一种免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗糖尿病心肌病的药物中的应用

摘要

本发明涉及一种免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗糖尿病心肌病的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明提供了免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗糖尿病心肌病的药物中的应用。本发明的免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914通过抑制LMP7亚基，改善糖尿病小鼠心脏收缩和舒张功能，抑制心肌肥厚及降低心肌间质纤维化。本发明的免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914有望成为治疗糖尿病心肌病的新药物，还为寻找治疗糖尿病心肌病的靶位点提供了依据。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗糖尿病心肌病的药物中的应用。

背景技术

糖尿病心肌病指的是独立于高血压、瓣膜病、冠心病以外，由糖尿病引起的心脏结构和功能异常。糖尿病患者心功能障碍在早期是无症状的，只出现轻微的左室舒张功能受损，随着心肌肥厚和纤维化的加剧，左室收缩功能也受到影响，最终发展为难治性终末期心力衰竭。糖尿病心肌病自1972年被首次提出以来，大量的研究致力于探讨其发病机制，包括高血糖与高脂肪酸等代谢异常，线粒体功能障碍，氧化应激与内质网应激增加，心脏呈慢性炎症状态等。然而目前仍然缺乏有效的治疗措施，需要进一步研究其潜在的分子机制，寻找有效的治疗药物以及靶点。

在真核细胞内，80％以上的蛋白质通过泛素蛋白酶体系统降解，标准型26S蛋白酶体是一个多亚基复合体，包括19S的调控组件和20S的催化核心。19S复合体结合多泛素化标记的蛋白质，并将其输送到20S催化核心桶装结构内部进行水解。20S复合体包含3个活性亚基(β1有类半光天冬酶活性、β2有类胰蛋白酶活性、β5分有类糜蛋白酶活性)。免疫蛋白酶体可在多种细胞因子(如:IFN-Y、TNF-α等)刺激下，由20S复合体的β1、β2、β5亚基分别被LMP2、LMP10、LMP7取代形成。免疫蛋白酶体最初因参与MHC-I抗原肽的加工呈递而被发现，在淋巴组织中表达丰富。近年来的研究发现，免疫蛋白酶体在视网膜，大脑和心脏等组织器官中也有表达，具有参与调控炎症因子分泌，调控细胞增殖分化，维持蛋白质稳态等多种功能。最近的研究表明，免疫蛋白酶体参与多种心血管疾病(如:动脉粥样硬化、心肌炎、心力衰竭等)的发生与发展，然而关于免疫蛋白酶体在糖尿病心肌病中作用的研究仍非常有限。

基于此，提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗糖尿病心肌病的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗糖尿病心肌病的药物中的应用。

作为优选，所述免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914是通过抑制NLRP3炎症小体信号通路和/或抑制内皮细胞间充质转化发挥作用。

作为优选，所述内皮细胞间充质为TGF-β诱导的内皮细胞间充质。

本发明还提供了免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗心肌炎症的药物中的应用。

作为优选，所述心肌炎症为NLRP3炎症小体引起的心肌炎症。

本发明还提供了免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗心肌纤维化的药物中的应用。

作为优选，所述心肌纤维化为内皮细胞间充质转化的；

所述内皮细胞间充质为TGF-β诱导的内皮细胞间充质。

本发明还提供了免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在寻找治疗糖尿病心肌病的靶点中的应用。

本发明提供了一种免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗糖尿病心肌病的药物中的应用，本发明的免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914通过抑制LMP7亚基，改善糖尿病小鼠心脏收缩和舒张功能，抑制心肌肥厚及降低心肌间质纤维化。与糖尿病组小鼠相比，ONX0914治疗组小鼠心脏组织中NLRP3炎症小体表达量明显降低，其下游相关cl-caspasel、IL-1β和IL-18表达也同步降低。此外，内皮标志物(CD31、VE-cadherin)表达显著升高，而间质标志物(Vimentin、aSMA)则明显降低。体外实验也进一步发现ONX0914不仅可以抑制H9c2细胞NLRP3炎症小体信号通路活化，即可以抑制心肌炎；而且也可以显著抑制TGF-β诱导的HUVEC细胞间质标志物(Vimentin、aSMA)表达并同时促进内皮标志物(CD31、VE-cadherin)的表达，即可以抑制心肌纤维化。可见免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914可以作为治疗糖尿病心肌病的药物，该药物也可以治疗心肌炎和心肌纤维化。

