CIR1作为分子标志物在肺癌骨转移诊断、治疗和预后评估中的应用

摘要

本发明公开了CIR1作为分子标志物在肺癌骨转移诊断、治疗和预后评估中的应用，属于医学肿瘤诊断与治疗领域。本发明发现CIR1在肺癌骨转移的组织和细胞中高表达，并伴有不良预后。体内体外实验证实了CIR1下调能够显著抑制肺癌细胞的增殖和迁移能力，从而抑制骨转移；同时，CIR1下调能显著抑制肺癌细胞对破骨细胞的促分化成熟作用，大大降低溶骨性破坏的发生。因此，本发明提出将检测CIR1表达水平的试剂应用于制备检测肺癌是否发生骨转移的试剂盒和/或预测肺癌骨转移倾向的预后试剂盒中；将CIR1抑制剂应用于制备预防、缓解和/或治疗肺癌骨转移的药物中，为肺癌骨转移的诊断、预后和治疗提供了新的思路。

说明书

技术领域

本发明属于医学肿瘤诊断与治疗领域，具体涉及CIR1作为分子标志物在肺癌骨转移诊断、治疗和预后评估中的应用。

背景技术

肿瘤骨转移是一种常见的肿瘤并发症，一个极其复杂精细的多步骤病理过程，此过程包括一系列严格顺序发生的事件：肿瘤细胞在原发灶生长和增殖并获得转移特征，进入循环系统；肿瘤细胞在循环系统中向骨组织趋向性移动；循环肿瘤细胞定植于骨组织；定植于骨组织的肿瘤细胞适应骨微环境存活，并在特定条件下苏醒、增殖最终形成影像可见的转移病灶。

目前关于骨转移的机制研究比较透彻的是乳腺癌骨转移和前列腺癌骨转移，在正常生理情况下，骨微环境中破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成是处于动态平衡状态。当肿瘤细胞转移发生至此阶段时，由于肿瘤细胞的参与，原本骨微环境中的动态平衡被打破。肿瘤细胞既可通过分泌PTHrP、IL-11、IL-6、IL-8、TGF-β、TNF、EGF等溶骨性因子直接激活破骨细胞前体细胞，也可通过调控OPG和RANKL的比例间接促进破骨细胞的分化成熟，使骨吸收大大增加，造成溶骨性破坏，继而为肿瘤提供进一步生长的空间。同时在破骨细胞的作用下，大量TGF-β、IGFs、钙等生长因子从骨基质中被释放出来，这些因子又可以被骨微环境中的肺癌细胞利用进一步促其生长。肿瘤细胞利用和改造骨微环境，诱导骨破坏的同时促进了自身的恶性增殖，如此往复，形成了骨转移癌的“恶性循环”。

肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，肺癌晚期可出现各个不同脏器的转移，可引起相应的症状，常给病人带来极大的痛苦甚至威胁到生命，临床最常见的转移有肺癌脑转移、肺癌骨转移等。然而，目前本领域对肺癌骨转移发生的调控机制认识仍十分有限，尚缺乏快速有效评价骨转移的无创性诊断方法以及治疗干预靶点。目前，肺癌骨转移的诊断主要基于骨扫描、CT等影像学方式，鉴于放射性损伤和经济学因素，无法实现实时监测；在规范肿瘤治疗基础上常合并抑制骨破坏治疗，如双膦酸盐类药物以及RANKL抑制剂，可一定程度上缓解骨相关事件的发生。但是这些治疗并非是针对肺癌骨转移的特异性治疗，30-50％接受这些治疗的患者仍然会发生新的骨转移；抑制骨破坏治疗在延长肺癌骨转移患者的生存期方面的作用也十分有限。

