细粒棘球绦虫重组抗原Eg10应用价值的评价

摘要

目的：以细粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型对细粒棘球绦虫重组抗原Eg10应用价值进行评价，并与天然抗原（HCF、原头蚴）进行比对。 方法：⑴动物模型的建立：Balb/c小鼠35只，20只腹腔接种2000psc/只，10只心腔接种400psc/只，余者注射高压灭菌1×PBS作为对照，建立细粒棘球蚴感染小鼠动物模型。⑵重组蛋白Eg10的制备：以人源细粒棘球蚴原头蚴总RNA为模板，据Genbank检索的Eg10基因片段序列设计一对引物，通过RT-PCR扩增目的基因片段；将目的基因克隆到pGEM-T载体，转化大肠杆菌JM109，对重组基因进行测序；结果正确无误后，再将目的基因亚克隆至pET28a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，构建细粒棘球蚴Eg10基因原核表达体系，经IPTG诱导表达后，反复冻融以确定表达产物的溶解性并利用Novagen His·Bind 纯化试剂盒纯化此蛋白并以此纯化蛋白免疫ICR小鼠，通过ELISA检测其免疫原性。⑶动物模型对Eg10和天然抗原的评价：以Eg10和HCF作为抗原，通过ELISA检测细粒棘球蚴感染小鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a及IgG3抗体水平的动态变化；通过WB检测此血清能否识别Eg10及天然抗原中相应的条带。 结果：⑴接种6个月后处死所有小鼠，剖腹、剖胸检查包囊生长情况，30只实验鼠中有包囊长出者为19只(含中期死亡2只)，腹腔接种较心腔接种感染率高（85％：20％），雌鼠较雄鼠感染率高 (72％：50％)，但经确切概率法检验无论是腹腔接种与心腔接种还是雌鼠与雄鼠之间均没有显著性差异。所长包囊经病理组织切片检查证实为包虫囊泡。⑵ Eg10/pET28a/BL21(DE3)plysS能够诱导表达出一与Eg10基因理论推测蛋白分子量一致的31kDa 条带，表达量约占菌体总蛋白的52％，反复冻融后确定此蛋白以不溶性的包涵体形式表达；小鼠免疫2w后，IgG抗体值开始增高，第6w达最高值，8w后开始下降。⑶细粒棘球蚴感染小鼠血清ELISA及WB结果提示：以HCF作为包被抗原，特异性IgG抗体及其亚类都有不同程度的增高，在IgG亚类中以IgG1增高为主；以Eg10作为包被抗原，特异性IgG抗体自感染棘球蚴后持续增高，而其亚类IgG1、IgG2a、IgG3未见明显增加，间接反应IgG2b为主要增高的IgG亚类；此血清能识别重组蛋白Eg10及原头蚴中相应条带。 结论：成功的制备了细粒棘球蚴继发性感染Balb/c小鼠模型，经腹腔接种原头蚴动物死亡率低、包囊形成快；成功的克隆了Eg10基因并构建了高效表达的Eg10/pET28a/BL21(DE3)plysS原核体系，表达产物为不溶性的包涵体；以HCF作为包被抗原，细粒棘球蚴感染小鼠血清IgG抗体及其亚类都有不同程度的增高，在IgG亚类中以IgG1增高为主；以Eg10作为包被抗原，该血清特异性IgG抗体自感染棘球蚴后持续增高，在IgG亚类中以IgG2b增高为主；该血清能识别重组蛋白Eg10及原头蚴中相应条带。