附图说明

图1为ONX0914对糖尿病小鼠血糖浓度以及心脏与体重比值的影响(其中A表示糖尿病模型构建模式图，B表示小鼠静脉血糖值，C表示小鼠左心室与体重的比值，Con表示对照组，DCM表示糖尿病组，DCM+ONX表示糖尿病+ONX0914组)。

图2为ONX0914对糖尿病小鼠心功能的影响(A表示典型二维超声心动图，B表示左心室射血分数统计图，C表示左心室短轴缩短率统计图，D表示E/A统计结果图，E～F表示左心室血流动力学检测结果统计图，Con表示对照组，DCM表示糖尿病组，DCM+ONX表示糖尿病+ONX0914组)。

图3为ONX0914对LMP7活性的影响(A表示各组小鼠中LMP7的表达量，B表示各组小鼠中LMP7蛋白表达量统计，Con表示对照组，DCM表示糖尿病组，DCM+ONX表示糖尿病+ONX0914组)。

图4为ONX0914对糖尿病小鼠心肌细胞的影响(A表示各组小鼠心脏组织HE染色图，B表示各组小鼠心脏组织WGA染色图，C表示HE染色心肌细胞相对横截面积统计图，D表示WGA染色心肌细胞相对大小统计图，Con表示对照组，DCM表示糖尿病组，DCM+ONX表示糖尿病+ONX0914组)。

图5为ONX0914对糖尿病小鼠心肌肥厚相关标志物的表达情况(A表示左心室组织蛋白免疫印迹图，B表示ANP表达量结果图，C表示BNP表达量结果图，D表示β-MHC表达量结果图，Con表示对照组，DCM表示糖尿病组，DCM+ONX表示糖尿病+ONX0914组)。

图6为ONX0914对糖尿病小鼠心脏纤维化的影响(A表示Masson染色法和天狼星红染色图，B表示天狼星红染色胶原纤维阳性区域统计结果图，C表示Masson染色胶原纤维阳性区域统计结果图，Con表示对照组，DCM表示糖尿病组，DCM+ONX表示糖尿病+ONX0914组)。

图7为ONX0914对糖尿病小鼠心脏纤维化相关蛋白表达情况(A表示蛋白免疫印迹检测左心室组织纤维化相关蛋白表达水平，B～D分别为胶原Ⅰ、胶原Ⅲ和TGF-β的表达情况)。

图8为ONX0914对糖尿病小鼠心脏组织中NLRP3信号通路活化的影响(A表示蛋白免疫印迹技术检测左心室组织NLRP3及下游效应分子cl-caspasel、IL-1β和IL18蛋白表达的影响，B～D表示NLRP3、cl-caspasel、IL-1β和IL18蛋白量统计分析结果，Con表示对照组，DCM表示糖尿病组，DCM+ONX表示糖尿病+ONX0914组)。

图9为高糖时间依赖性诱导LMP7表达(A表示不同时间点给予高糖刺激H9c2细胞后，LMP7的表达水平，B表示LMP7蛋白表达量)。

图10为ONX0914剂量依赖性诱导LMP7表达(A表示不同浓度ONX0914干预H9c2细胞后的LMP7蛋白表达水平，B表示LMP7蛋白表达量)。

图11为ONX0914预处理抑制高糖诱导的NLRP3炎症小体的活性(A表示ONX0914预处理H9c2细胞后，LMP7、NLRP3、cl-caspasel、IL-1β和IL18的蛋白表达水平，B～F高糖诱导后LMP7、NLRP3、cl-caspasel、IL18和IL-1β蛋白表达量，Con表示对照组，ONX表示ONX0914组，HG表示高糖组，HG+ONX表示高糖+ONX0914处理组)。