因此，本领域亟需对肺癌骨转移发生的调控机制进行进一步的研究和认识，发现新的高效的肺癌骨转移特异表达靶标对于肺癌骨转移的早期诊断、治疗和预后具有重要的意义。

发明内容

为解决本领域对肺癌骨转移机制认识有限，缺乏快速有效评价肺癌骨转移的无创性诊断方法及治疗干预靶点的问题，本发明的目的是提供一种CIR1作为分子标志物在肺癌骨转移诊断、治疗和预后评估中的应用，所述的CIR1作为早期预测肺癌骨转移的发生、诊断肺癌骨转移、预测疾病进展、评估治疗效果、指导药物使用和预后评价的靶标。

基于上述，本发明首先提供了CIR1作为分子标志物在肺癌骨转移诊断、治疗和预后评估中的应用。

另一方面，本发明还提供了CIR1抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗肺癌骨转移药物中的应用。

优选地，所述的CIR1抑制剂选自：能够全部或部分地抑制CIR1基因表达的物质；或能够全部或部分地抑制CIR1蛋白发挥功效的物质。

优选地，所述的物质包括：蛋白质、寡核苷酸、寡核苷酸表达载体、小分子化合物或者能够敲除或敲低CIR1基因表达的基因干预工具。

优选地，所述的CIR1抑制剂用于降低肺癌细胞的增殖、迁移能力。

优选地，所述的CIR1抑制剂用于抑制肺癌细胞对破骨细胞的促成熟作用。

另一方面，本发明还提供了用于检测CIR1表达水平的试剂在制备肺癌骨转移诊断和预后评估试剂或试剂盒中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种肺癌骨转移诊断和/或预后评估的试剂盒，所述试剂盒包括能够检测样本中CIR1蛋白表达或mRNA表达水平的试剂。

优选地，所述试剂盒包括采用qRT-PCR、Northern blot、FISH、ISH、Western blot或ELISA试剂盒。

优选地，所述样本包括人体血液样本或组织样本。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明发现CIR1在肺癌骨转移的组织和细胞中高表达，并伴有不良预后。体内体外实验证实了CIR1下调能够显著抑制肺癌细胞的增殖和迁移能力，从而抑制骨转移；同时，CIR1下调能显著抑制肺癌细胞对破骨细胞的促分化成熟作用，大大降低溶骨性破坏的发生。

基于上述发现，本发明提出将检测CIR1表达水平的试剂应用于制备检测肺癌是否发生骨转移的试剂盒和/或预测肺癌骨转移倾向的预后试剂盒中；将CIR1抑制剂应用于制备预防、缓解和/或治疗肺癌骨转移的药物中，为肺癌骨转移的诊断、预后和治疗提供了新的思路。

附图说明

图1表示定向骨转移细胞株的筛选，其中，

A：筛选含有Luciferase的稳转细胞株；

B：建立肺癌骨转移小鼠模型并筛选骨转移型肺癌细胞；

C：检测A549-BM细胞的骨转移能力。

图2表示CIR1在肺癌骨转移的组织和细胞中的表达情况，其中，

A：qRT-PCR检测CIR1在非小细胞肺癌细胞中的mRNA表达水平；

B：Westernblot检测CIR1在非小细胞肺癌细胞中的蛋白表达水平；

C：免疫组化检测CIR1在临床样本中的表达水平并进行定量分析；

D：CIR1表达水平在肺癌患者中的预后分析。

图3表示CIR1表达缺失降低骨转移发生，其中，

A：Westernblot法检测H460-BM中采用CRISPR-Cas9技术敲除CIR1的效率；

B：通过左心室注射(IC injection)或髂外动脉注射(IIA injection)H460-BM和H460-BM CIR1 KO细胞构建骨转移小鼠模型，分析CIR1敲除对H460-BM细胞骨转移能力的影响(每实验组n＝6)。左图为细胞注射4周后的生物发光成像和X-射线(BLI/x-ray)骨转移检测代表图；右图为生物发光成像强度定量图；

