

配置工作液：按前面试剂准备中描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液；

2)加标准品、样本：设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔加待测样本50μL，空白孔不加；

3)加HRP标记抗体：除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL；

4)孵育：使用封板膜封板，37℃水浴锅或恒温箱温育60分钟；

5)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，静置20s，洗涤5次；

6)加底物显色：每孔加入50μL显色底物A、B各50μL，37℃水浴锅或恒温箱温育15分钟；

7)加终止液：每孔加入50μL终止液，颜色由蓝色变为黄色；

8)检测读数：在15分钟之内，使用450nm酶标仪进行检测读数。

4、CBA测Th1/2/17

(1)制备细胞因子标准品：

1)将一瓶冻干的细胞因子标准品小球转移至15mL锥形离心管中，标记为最高浓度标准品(5000pg/mL)；

2)用2mL Assay Diluent(稀释液)稀释标准品，室温平衡至少15分钟；

3)用枪头轻柔混匀标准品，不要涡旋或剧烈振荡混匀；

4)取9支流式管(1.5mL离心管)，分别标记梯度稀释倍数1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256；

5)每管加入300μL Assay Diluent(稀释液)；

6)执行下列稀释过程：

将300ul顶级标准品转移到1:2稀释试管中，仅用移液管彻底混合；

继续将300uL从1:2试管转移到1:4试管，然后再依次转移到1:256试管，进行系列稀释，仅用移液管彻底混合，不要涡旋。

7)最后取1支流式管(1.5mL离心管)中加入300μLAssay Diluent作为阴性质控(0pg/mL)。

(2)混合细胞因子捕获微球：

1)混合微球

A、确定实验样本数(含所有标准品、阴性对照及检测样本)，12个待测样本，9个标准品，1个阴性对照，共计22管；

B、混合前每种捕获微球需充分涡旋3～5秒(此步骤是整个实验的关键，为保证微球数量充足，建议每吸取一种微球之前充分混匀此微球溶液)；

C、按照10μL/样本吸取适量的捕获微球，如样本数为19，则每种细胞因子捕获微球的量为190μL；将所有微球混合于一支流式管(5mL离心管)中，标记为“混合微球”；

D、充分涡旋混匀。

2)样本孵育

A、充分涡旋重悬好的“混合微球”，每个实验管加入50μL；

B、标准品与待测样本：

C、标准品管中每管加入50μL梯度稀释好的标准品，标准品浓度如下表1所示(10个1.5mL离心管)：

表1

D、样本管中每管加入50μL待测样本；

3)所有实验管中加入50μL PE标记的细胞因子检测抗体；

4)室温避光孵育2小时；

5)每管加入1mL洗液清洗样本，200g离心5分钟；

6)小心吸去或轻柔倒掉上清液，每管加入300μL洗液重悬细胞，上机即可。

二、造模方案

如图2所示，OVA诱导的哮喘小鼠模型造模方法为：

1、在第0、7、14天向小鼠腹腔注射用氢氧化铝乳化的OVA20μg，总体积为200μL。

2、21～27天用含100μg OVA总体积为10μL的PBS溶液进行滴鼻来激发。

肽干预组的处理为，在第-1、6、13天腹部皮下注射本肽20μg(肽由生工生物合成，按照说明书，使用超纯水溶解，超纯水稀释为0.2μg/μL，每次皮下注射100μL)。

三、实验结果

1、肺组织病理切片

如图3所示，其中，A为HE(苏木素-伊红)染色用于检测后的气道和肺泡周围炎细胞浸润情况，B为MASSON(马松)染色用于检测胶原沉积的情况，C为PAS(过碘酸-雪夫)染色用于检测的支气管杯状细胞化生程度。通过与空白组对比，哮喘模型组小鼠肺部炎性细胞的浸润加重，但在干预组中，上述病理变化均得到缓解。

2、流式细胞术-EOS

如图4所示，哮喘模型组小鼠肺部的嗜酸性粒细胞升高，而干预组中有所缓解。

3、脾组织中Th1细胞的数量

如图5所示，哮喘会导致Th1细胞的比例降低，而干预组Th1细胞的比例升高。

4、脾组织中Treg细胞的数量

如图6所示，哮喘发生会导致Treg细胞比例降低，而干预组Treg细胞的比例升高。

5、脾组织中巨噬细胞的数量

如图7所示，哮喘会导致M1型巨噬细胞的比例升高，而干预组中M1型巨噬细胞的比例下降。

如图8所示，哮喘会导致M2型巨噬细胞的比例下降，而干预组中M2型巨噬细胞的比例上升。

6、血清中Th1/Th2/Th17细胞因子的数量

如图9所示，肽的干预可以降低哮喘中升高的Th2型细胞因子(IL-4、IL-6)

7、血清中OVA特异性IgE的含量

如图10所示，本哮喘模型由OVA诱导，因此血清中OVA特异性IgE的含量会升高，而肽的干预可以缓解此种变化。

以上结果表明，细粒棘球绦虫抗原Fis1的CD4+T表位肽可以缓解由OVA诱导的哮喘。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。