图12为细胞免疫荧光检测NLRP3的表达。

图13为ONX0914干预抑制高糖诱导的ROS生成。

图14为ONX0914对小鼠心脏组织内皮间充质的转化(A表示蛋白印迹法检测小鼠心脏组织内皮标志物蛋白表达水平，B～D分别表示αSMA、Vimentin、VE-cadherin的表达水平，Con表示对照组，DCM表示糖尿病组，DCM+ONX表示糖尿病+ONX0914组)。

图15为ONX0914干预抑制TGF-β诱导的内皮细胞间充质转化(A表示免疫荧光检测CD31、Vimentin和αSMA表达变化，B表示蛋白免疫印迹技术检测αSMA、Vimentin、VE-cadherin的表达水平，C～E表示αSMA、Vimentin、VE-cadherin的表达水平统计结果，Con表示对照组，ONX表示ONX0914组，TGF-β表示诱导组，TGF-β+ONX诱导后的治疗组)。

具体实施方式

本发明实施例中所述的雄性C57BL/6J购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

实施例中所有的数据实验数据以均值±标准误的方式表示，所有作图和统计分析使用GraphPadPrism8软件。两组之间的差异比较用Unpairedt-test检验，多组之间的差异用one-wayANOVA(单因素方差分析)来分析。P值小于0.05被认为有统计学差异。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

ONX0914对糖尿病小鼠心功能的影响

按照图1A的方法采用链脲佐菌素(STZ)来诱导I型糖尿病，STZ溶于0.05M无菌柠檬酸钠溶液中(pH4.5)，8周龄雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ(60mg/kg)，连续注射5天。注射STZ2周后，用ONETOUCHUItra血糖试纸检测小鼠尾静脉随机血糖水平，血糖水平超过300mg/dl(16.7mmol/L)的小鼠被认为是糖尿病鼠。对照组小鼠连续5天接受等量的0.05M无菌柠檬酸钠溶液腹腔注射。以后每周检测小鼠尾静脉血糖水平，以确保持续的高血糖。当血糖超过500mg/dl(27.7mmol/L)时，给予1～2U长效胰岛素(来得时)皮下注射，以避免过度高血糖引起严重并发症导致小鼠死亡。

实验分为以下三组：对照组、糖尿病组、糖尿病+ONX0914组。糖尿病+ONX0914组小鼠在接受STZ注射18周后给予ONX0914(10mg/kg)皮下注射，每2天注射一次，持续8周。ONX0914溶于10％β-环糊精溶液。对照组及糖尿病组小鼠接受等量10％β-环糊精溶液皮下注射。8周后，再次测量小鼠体重及血糖。血糖测量结果如图1B所示。对小鼠进行心脏超声和有创血流动力学检测，处死小鼠，颈动脉采血后，用PBS灌流，收集心脏，肝脏，主动脉等组织标本进行后续实验。小鼠左心室与体重的比值结果图如图1C所示。

心脏超声的检测方法为：使用VeVo700超声诊断仪(VisualSonics,Toronto,Canada)检测小鼠心脏收缩和舒张功能。在检测前，先用棉签蘸取适量脱毛膏，对小鼠心前区进行脱毛，麻醉小鼠(1％异氟烷)，使心率控制在500～600bmp。然后固定小鼠于恒温板上，将高频超声探头置于小鼠心前区，采集左心室长轴与短轴信号并记录小鼠心率及呼吸频率。利用图像分析软件对采集的图像进行分析并计算出以下指标:心率(HR)、左心室射血分数(LVEF)、E峰与A峰比值(E/A)、左心室短轴缩短率(LVFS)、收缩期左心室内径(LVID，d)、舒张期左心室内径(LVID,s)等。具体结果如图2所示。

