羊肚菌发酵淫羊藿提取物在增强巨噬细胞活性以及抗肿瘤活性中的应用

摘要

本发明涉及一种羊肚菌发酵淫羊藿提取物在增强巨噬细胞活性以及抗肿瘤活性中的应用。所述的羊肚菌发酵淫羊藿提取物的制备方法为：通过PDA固体培养基活化羊肚菌株，接种于淫羊藿培养基中，经70%乙醇浸泡、旋转蒸发仪浓缩、冷冻干燥制备得到羊肚菌发酵淫羊藿提取物（固体发酵）。以同样方法制备未发酵淫羊藿提取物作为对照，对体外培养的RAW264.7巨噬细胞、BEAS‑2B细胞等细胞进行广谱的MTT实验，发现本发明的羊肚菌发酵淫羊藿提取物能在体外显著增强RAW264.7巨噬细胞活性并抑制多种癌细胞增殖，为羊肚菌发酵淫羊藿提取物在抗癌应用研究上提供了科学依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及羊肚菌发酵淫羊藿提取物在增强巨噬细胞活性以及抗肿瘤活性中的作用。

背景技术

羊肚菌（学名：

巨噬细胞(Macrophages)是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，通过吞噬自体受损细胞或外源病原体在机体发育、免疫、炎症反应和多种疾病发生中发挥重要作用，提高巨噬细胞的吞噬活性有助于机体免疫水平的提高和多种疾病的治疗。生物机体内的巨噬细胞可以随着微环境的变化而改变它们的表型和免疫功能，不断根据自身受到的刺激来改变自己的生理状态和免疫活性，从而更好的保证生物体机体和组织的健康。不同的刺激物质包括机体自身蛋白分子、小分子物质、真菌和细菌的提取物等能够刺激并激活巨噬细胞，从而增强巨噬细胞免疫反应和吞噬能力。然而目前的刺激物质比较局限，对于巨噬细胞吞噬能力的增强效果优先，有必要寻找其他的能够提高巨噬细胞吞噬活性的物质。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种羊肚菌发酵淫羊藿提取物在增强巨噬细胞活性以及抗肿瘤活性中的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种羊肚菌发酵淫羊藿提取物在增强巨噬细胞活性以及抗肿瘤活性中的应用。

本发明所使用的羊肚菌发酵淫羊藿提取物浓度为125μg/ml，能够促进巨噬细胞增殖作用；所述羊肚菌发酵淫羊藿提取物浓度为50-500μg/ml时，能够抑制肿瘤细胞增殖。

进一步的，所述肿瘤细胞为RAW264.7、MSC、MCF-7、Hela、A549。

本发明所使用的羊肚菌发酵淫羊藿提取物通过以下方法制备：

（1）取羊肚菌株，挑取菌丝接种在PDA培养基中，倒放后恒温培养，得到活化后的羊肚菌；

（2）将淫羊藿粉碎，用60目的筛网筛选后，得到淫羊藿粉；

（3）将淫羊藿粉加入PDA培养基中，边加入边搅拌，搅拌均匀，直至淫羊藿干粉既不松散也不成团，且紧握成团状而松开时分散的状态，得淫羊藿培养基；

（4）将淫羊藿培养基密封状态下高压蒸汽灭菌；

（5）发酵淫羊藿：夹取羊肚菌接入淫羊藿培养基的底部，搅拌均匀，封口后密封发酵培养，然后烘干至恒重，得到烘干的发酵物；

（6）取烘干的发酵物用70%乙醇（V/V）浸泡，然后进行离心，得上清液，对得到的上清液进行旋蒸，旋蒸后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，再行研磨，得到粉末状羊肚菌发酵淫羊藿提取物。

进一步的，步骤（1）中，所述菌丝在PDA固体培养基的接种量为5-8%；所述培养为在20℃的恒温培养箱中培养2-3d。

进一步的，步骤（3）中，所述淫羊藿粉和PDA液体培养基的质量比为1：5-10；所述发酵培养为在20℃培养箱中培养30d。

进一步的，步骤（5）中，所述羊肚菌的接入量为10%。

进一步的，步骤（f）中，所述发酵物和70%乙醇的体积比为1:10；所述浸泡为室温下浸泡48h。

本发明所使用的羊肚菌株为普通市售即可，如货号TS308771，其表观特征为：初期，羊肚菌菌丝为白色或淡黄色，有光泽，菌丝尖端呈多指状或树枝状分枝；中期，在培养基上形成菌落，菌落中心较老的菌丝分泌色素，使菌丝呈棕黄色，菌丝老化时，菌落由深棕色转为污棕色，光泽消失。

