以人源LIGHT截短型突变蛋白为基础的抗肿瘤的应用

摘要

本发明涉及一种以人源LIGHT截短型突变蛋白为基础的抗肿瘤的应用，属于LIGHT在抗肿瘤领域的应用。具体地，本发明涉及一种包含点突变的人源LIGHT序列(hmLIGHT)为基础纯化的蛋白形式以及DNA形式在肿瘤免疫治疗中的应用。本发明通过体外实验证明人源LIGHT突变蛋白能与小鼠受体结合，体内抗肿瘤实验确定了上述蛋白形式及DNA形式均在小鼠肿瘤模型上展现出了良好的抗肿瘤效果，并且将DNA形式VR‑hmLIGHT与肿瘤疫苗及化药联合均取得更好的抗肿瘤效果，因此在LIGHT的抗肿瘤免疫治疗中具有更好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及LIGHT在抗肿瘤领域的应用。具体地说，本发明涉及人源LIGHT突变蛋白或DNA的制备及抗肿瘤应用。

背景技术

肿瘤已经成为中国乃至全球主要死亡原因之一，是危害全人类生命健康的一大顽症。预计到2040年，全球癌症新增将达到2840万例。因此，寻求更加有效的癌症治疗方案刻不容缓。随着免疫检查点阻断(ICB)疗法及CAR-T疗法的空前成功，肿瘤免疫疗法为癌症的治疗带来了希望。然而，临床研究发现缺乏肿瘤浸润T淋巴细胞的患者(“冷”肿瘤)通常对ICB治疗不敏感，并且瘤内T细胞的浸润情况与患者的预后呈正相关。这提示我们，瘤内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的浸润对癌症治疗是至关重要的。细胞毒性T淋巴细胞是对抗和杀死癌细胞的主要免疫效应细胞，由于肿瘤细胞及肿瘤微环境的免疫抑制状态，CTL很难浸润到肿瘤部位。因此，现在的关键问题是如何诱导免疫细胞浸润到“冷”肿瘤中，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。研究发现LIGHT具有促进T细胞增殖活化，使肿瘤血管正常化，促进三级淋巴结构形成，促进CTL瘤内浸润，调节肿瘤微环境等功能，促进“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。

LIGHT是TNF超家族的成员，也称为TNFSF14或HVEM-L，人源LIGHT(hLIGHT)可以与三种不同的受体结合，即淋巴毒素β受体(LymphotoxinβReceptor，LTβR)，疱疹病毒进入介质(HVEM/TR2)以及DcR3/TR6。LIGHT主要表达在未成熟的树突状细胞(DC)和活化的T细胞表面。研究表明LIGHT-HVEM信号通路作为T细胞活化的第二信号促进T细胞增值活化，LTβR通过调节抗原呈递的DC细胞、肥大细胞、巨噬细胞和间质细胞分化来间接影响T细胞活化。此外，基质细胞中的LTβR信号与淋巴结和炎症部位的微环境有关，在持续炎症部位，LIGHT-LTβR信号促进三级淋巴结构(TLS，Tertiary lymphoid structures)的形成。DcR3与LIGHT结合后抑制LIGHT-HVEM/LTβR通路，参与肿瘤细胞免疫逃逸。多项研究证明LIGHT可以将T细胞募集到肿瘤微环境中，并使肿瘤组织中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)等Th1型细胞因子分泌增加，调节微环境，具有强大的抗肿瘤反应。

hLIGHT是由240个氨基酸构成的Ⅱ型膜蛋白，分子量为29kD，包含一个位于N端由37个氨基酸组成的胞内区、一个由22个疏水氨基酸组成的跨膜区和一个由181个氨基酸组成的胞外区，其功能区在胞外区。由于hLIGHT不与鼠源受体HVEM及LTβR结合，无法利用小鼠对其免疫功能进行有效探究，因此开发能与小鼠HVEM及LTβR受体结合的hLIGHT突变形式十分重要。尽管小鼠体内并未发现受体DcR3，但考虑到后续可能在人体中的应用，对其与DcR3结合有关的位点进行突变也是有益的。

目前，有研究证明hLIGHT突变位点的作用，并且取得较好的抗肿瘤效果，因此推测这种策略是可行的。如傅阳心等人证明hLIGHT突变四个位点后可与鼠源受体结合，并且在多种小鼠肿瘤模型上具有抗肿瘤作用。Tomohiro Morishige等人的研究表明，将118位从L突变成G，即亮氨酸突变为甘氨酸突变能降低hLIGHT对DcR3的亲和力。但是，目前还没有将上述两类突变同时应用的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种可规避免疫逃避的具有抗肿瘤活性的人源LIGHT截短型突变(hmLIGHT)的DNA片段，并且本发明除了构建DNA形式，还通过原核表达系统进行了蛋白纯化。同时该发明还提供了该DNA形式及蛋白形式在抗肿瘤治疗中的应用。