血流动力学检测方法为：使用Millarpressurevolumesystem(MPVS系统)检测设备对小鼠血流动力学各项指标进行检测，具体实验步骤如下：

麻醉并固定小鼠:采用1％戊巴比妥钠麻醉小鼠(50mg/kg)，使其心率控制在500～600bmp，胶带固定小鼠头部及四肢，使其仰卧位固定于泡沫板上。分离颈总动脉：小鼠颈总动脉位于气管两侧。首先用对小鼠颈部皮肤进行消毒，沿颈正中线纵行剪开皮肤2cm，暴露气管，用显微镊游离右颈总动脉1cm。

Millar导管插管:用丝线结扎右颈总动脉远心端，近心端放置动脉夹夹闭。显微镜直视下，在右颈总动脉远心端剪V字形切口，用胰岛素针轻轻挑起缺口，顺势快速将接有电极的P-V微导管朝近心端方向插入右颈总动脉内。

数据获取:释放动脉夹，缓慢将导丝沿颈动脉向前推进，同时打开labchart8.0软件，观察桌面波形图，当出现高大的正弦波时，表明导丝已进入到左心室，用胶带固定导丝。待图形稳定后，记录一段20min的较为稳定的血流动力学参数图。具体结果如图2所示。

数据分析:获取数据后，退出导丝。用labchart8.0软件分析以下血流动力学参数:心率(HR)、左心室收缩末期压力(LVPES)、左心室舒张末期压力(LVPED)、左室压力上升最大速率(dp/dt

图1显示，糖尿病小鼠尾静脉血糖值明显高于对照组，糖尿病+ONX0914组小鼠的血糖值也高于对照组。可见ONX0914不能减低糖尿病小鼠的血糖值，但是通过心脏和体重的比值结果可以看出，ONX0914可以降低糖尿病小鼠心脏与体重的比值。

图2，超声结果显示，糖尿病+ONX0914组小鼠E/A值比值升高，表明ONX0914治疗后糖尿病小鼠心脏舒张功能得到改善。同时糖尿病+ONX0914组小鼠LVEF及LVFS也明显高于糖尿病组，提示心脏收缩功能也得到了改善(图2A～C、n＝8、p<0.05)。血流动力学检查进一步验证了ONX0914对糖尿病小鼠心功能的保护作用，与糖尿病组相比，ONX0914治疗显著升高了dp/dt

上述结果表明，ONX0914治疗能够明显改善糖尿病小鼠心脏收缩功能。

实施例2

ONX0914抑制LMP7的活性

将左心室组织从-80℃冰箱取出，称重，用液氮预冷研钵，放入组织，用研磨将组织研磨成粉末状，边研磨边加液氮。转移到预冷的1.5mLEP管中，将RIPA裂解液按每10mg组织加100uL的比例加入到EP管中，冰上裂解30min，每5min涡旋振荡一次，以充分裂解组织。将EP管放入离心机中，4℃，12000g，离心15min，将上清转移到新的EP管中，即为组织蛋白。将含组织蛋白的上清分装后冻存在-80℃冰箱中，以备后续检测。

采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，实验步骤如下：

BCA工作液配制:按A液:B液等于50:1的方法配制，工作液现用现配。

标准品配制:按照表1加入相应试剂，梯度稀释标准品。

表1标准品的稀释

将工作液与蛋白标准品或待测样品按95:5的体积比加入酶标条。

封板，37℃恒温箱孵育25min。将酶标条放入酶标仪中，检测562nm时吸光度，计算样品蛋白浓度。用RIPA裂解液将待测样品稀释到同一浓度，加入5×SDS上样缓冲液，使蛋白终浓度定为2μg/uL，震荡混匀后，沸水煮5min，分装后冻存于-80℃冰箱。