微生物发酵中药是一个热门课题，利用羊肚菌来发酵淫羊藿是本发明创新所在。在羊肚菌生长过程中的一系列丰富的酶系可将高糖基的淫羊藿苷水解为低糖基的淫羊藿苷，减少糖基的数目会使淫羊藿苷的活性有很大提高。羊肚菌降解糖基转化为自身能利用的碳源可以对淫羊藿苷类进行转化。因此通过羊肚菌发酵淫羊藿使淫羊藿中的活性物质淫羊藿苷类黄酮化合物增加，从而增强了羊肚菌和淫羊藿本身的功能活性，以此作为药物进行多种细胞水平上的实验验证，可为新型增强免疫和抗肿瘤药物的研发提供有价值的参考。

本发明的有益效果为：本发明首次利用羊肚菌发酵淫羊藿，并联合处理提取发酵后产物中的有效物质，得到了羊肚菌发酵淫羊藿提取物，经过MTT实验对RAW264.7细胞、MSC细胞（间充质干细胞）、A549细胞、BEAS-2B细胞经不同浓度药物干预后的增殖率进行检测，得知本发明所述的羊肚菌发酵淫羊藿提取物具有促进细胞增殖和抗肿瘤活性的功能。

附图说明

图1为两种提取物对RAW264.7巨噬细胞增殖活性的影响；

图2为两种提取物对MSC细胞增殖活性的影响；

图3为两种提取物对MCF-7细胞增殖活性的影响；

图4为两种提取物对Hela细胞增殖活性的影响；

图5为两种提取物对A549细胞增殖活性的影响；

图6为两种提取物对BEAS-2B细胞增殖活性的影响。

具体实施方法

为了使本发明的目的、技术手段及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。但是本发明的内容不仅限于实施例所述的范围。

实施例1

1、羊肚菌的活化：

（1）配制PDA琼脂固体培养基：每L培养基中马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g。

（2）将配制好的PDA固体培养基灭菌（115℃，20min）后冷却至40℃左右，移至超净工作台中进行倒平板，待平板中固体培养基成型后，取羊肚菌株，用竹签挑取菌丝接种（5%）在平板中央静置倒放在20℃的恒温培养箱中培养2-3d，得到活化后的羊肚菌。

2、淫羊藿的发酵

（1）粉碎淫羊藿：将淫羊藿粉碎，用60目的筛网筛选后，得到淫羊藿粉。

（2）将若干淫羊藿粉加入事先配制好的PDA液体培养基（1:10），边加入边搅拌，搅拌均匀，可加入适量蒸馏水，直至淫羊藿干粉既不松散也不成团，且紧握成团状而松开时分散的状态；

（3）把制好的淫羊藿装入盒子中，加塑料封口膜，加盖密封，并放入灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌，115℃、30min。

（4）发酵淫羊藿：夹取适当大小的羊肚菌接入淫羊藿培养基中（接种量10%），尽可能接入淫羊藿的底部，搅拌均匀，盖上塑料封口膜，加盖密封；20℃培养箱中培养30d，然后烘干至恒重，得到烘干的发酵物。

3、提取：

取烘干的发酵物用10倍体积的70%乙醇（V/V）室温浸泡48h后进行离心，得上清液，对得到的上清液进行旋蒸，旋蒸后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，再行研磨，得到粉末状易保藏的羊肚菌发酵淫羊藿提取物。

4、药物配制

（1）取0.05g制得的粉末状羊肚菌发酵淫羊藿提取物药物5ml 20%乙醇中，超声震荡10 min，充分溶解，过0.22μm滤膜，制成10mg/ml的储备母液，置4℃冰箱备用；

（2）取0.05g粉末状未发酵淫羊藿提取物（取烘干的淫羊藿粉用10倍体积的70%乙醇（V/V）室温浸泡48h后进行离心，得上清液，对得到的上清液进行旋蒸，旋蒸后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，再行研磨，得到粉末状易保藏的未发酵淫羊藿提取物）药物5ml 20%乙醇中，超声震荡10 min，充分溶解，过0.22μm滤膜，制成10mg/ml的储备母液，置4℃冰箱备用；

5、细胞培养：RAW264.7、MSC、MCF-7、Hela、A549、BEAS-2B细胞

（1）细胞复苏

取出冻存的细胞，转移至37℃的恒温水浴锅中，晃动使其融化。于1000 rpm条件下离心10 min，弃上清，重悬于完全培养基中（其中，MSC使用DMEM/F12培养基，其他细胞使用DMEM高糖培养基），倒置显微镜下观察细胞密度。转移至培养箱内37℃、5% CO

（2）细胞培养与传代

每2-3天更换培养液，当细胞密度达70-90%时传代。弃去旧培养基，PBS清洗两次，加入适量胰蛋白酶消化1-2min，用含血清的完全培养基终止消化，吹打混匀后，1000 rpm离心10min，重悬于新鲜培养基，1：2分装，于培养箱内37℃、5% CO