下面对本发明的技术方案介绍如下：

本发明所述的一种SEQ ID NO:1所示的hmLIGHT DNA片段，与hLIGHT全长序列相比进行了截短并且进行了五个蛋白位点突变。包含hLIGHT胞外段(氨基酸序列为66位到240位)核苷酸序列，为了使其能与小鼠受体HVEM和LTβR结合，根据参考文献对以下四个位点进行突变，分别是第138位从A突变成T，即丙氨酸变成苏氨酸：第160位从S突变成G，即丝氨酸突变成甘氨酸：第221位碱基从D突变成G，即天冬氨酸变成甘氨酸：第222位从E突变成K,即谷氨酸变成赖氨酸。并且为了降低对DcR3的亲和力，将118位从L突变成G，即亮氨酸突变为甘氨酸。

本发明所述的一种SEQ ID NO:2所示的VR-hmLIGHT DNA片段，所述序列包含一段Kozak序列，一段分泌信号肽tPA序列，以及上述SEQ ID NO:1的hmLIGHT序列。

本发明所述的一种SEQ ID NO:3所示的hmLIGHT蛋白片段。

本发明还包括上述片段序列制备的DNA形式及蛋白形式在抗肿瘤免疫治疗中的应用。

本发明的优点在于新序列包含有经过序列突变的hLIGHT截短形式，其可以与人源和鼠源的HVEM及LTβR受体结合，具有促进瘤内T细胞的浸润，激起抗肿瘤免疫反应，且含有降低hLIGHT对DcR3的亲和力的突变位点，降低了人体内可能引起的免疫逃逸潜力。这种形式未见报道，并且以上述片段为基础构建的DNA形式及蛋白形式均有抗肿瘤活性，这为基于LIGHT的抗肿瘤应用奠定了基础。

附图说明

图1A：pET-28a-hmLIGHT构建示意图，该重组质粒为DNA片段SEQ ID NO:1于pET-28a载体中形成；

图1B：pET-28a-hmLIGHT质粒示意图；

图1C：hmLIGHT蛋白纯化，将pET-28a-hmLIGHT质粒转化到大肠杆菌感受态，通过IPTG诱导表达，镍柱纯化，获得hmLIGHT蛋白；

图2A：ELISA检测hmLIGHT蛋白与小鼠HVEM结合；

图2B：ELISA检测hmLIGHT蛋白与小鼠LTβR结合；

图2C：ELISA检测hmLIGHT蛋白与人HVEM结合；

图2D：ELISA检测hmLIGHT蛋白与人LTβR结合；

图2E：ELISA检测hmLIGHT蛋白与人DcR3结合；

图2F：hmLIGHT蛋白作为第二信号促进小鼠CD8

图3A：hmLIGHT蛋白在小鼠4T1乳腺癌模型上的抗肿瘤效果探究的免疫策略，当肿瘤体积达到100mm

图3B：小鼠的平均肿瘤体积生长，在小鼠皮下接种肿瘤细胞的第9天开始，每两三天测量一次小鼠肿瘤体积并记录作图，平均值±SEM，(

图3C：小鼠肿瘤称重的结果，在第27天对小鼠进行肿瘤的剥取后各组小鼠肿瘤称重的结果，平均值±SEM；

图4A：VR-hmLIGHT结构示意图，该重组质粒为DNA片段SEQ ID NO:1于VR1012载体中形成；

图4B：VR-hmLIGHT质粒示意图；

图4C：VR-hmLIGHT真核表达，将VR-hmLIGHT质粒瞬时转染293T细胞后通过蛋白印记法证明蛋白表达；

图5A：VR-hmLIGHT在小鼠4T1乳腺癌模型上的抗肿瘤效果探究的免疫策略，当肿瘤体积达到100mm

图5B：小鼠的平均肿瘤生长体积，在小鼠皮下接种肿瘤细胞的第9天开始，每两三天测量一次小鼠肿瘤体积并记录作图，平均值±SEM，(

图5C：小鼠的肿瘤重量对比，在第25天处死小鼠后剥离皮下肿瘤并称重记录，平均值±SEM，(

图5D：小鼠肿瘤中CD8

图5E：小鼠肿瘤中活化的CD8

图5F：小鼠肿瘤中CD4

图5G：小鼠肿瘤中活化的CD4

图5H：小鼠肿瘤中MDSC的比例；

图5I：VR-hmLIGHT在小鼠Panc02胰腺癌模型上的抗肿瘤效果；

图5J：VR-hmLIGHT在小鼠CT26结直肠癌模型上的抗肿瘤效果；

图6A：VR-hmLIGHT与肿瘤疫苗联合治疗小鼠4T1乳腺癌策略图，将荷瘤小鼠随机分为5组，(PBS，VR-MOCK，VR-hmLIGHT，OsFS及VR-hmLIGHT和OsFS联合组(Com))，每组5只小鼠，并用以下方法治疗：在第9，11，14天进行OsFS疫苗免疫，每只小鼠肌肉注射100ng，并使用活体基因导入仪导入，从第11天开始进行瘤内注射VR-hmLIGHT治疗，每三天一次，共5次；