蛋白免疫印迹法：

制胶:玻璃板清洗干净后，放入烤箱中晾干。将玻璃板夹紧于做胶架上，先按表2依次加入分离胶试剂(8块胶的量)，混匀后靠边较快加入玻璃板夹层中，缓慢加入去离子水压线。等待30min，分离胶和水之间形成一条明显的界线，表明分离胶已凝固。

表2分离胶的制备

倒去去离子水，用吸水纸吸干。按表3的配制浓缩胶(8块胶的量)，混匀后加入玻璃板中间，插入梳子，等待浓缩胶凝固。

表3分离胶的制备

上样:将凝固后的胶固定在电泳槽上，倒入电泳缓冲液，没过玻璃板上缘，检查不漏水后，开始上样。上样前将蛋白振荡混匀，小心垂直向上拔去梳子，按预先设计好的顺序依次加入待测蛋白样品(20μg)和蛋白marker。

电泳:采用恒压方法电泳，先70V恒压电泳，待蛋白maker分开后，调整电压至110V，直到电泳结束。

转膜:恒流方式湿转，将提前裁好的PVDF膜浸入甲醇中，配制1×转膜缓冲液，倒入转膜槽内。采用三明治夹心法将海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵依次叠好，放入转膜槽内。200mA恒流转膜。

封闭:用TBST洗PVDF膜三次，每次2min，然后加5％BSA室温摇床封闭lh。

一抗孵育:封闭结束后，回收5％BSA，加入相应一抗，4℃摇床孵育过夜。

一抗洗涤:一抗孵育结束后，回收一抗，TBST洗6次，每次10min。

二抗孵育:加入相应二抗，室温摇床孵育lh。

二抗洗涤:倒掉二抗孵育液，TBST洗6次，每次5min。

曝光:将PVDF膜浸泡在ECL发光液中，曝光机曝光，拍照保存。LMP7蛋白在不同小鼠组织中的活性以及表达情况如图3所示。

图3显示，糖尿病+ONX0914组小鼠心组织中LMP7蛋白条带上移。说明ONX0914显著抑制糖尿病小鼠心脏组织LMP7的活性。

实施例3

ONX0914对糖尿病小鼠心肌肥厚及纤维化的影响

利用HE染色法和WGA染色法对各组小鼠左心室心脏组织进行染色，制片，观察ONX0914对糖尿病小鼠心脏肌纤维化程度。结果如图4所示。利用实施例2所述的蛋白检测方法检测糖尿病小鼠心脏组织心肌肥厚标志物ANP、BNP和β-MHC的表达量。结果如图5所示。

利用Masson染色法以及天狼星红(SiriusRed)染色法对各组小鼠左心室心脏组织进行染色切片，观察ONX0914对糖尿病小鼠心肌间质纤维化程度的影响。结果如图6所示。利用实施例2的蛋白检测方法检测心脏胶原Ⅰ、心脏胶原Ⅲ以及促纤维化因子TGF-β的表达情况，结果如图7所示。

图4～5显示，糖尿病组小鼠心脏肌纤维排列紊乱，细胞失去正常形态，细胞体积明显增大，而糖尿病+ONX0914组小鼠心脏肌纤维能够维持细胞的正常形态。蛋白免疫印迹检测表明，与对照组相比，糖尿病小鼠心脏组织心肌肥厚的标志物ANP、BNP和β-MHC表达量明显升高，给予ONX0914治疗后，这些标志物蛋白表达水平均有所下降。

图6～7显示，与对照组小鼠相比，糖尿病小鼠心肌间质纤维化程度明显增加，大量胶原纤维沉积，ONX0914处理则抑制了糖尿病小鼠心脏纤维化改变。蛋白免疫印迹检测表明，糖尿病小鼠心脏胶原I、胶原Ⅲ含量及促纤维化因子TGF-β表达量均高于对照组，ONX0914处理下调了这些纤维化相关蛋白的表达。

HE染色法：

烤片:将石蜡切片放于55℃烤箱30min融蜡。

脱蜡及水化:将上一步组织切片按表4中所述的顺序依次浸泡在相应试剂中:

表4 HE染色脱蜡及水化加入试剂的顺序

苏木素染核5min，自来水洗三次，每次2min。0.3％HCL+70％酒精溶液分色8s，自来水洗三次，每次2min。伊红染液浸泡切片5min，自来水洗三次，每次2min。

将上一步组织切片按照与步骤二相反的顺序依次浸泡在相应试剂中，最后用封片剂封片。在通风橱里晾干，观察并拍照。

WGA染色法：

烤片及脱蜡至水化步骤同HE染色。

将上一步中的切片用PBS在水平摇床上洗三次，每次2min。

用组化笔在组织周围画圈，将切片放到暗湿盒里，向组织上滴加WGA染液，使其完全没过组织。37℃恒温箱避光孵育1h，PBS洗三次，每次5min。

抗淬灭剂封片，观察拍照并保存。

Masson染色法：

石蜡切片烤片及脱蜡至水化步骤同HE染色。

向组织上滴加Weigert铁苏木素染色液室温孵育8min，流水冲洗。

盐酸酒精分化，流水冲洗。

Masson蓝化液反蓝4min，流水冲洗。

滴加丽春红品红染色液染液染色7min。

用2％冰醋酸水溶液洗涤切片1min。

1％磷钼酸溶液洗3min。

倾去磷钼酸，苯胺蓝复染。

倾去苯胺蓝染液，用2％冰醋酸水溶液洗涤切片，直到无蓝色脱出。

脱水后用中性树脂封片，拍照保存。

天狼星红染色法：

石蜡切片烤片及脱蜡至水化步骤同HE染色。

组化笔在组织周围画圈，滴加天狼星红染液完全覆盖组织，室温孵育1h。

自来水洗5min，去掉组织表面染液。

脱水后用中性树脂封片，拍照保存。

实施例4

ONX0914对糖尿病小鼠心脏组织NLRP3信号通路的活化

对各组小鼠左心室组织按照实施例2的蛋白免疫印迹法进行检测，结果如图8所示。

图8显示，NLRP3在糖尿病小鼠心脏组织中高表达，ONX0914皮下注射后，NLRP3蛋白含量明显降低。与对照组相比，糖尿病组小鼠NLRP3下游效应分子cl-caspasel、IL-1β和IL18表达显著升高，而ONX0914能够阻断这一效应。

实施例5

ONX0914干预改善高糖诱导的心肌细胞炎症和氧化应激

为了进一步验证ONX0914对NLRP3炎症小体活化的影响，利用高糖干预H9c2细胞模拟糖尿病心肌病细胞模型，利用实施例2的蛋白免疫印迹法检测LMP7的活性。结果如图9所示。

H9c2购自购买于ATCC(CRL-1446)。

高糖干预的方法：将购买的H9c2细胞用含10％FBS的低糖DMEM培养基培养。当细胞密度达到90％以上时，对细胞进行传代。移去培养基，并用PBS冲洗，接着加入胰酶消化，显微镜下观察到细胞形态改变后，立即移去胰酶，加入相应培养基吹打。1000g，离心5min后，移去上清，加入完全培养基传代，使细胞密度控制在35％。

待H9c2细胞密度达到70％时，对细胞进行饥饿处理(无血清低糖DMEM培养基)12h，细胞饥饿处理后，更换为完全培养基，然后加入高糖(25mmol/L)干预24h，其中ONX0914(100nmol/L)在高糖刺激前1h加入。

图9显示，高糖可以时间依赖性地诱导LMP7表达。

接着在细胞上验证了不同加量的ONX0914对高糖诱导的H9c2细胞的LMP7活性的影响。结果如图10所示。

图10显示，ONX0914可以剂量依赖地抑制高糖对LMP7的诱导作用。

接下来，先用ONX0914(100nM)预处理H9c2细胞1h，然后再加高糖干预24h。实施例2的蛋白免疫印迹法检测ONX0914对LMP7、NLRP3炎症小体、cl-caspasel、IL-1β和IL18活性的影响，结果如图11所示。细胞免疫荧光检测高糖诱导NLRP3炎症小体的表达情况，结果如图12所示。