C：免疫组化检测H460-BM与H460-BM CIR1 KO细胞髂外注射4周后骨转移损伤位点的Ki67表达；

D：髂外注射骨转移模型分析CIR1敲除对早期骨定植癌细胞休眠状态的影响。H460-BM细胞和H460-BM CIR1 KO细胞移植1周后，免疫荧光染色(IF)检测早期骨微小转移灶切片中CK8+(红色)、EdU+(绿色，左)或P27+(绿色，右)；

E：高精度微小计算机断层扫描(micro-CT)(左)和三维重建(右)比较H460-BM细胞和H460-BM CIR1 KO细胞形成转移损伤的股骨，并统计骨体积分数(Bone volume/tissuevolume，BV/TV)；

F：酒石酸抗酸性磷酸酶染色(TRAP)标记溶骨损伤处的成熟破骨细胞(左)，定量肿瘤边界处TRAP阳性的细胞(右)，箭头表示TRAP阳性的细胞；T表示肿瘤；B表示骨组织。

图4表示CIR1低表达降低骨转移发生，其中，

A：Western blot法和qRT-PCR检测H460-BM中CIR1的敲低效率；

B：MTT法检测H460-BM和H460-BM CIR1 KD细胞0、24、48、72、96小时活细胞的数量；

C：以H460-BM细胞为对照，检测H460-BM CIR1 KD细胞在软琼脂上增殖能力，2-3周后进行软琼脂集落生长分析；

D：Transwell小室检测8000个H460-BM和H460-BM CIR1 KD细胞12个小时的侵袭能力；

E：将2×10

F：对转移骨组织切片进行免疫组化，检测Ki67的表达水平；

G：使用micro-CT对发生骨转移的小鼠的股骨进行扫描、骨骼三维重建以及各骨密度指标分析，并统计骨体积分数(Bone volume/tissue volume，BV/TV)；

H：对转移骨组织切片进行TRAP染色，检测破骨细胞分化程度和数量。

图5表示CIR1高表达促进骨转移发生，其中，

A：Western blot法检测H460-BM、H460和H460 CIR1 OE细胞的CIR1表达水平；

B：左心室注射和髂外动脉注射比较H460细胞和H460 CIR1 OE细胞的骨转移能力(每实验组n＝6)。左侧为左心室注射和髂外动脉注射H460细胞或H460 CIR1 OE细胞4周后的生物发光成像和X-射线(BLI/x-ray)骨转移检测代表图；右侧为生物发光成像强度定量；

C：免疫组化检测H460与H460 CIR1 OE细胞髂外注射4周后骨转移损伤位点的Ki67表达；

D：髂外注射骨转移模型分析高表达CIR1对早期骨定植细胞休眠状态的影响。H460-BM细胞和H460 CIR1 OE细胞移植1周后，免疫荧光染色(IF)检测早期骨微小转移灶切片中CK8+(红色)和EdU+(绿色)；

E：高精度微小计算机断层扫描(micro-CT)(左)和三维重建(右)比较H460细胞和H460 CIR1 OE细胞形成转移损伤的股骨；

F：TRAP染色标记溶骨损伤处的成熟破骨细胞(左)，定量肿瘤边界处TRAP阳性的细胞(右，每组3只老鼠n＝8)，箭头表示TRAP阳性的细胞；T表示肿瘤；B表示骨组织。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

RBPJ协同抑制因子(Corepressor interacting with RBPJ，CIR1)首次发现作为RBPJ的结合蛋白，招募转录抑制因子RBPJ到组蛋白去乙酰化酶复合物上，关闭Notch受体在核内的转录激活，负向调控Notch信号通路。另有研究发现，在常染色体色素性视网膜炎中，CIR1作为RNA结合蛋白，通过结合致病基因PAP-1，影响PAP-1的剪接发挥致病作用。目前，关于CIR1在生物学和病理学中的功能作用尚未可知。

如前所述，为解决本领域对肺癌骨转移机制认识有限，缺乏快速有效评价肺癌骨转移的无创性诊断方法及治疗干预靶点的问题。本发明申请人通过大量筛选和研究，发现CIR1在肺癌骨转移的组织和细胞中高表达，并伴有不良预后。