（3）细胞冻存

将对数生长期的细胞，按照传代过程对其处理后收集细胞，加入适当体积的冻存液（10%完全培养基加90%DMSO），吹打混匀后转移至冻存管中，每管1 ml。降温保存：4℃冰箱放置30min，-20℃冰箱放置2h，-80℃冰箱过夜，最后移至液氮罐中保存。

（4）、细胞计数

取10μl细胞悬液滴加于细胞计数板上，放入细胞计数仪内，读取并记录屏幕显示数据。

6、细胞存活率测定

（1）复苏、培养上述细胞。

（2）将2.0～3.0×10

（3）用20%乙醇稀释制备的粗提物，制成含不同浓度粗提物的样品溶液。

（4）培养过夜，将浓度分别为0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml和500μg/ml的羊肚菌发酵淫羊藿提取物、未发酵淫羊藿提取物、羊肚菌发酵提取物样品溶液加入各个孔中，每孔5μl，每个浓度6个复孔，同时设置正常对照，同样设6个复孔，培养16-48h。

（5）向各孔中加入20μl MTT孵育4h，弃去上清液，加入100μl DMSO，放置振荡器上振荡10min。

（6）振荡结束，置于酶标仪上，490nm处检测其OD值，按下列公式计算细胞存活率。

细胞存活率(％)＝[(样品孔OD值-调零孔OD值)/(对照孔OD值-调零孔OD值)]×100％。

应用实施例1羊肚菌发酵淫羊藿提取物对巨噬细胞的影响

如图1所示，在50-200μg/ml范围内，羊肚菌发酵淫羊藿提取物和未发酵淫羊藿提取物对RAW264.7细胞均具有促进增殖的作用，且呈剂量依赖型增强巨噬细胞活性，前者较后者促进作用更加明显。在浓度达到125μg/ml时，效果最佳，相对于未发酵淫羊藿提取物处理后，存活率提高了25%。

应用实施例2羊肚菌发酵淫羊藿提取物对MSC细胞的影响

如图2所示，在50-500μg/ml范围内，羊肚菌发酵淫羊藿提取物在一定程度上抑制MSC细胞增殖，并且在400μg/ml时抑制率大于80%，未发酵淫羊藿提取物在浓度为50-200μg/ml时，对细胞活性无影响，在浓度为400μg/ml时抑制率大于80%。

应用实施例3羊肚菌发酵淫羊藿提取物对MCF-7细胞的影响

如图3所示，在浓度为50-500μg/ml范围内，羊肚菌发酵淫羊藿提取物和未发酵淫羊藿提取物对MCF-7细胞均具有抑制作用，当浓度达到400μg/ml 时，前者抑制率大于95%。而未发酵淫羊藿提取物浓度大于300μg/ml 时才起到抑制作用，当浓度达到500μg/ml时，抑制率为40%左右。

应用实施例4羊肚菌发酵淫羊藿提取物对Hela细胞的影响

在浓度为50-500μg/ml范围内，羊肚菌发酵淫羊藿提取物和未发酵淫羊藿提取物对Hela细胞均具有抑制作用，并呈剂量依赖型抑制生长，且发酵后提取物较未发酵提取物抑制效果好，当浓度达到400μg/ml 时，抑制率大于95%。相对于未发酵淫羊藿提取物处理后，当浓度为300μg/ml时，抑制率提高28%。

应用实施例5羊肚菌发酵淫羊藿提取物对A549细胞的影响

在50-500μg/ml范围内，羊肚菌发酵淫羊藿提取物和未发酵淫羊藿提取物对A549均具有抑制增殖的作用，且当浓度大于300μg/ml时。羊肚菌发酵淫羊藿提取物相对于未发酵淫羊藿提取物效果更为显著，抑制率提高50%。

应用实施例6羊肚菌发酵淫羊藿提取物对BEAS-2B细胞的影响

在50-150μg/ml范围内，羊肚菌发酵淫羊藿提取物对BEAS-2B细胞具有促进增值的作用，而当药物浓度大于150μg/ml时，开始出现抑制作用，当浓度达到500μg/ml时，抑制率大于80%。

综上所述，本发明通过羊肚菌发酵淫羊藿得到的提取物要比未发酵淫羊藿提取物和羊肚菌发酵提取物两组对照在促进巨噬细胞增殖方面效果更显著，相同浓度下，以BEAS-2B（人正常肺上皮细胞）细胞、MSC（间充质干细胞）作为对照，我们发现，浓度大于300μg/ml时，对正常细胞有毒性较大，因此，我们在配制药物浓度时，要在300μg/ml浓度以下设置梯度，既能保持对巨噬细胞具有促进作用，对癌细胞具有抑制作用，又能控制对正常细胞的毒性，这也为后续开发新型药物时剂量问题提供了有价值的参考。同时，本发明所述的羊肚菌发酵淫羊藿提取物可对生物医药领域开发出一种既能增强免疫功能又能抗癌的新型药物提供依据。

上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。