图6B：小鼠的平均肿瘤生长曲线，在小鼠皮下接种肿瘤细胞的第10天开始，每两三天测量一次小鼠肿瘤体积并记录作图，平均值±SEM，(

图6C：小鼠肿瘤称重的结果，在第27天对小鼠进行肿瘤的剥取后各组小鼠肿瘤称重的结果，平均值±SEM，(

图7A：VR-hmLIGHT联合DOX治疗小鼠4T1乳腺癌，将荷瘤小鼠随机分为5组(PBS，VR-MOCK，VR-hmLIGHT，DOX及VR-hmLIGHT和DOX联合(VR-hmLIGHT+DOX))，每组5只小鼠，并用以下方法治疗：第10，14，19，23天腹腔注射DOX，剂量为5mg/kg，第12天开始VR-hmLIGHT治疗，每三天一次，共5次；

图7B：小鼠的平均肿瘤生长曲线，在小鼠皮下接种肿瘤细胞的第10天开始，每两三天测量一次小鼠肿瘤体积并记录作图，平均值±SEM，(

图7C：小鼠肿瘤称重的结果，在第27天对小鼠进行肿瘤的剥取后各组小鼠肿瘤称重的结果，平均值±SEM。

具体实施方式

1.pET-28a-hmLIGHT构建、蛋白纯化及体外活性验证。

选取hLIGHT胞外结构域66-240氨基酸，并对138位、160位、221位、222位氨基酸位点进行了突变，使其能与小鼠受体结合，并且为了降低对DcR3的亲和力，将118位也进行突变，称为hmLIGHT，(SEQ ID NO:1)，此片段由南京金斯瑞公司合成。为进行hmLIGHT蛋白原核纯化，将hmLIGHT构建到pET-28a载体，N端含有his标签，即pET-28a-hmLIGHT(图1A)。通过酶切连接的方式构建成功，共5857bp，图谱见图1B。

将pET-28a-hmLIGHT质粒转化至BL21(DE3)感受态中，LB固体培养基培养获得单菌落。挑取部分单菌落进行试表达实验，通过考马斯亮蓝染色及Western Blot选取表达正确且产量高的菌株进行大量培养，收集菌体，超声破碎后离心并过滤后得到菌液上清，用镍亲和层析柱进行蛋白纯化。用含有50mM、100mM和300mM咪唑浓度的洗脱液对菌液上清梯度洗涤。收集洗脱液进行考马斯亮蓝染色分析。结果表明，300mM咪唑洗脱液中得到hmLIGHT蛋白，其纯度在90％以上(图1C)。

首先检测纯化获得的hmLIGHT蛋白是否能与小鼠即人受体HVEM和LTβR结合。ELISA结果证明hmLIGHT蛋白成功与鼠源受体HVEM和LTβR结合(图2A，B)，并且依然保留与人源受体HVEM和LTβR结合的能力(图2C，D)。同时还发现hmLIGHT蛋白与人DcR3的结合能力很弱(图2E)。将纯化的hmLIGHT蛋白对小鼠CD8

2.hmLIGHT蛋白在小鼠4T1乳腺癌模型上的抗肿瘤应用

为检测hmLIGHT蛋白在体内的抗肿瘤活性，将Balb/c小鼠皮下接种2×10

3.VR-hmLIGHT构建及蛋白表达鉴定。

所用载体为真核表达质粒VR1012，为提高蛋白的分泌表达，在hmLIGHT 5’端添加tPA信号肽，KOZAK序列，构建示意图如图4A所示，将合成的hmLIGHT DNA片段，通过酶切连接的方式获得VR-hmLIGHT质粒(图4A)。共5467bp，图谱见图4B。将VR-hmLIGHT以及VR1012空质粒转染293T细胞，48小时后收集细胞并裂解，获得蛋白样品进行western blot蛋白免疫印迹分析，使用hLIGHT抗体检测VR-hmLIGHT质粒中的蛋白表达是否正确。结果如图4C所示，在电泳图上可以看到清晰的蛋白条带，大小为20KD左右，说明可以正确表达hmLIGHT蛋白。

4.VR-hmLIGHT在小鼠4T1乳腺癌模型上抗肿瘤效果

将Balb/c小鼠皮下接种2×10

接下来分析VR-hmLIGHT瘤内治疗对肿瘤微环境的影响。荷瘤后第25天取各组小鼠肿瘤，经胶原酶裂解成单细胞悬液进行检测，检测CD4

5.VR-hmLIGHT与肿瘤疫苗联合治疗小鼠4T1乳腺癌

用hmLIGHT与肿瘤疫苗OsFS联合，希望疫苗诱导外周CD8

6.VR-hmLIGHT与化药多柔比星(DOX)联合治疗小鼠4T1乳腺癌

由于4T1乳腺癌模型免疫原性低，很难激起机体强烈的免疫反应。化疗药物多柔比星，除了直接杀死肿瘤细胞外，还能引起细胞免疫原性细胞死亡，增强免疫应答。因此，我们用VR-hmLIGHT与DOX联合，希望DOX诱导显著的外周CD8