后续体内体外实验证实了CIR1下调能够显著抑制肺癌细胞的增殖和迁移能力，从而抑制骨转移；同时，CIR1下调能显著抑制肺癌细胞对破骨细胞的促分化成熟作用，大大降低溶骨性破坏的发生。最终首次提供了CIR1作为分子标志物在肺癌骨转移诊断、治疗和预后评估中的应用。

另一方面，本发明还提供了CIR1抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗肺癌骨转移药物中的应用。

优选地，所述的CIR1抑制剂选自：能够全部或部分地抑制CIR1基因表达的物质；或能够全部或部分地抑制CIR1蛋白发挥功效的物质。

进一步说明，能够全部或部分抑制CIR1基因表达的物质可以是通过中断CIR1基因的转录和/或阻断CIR1基因的mRNA翻译实现；能够全部或部分抑制CIR1蛋白发挥功效的物质至少应理解为能够抑制CIR1蛋白的活性、有效作用时长、稳定性的物质。

优选地，所述的物质包括：蛋白质、寡核苷酸、寡核苷酸表达载体、小分子化合物或者能够敲除或敲低CIR1基因表达的基因干预工具。

进一步说明，敲除或敲低CIR1基因表达的基因干预工具可为能够在基因层面对CIR1基因进行敲除或敲低的任何干预工具，如RNAi片段(如siRNA、shRNA、miRNA)或基因编辑工具(如CRISPR-Cas9、ZFN、TALENs等)。

优选地，所述的CIR1抑制剂用于降低肺癌细胞的增殖、迁移能力。

优选地，所述的CIR1抑制剂用于抑制肺癌细胞对破骨细胞的促分化成熟作用。

另一方面，本发明还提供了用于检测CIR1表达水平的试剂在制备肺癌骨转移诊断和/或预后评估试剂或试剂盒中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种肺癌骨转移诊断和/或预后评估的试剂盒，所述试剂盒包括能够检测样本中CIR1蛋白表达或mRNA表达水平的试剂。

优选地，所述试剂盒包括采用qRT-PCR、Northern blot、FISH、ISH、Western blot或ELISA试剂盒。

优选地，所述样本包括人体血液样本或组织样本。

下面结合具体实验，进一步阐述本发明思路，但本发明的保护范围但并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法或实验条件，如无特殊说明，均按常规方法或厂家说明书进行，下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料与方法

1、实验材料

(1)细胞系：非转移性人肺癌细胞系A549、H1975、LLC、H1299、H460，均购自中科院上海细胞库。

另外，基于购买的非转移性人肺癌细胞系构建筛选骨转移型细胞：把A549细胞通过左心室注射入裸鼠体内，部分细胞转移至骨头后，把骨组织中的癌细胞分选出来再重新打入裸鼠体内，几个循环后得到骨转移型肺癌细胞BM549(也表示成A549-BM)。同样方法，分别筛选获得骨转移型肺癌细胞BM1975、BM-LLC、BM1299和H460-BM。

需要说明的是，本申请中，“H460-BM细胞”也表示成“BM460细胞”或“SPC细胞”，可互换使用。

(2)临床组织样本：2010年至2011年期间上海市胸科医院收集的肺癌患者穿刺活检、手术获得的肺癌组织样本及癌旁样本以及临床病理资料；2016年至2021年期间复旦大学附属中山医院收集的缓解肿瘤压迫疼痛的脊柱骨转移病灶切除术获得的肺癌骨转移样本及临床病理资料。本项研究中肺癌患者的临床样本和临床病理资料均经过患者同意和伦理委员会批准。

(3)实验动物：6～8周龄，18～20g的BALB/c无胸腺裸鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司。本研究中所有小鼠相关实验已获得中国科学院分子细胞科学卓越创新中心动物管理委员会的批准。

2、实验方法

(1)酒石酸抗酸性磷酸酶染色(TRAP)染色

配制TRAP实验相关试剂：

A液(0.1M醋酸缓冲液pH5.0)：将1.3608g醋酸钠(CH

B液(六偶氮副品红)：2g亚硝酸钠(NaNO2)溶于50mL去离子水中，得到4％亚硝酸钠溶液；2.5g副品红(C19H17N3)溶于50mL去离子水中，加入7.5mL浓盐酸，加热至90℃溶解后，利用0.22μm滤膜过滤，得到副品红溶液，储存于4℃棕色瓶中。使用前4％亚硝酸钠与副品红溶液等比例混合得到B液。

C液：20mg萘酚AS-BI磷酸酯+1mL N,N-二甲基甲酰胺溶解混合。

染色方法：将骨切片脱蜡复水后，切片置于TRAP孵育液(A液18mL+B液1mL+C液1mL充分混匀，利用1M NaOH或者1M盐酸调pH至5.0，再向溶液中加入0.282g的酒石酸钾钠(NaKC4H4O6)，充分溶解后，利用0.22μm滤膜过滤，即为TRAP孵育液)，在37℃条件下，孵育50分钟，显微镜下观察到破骨细胞呈酒红色则终止反应。利用蒸馏水漂洗。切片放入Harris苏木素染色5分钟作用，流水冲洗，利用1％的盐酸酒精分化数秒，流水冲洗，现配0.6％氨水返蓝，流水冲洗。然后正常脱水。二甲苯透明3次，每次5分钟，晾干，封片，镜检。

(2)肺癌骨转移模型小鼠的构建

实验前利用异氟烷或三溴乙醇将小鼠麻醉后，根据不同方法构建不同小鼠肿瘤模型。小鼠左心室注射(IC injection)：将癌细胞重悬于100μl PBS，注射于小鼠左心室。髂外注射(IIA injection)：将癌细胞重悬于50μl PBS，注射于小鼠髂外动脉。1周后检测小鼠早期骨微小损伤与肿瘤休眠状态，4周后用生物发光成像系统和X射线(BLI/x-ray)监测骨转移进展和溶骨性病变的透射性损伤。

一周或四周后，处死小鼠，将小鼠腿骨取出，PFA固定，非骨组织可直接包埋切片；骨组织micro-CT扫描后，脱钙2周，可进行包埋切片。

实施例1、定向骨转移肺癌细胞株的筛选获得

为研究肺癌骨转移的分子机制，本申请构建了肺癌骨转移小鼠模型并筛选了骨转移型肺癌细胞。首先，利用含有荧光素酶基因(Luciferase)的慢病毒感染非小细胞肺癌细胞A549，经过几轮抗性筛选，获得含有Luciferase的稳转细胞株(图1的A)。随后构建了肺癌骨转移小鼠模型(左心室注射模型)，利用小动物超声诊断仪在裸鼠体表将含有Luciferase的稳转细胞株通过左心室注射入裸鼠体内，通过小动物活体成像技术判断肺癌细胞在裸鼠骨组织的定位。之后，利用左心室注射模型，成功筛选出了骨转移型肺癌细胞A549-BM，具体为：将A549(Luciferase)细胞注射小鼠左心室，通过小动物活体成像技术判断肺癌细胞的定位并分离出定位在骨组织中的肺癌细胞，经体外筛选培养后再次注射入小鼠左心室，经10个循环后，注射入裸鼠体内的A549细胞全部定位于骨组织，定义其为骨转移型肺癌细胞A549-BM(图1的B)。

最后，本实施例验证了A549-BM的骨转移能力，通过左心室注射模型，将A549细胞和A549-BM细胞分别注射小鼠左心室，30天后，小动物活体成像显示，A549-BM细胞组小鼠四肢关节检测到转移灶信号，micro-CT检测发现注射A549-BM细胞的裸鼠骨质破坏情况更加严重(图1的C)，提示A549-BM具有特异性的骨转移潜能，可以形成与人肺癌骨转移类似的病灶；左心室注射肺癌骨转移小鼠模型可以很好地模拟肺癌骨转移的发生过程，为该项目后续工作提供了细胞和动物模型。

参照本实施例方法，还另外分别筛选获得骨转移型肺癌细胞BM1975、BM-LLC、BM1299和H460-BM。

实施例2、CIR1在肺癌骨转移诊断、治疗和预后评估中作为标志物的分析

(一)CIR1在肺癌骨转移组织和细胞中高表达

在实施例1筛选得到的非小细胞肺癌骨转移型肺癌细胞BM549、BM1975、BM-LLC及其对应的母代细胞A549、H1975、LLC中，通过qRT-PCR和Western blotting技术，分别检测CIR1的mRNA和蛋白表达水平。结果如图2中A-B图所示：与无骨转移母代细胞相比，骨转移型肺癌细胞中CIR1的mRNA及蛋白表达量显著增多。

另外，通过免疫组化染色的方法，在本申请收集的临床组织样本中检测CIR1的蛋白表达量。结果如图2中C图所示：与癌旁组织和肺癌原位组织相比，肺癌骨转移组织样本中CIR1的蛋白表达量明显升高。

以上结果表明：CIR1在肺癌骨转移组织和细胞中高表达，因此，可以通过检测CIR1表达水平，诊断是否发生肺癌骨转移。例如，以受检者肺癌组织样本中CIR1的mRNA或蛋白表达量为指标，或受检者肺癌组织样本中CIR1的mRNA或蛋白表达量与对照组织比较值为指标，如指标超过设定阈值，则判定为骨转移。

(二)CIR1高表达预示着预后生存时间短

基于TCGA数据库，将数据库中的肺癌病人分为CIR1高表达组和CIR1低表达组，并进一步结合患者的预后生存时间分析，结果发现：与CIR1低表达组相比，CIR1高表达组的肺癌病人表现出更差的预后(图2的D)。

因为数据库中没有肺癌患者是否发生骨转移的病情资料，但基于本申请前期和后续的一些研究，本申请可以合理推测：CIR1高表达预示着骨转移风险较大，生存时间较短。

实施例3、CIR1表达缺失降低骨转移发生

为进一步验证CIR1是否在骨转移中发挥功能，本申请通过CRISPR-Cas9技术在H460-BM细胞中构建了稳定敲除CIR1基因的细胞H460-BM CIR1KO细胞，Westernblot实验验证了敲除效率(图3的A)。采用本申请前述的肺癌骨转移动物模型构建方法，将H460-BM细胞与H460-BM CIR1 KO细胞分别对小鼠进行左心室注射和髂外动脉注射，并进行后续一系列骨转移进展监测、骨破损检测等相关分析。

结果如图3所示：H460-BM CIR1 KO细胞(图中表示CIR1 KO)和H460-BM细胞(图中表示CIR1 WT)移植1周后，免疫荧光实验检测发现，相较于CIR1 WT组，CIR1 KO组小鼠核苷类似物Edu摄入量明显减少，细胞休眠标志物P27表达量明显升高(图3的D)；4周后，BLI/x-ray成像说明在两种骨转移小鼠模型中，H460-BM细胞均可以定向骨转移，而H460-BM CIR1KO细胞则失去定向骨转移的能力(图3的B)；进一步，通过免疫组化实验检测细胞增殖标志物Ki67的表达，结果发现，敲除CIR1的H460-BM细胞(即H460-BM CIR1 KO细胞)在骨组织中的增殖能力也受到一定程度的抑制(图3的C)。

除此之外，我们对小鼠的股骨进行micro-CT分析并进行骨体积分数定量分析，结果发现：与H460-BM细胞相比，H460-BM CIR1 KO细胞的骨质破坏能力明显减弱(图3的E)；TRAP染色发现，H460-BM可以促进破骨细胞的分化成熟，而敲除CIR1基因后，促进效果消失(图3的F)。

以上实验结果表明，敲除CIR1基因后，能促进肺癌细胞在早期进入休眠状态，而后又能抑制肺癌细胞的定向骨转移能力和骨质破坏能力，最终降低肺癌细胞骨转移的发生概率。

实施例4、CIR1低表达降低骨转移发生

本实施例通过shRNA在H460-BM细胞中稳定降低CIR1的表达，得到H460-BM CIR1KD细胞，Westernblot和qRT-PCR实验验证了敲低效率(图4的A)。随后，通过MTT实验对H460-BM(图中表示CIR1 WT)与H460-BM CIR1 KD(图中表示CIR1 KD)的细胞进行了恶性程度鉴定，结果发现，CIR1KD肺癌细胞的增殖能力明显受到抑制(图4的B)；Low density实验发现，CIR1 KD肺癌细胞形成克隆能力明显受到抑制(图4的C)；Transwell实验发现，CIR1 KD肺癌细胞的侵袭能力明显受到抑制(图4的D)。

进一步，本实施例将H460-BM细胞与H460-BM CIR1 KD细胞分别对小鼠进行左心室注射和髂外动脉注射，4周后，BLI/x-ray成像说明CIR1敲低后，肿瘤细胞在骨组织中的定植增殖能力明显减弱(图4的E)；通过免疫组化实验检测细胞增殖标志物Ki67的表达，结果发现CIR1敲低后，肿瘤细胞在骨组织中的增殖能力也受到一定程度的抑制(图4的G)；进一步，对小鼠的股骨进行micro-CT分析，结果发现，与CIR1 WT组相比，CIR1 KD组小鼠的骨质破坏能力明显减弱(图4的F)；对骨组织切片进行TRAP染色检测破骨细胞的数量，结果发现，CIR1敲低后，肿瘤细胞与骨组织的交界面处成熟破骨细胞的数量明显减少(图4的H)。说明CIR1可能参与调控肺癌细胞对破骨细胞的促分化成熟作用。

以上实验结果共同显示，敲低CIR能抑制肺癌细胞的增殖和迁移能力，同时能抑制肺癌细胞对破骨细胞的促分化成熟作用，降低骨破损能力。

实施例5、CIR1高表达促进骨转移发生

本实施例在母代细胞H460中构建了CIR1稳定高表达的细胞H460-CIR1OE，并通过Western blot实验比较其与H460-BM细胞中CIR1的表达能力，结果发现，H460 CIR1 OE细胞的CIR1的表达量略高于H460-BM细胞，但没有太大差异(图5的A)，可用于后续实验。

通过左心室注射技术和髂外动脉注射技术分别将H460和H460-CIR1 OE细胞打入裸鼠体内，1周后，免疫荧光检测发现，相较于对照control组(即植入H460细胞组)，CIR1高表达后(即CIR1 OE组)，小鼠的核苷类似物Edu摄入量明显增加，细胞休眠标志物P27表达量明显降低(图5的D)。4周后，BLI/x-ray成像说明，与H460细胞相比，H460-CIR1 OE细胞表现出较强的骨组织定植、增殖能力(图5的B)；免疫组化检测发现CIR1高表达能促进肺癌细胞中细胞增殖标志物Ki67的表达(图5的C)；小鼠股骨的micro-CT分析以及骨体积分数定量表明，与H460细胞相比，H460-CIR1 OE细胞的骨质破坏能力明显增强(图5的E)；TRAP染色也发现，CIR1高表达后，H460细胞能明显促进其周围破骨细胞的分化成熟(图5的F)。

以上实验结果共同表明，CIR1具有促进肺癌骨转移的能力。

综上，本发明经过大量研究与实验证明，最终提出将检测CIR1表达水平的试剂应用于制备检测肺癌是否发生骨转移的试剂盒和/或预测肺癌骨转移倾向的预后试剂盒中；将CIR1抑制剂应用于制备预防、缓解和/或治疗肺癌骨转移的药物中，为肺癌骨转移的诊断、预后和治疗提供了新的思路。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。