图11显示，ONX0914能够明显抑制LMP7活性。高糖促进H9c2细胞表达NLRP3炎症小体，同时cl-caspasel、IL-1β和IL18也相应的升高，这表明高糖干预可以促进H9c2细胞NLRP3炎症小体的活化，而ONX0914可以阻断高糖对NLRP3炎症小体的活化，抑制成熟的炎症因子IL-1β和IL18的生成。

图12显示，高糖可以诱导NLRP3炎症小体的表达，而ONX0914可以阻断高糖的这一效应。

细胞免疫荧光检测方法：

吸去培养基，PBS洗三次，每次2min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗三次，每次2min。0.5％Triton-X破膜15min。PBS洗三次，每次2min。10％山羊血清室温封闭1h。加入相应一抗4℃孵育过夜。PBS洗三次，每次5min。加入相应二抗和DAPI染液室温孵育过夜lh。PBS洗三次，每次5min。荧光显微镜观察并拍照保存。

由于炎症与氧化应激之间存在错综复杂的关系，炎症可以引起氧化应激，反之亦然。因此我们进一步研究了ONX0914能否改善高糖引起的氧化应激，利用DHE染色来进行检测。结果如图13所示。

图13显示，高糖能够增加心肌细胞ROS的生成，而ONX0914预处理后能够减少ROS的生成。

DHE染色法：吸去培养基，PBS洗三次，每次2min。加入含超氧化物阴离子荧光探针(1μM)的无血清培养基，37℃恒温箱中孵育30min。无血清培养基洗三次，每次2min。荧光显微镜观察并拍照保存。

实施例6

ONX0914治疗抑制内皮间充质转化

在心肌纤维化进程中，肌成纤维细胞扮演着关键作用，其分泌大量的ECM蛋白，促使心脏纤维化，而内皮细胞则是高血糖的直接靶细胞，内皮间充质转化(EndoMT)形成大量的肌成纤维细胞，推动纤维化进展。

利用实施例2的蛋白免疫印迹检测法对各组小鼠心脏组织进行蛋白免疫检验，检验各组小鼠心脏组织中心脏内皮标志物(VE-cadherin)和间质标志物(Vimentin、αSMA)的表达情况。结果如图14所示。

图14显示，与对照相比，糖尿病小鼠心脏内皮标志物(VE-cadherin)表达显著降低，而间质标志物(Vimentin、aSMA)表达则明显增多。

为了在细胞层面上验证ONX0914对内皮间充质转化的作用，我们使用TGF-β来诱导内皮间充质转化。利用实施例5的细胞免疫荧光法检测ONX0914对内皮间充质转化的影响。结果如图15所示。利用实施例2的蛋白免疫印迹法在细胞层面检测ONX0914对间质标志物和内皮标志物表达的影响。结果如图15所示。

图15细胞免疫荧光结果显示，ONX0914预处理能够抑制TGF-β诱导的内皮间充质转化。对细胞进行蛋白免疫印迹同样发现，TGF-β可以促进间质标志物的表达(Vimentin、aSMA)，抑制内皮标志物的表达(VE-cadherin)，ONX0914能够阻断TGF-β的这一效应。因此，ONX0914可以通过抑制EndoMT来改善心脏纤维化。

由以上实施例可知，本发明提供一种免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914在制备治疗糖尿病心肌病的药物中的应用。本发明的免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914通过抑制LMP7亚基，改善糖尿病小鼠心脏收缩和舒张功能，抑制心肌肥厚及降低心肌间质纤维化。与糖尿病组小鼠相比，ONX0914治疗组小鼠心脏组织中NLRP3炎症小体表达量明显降低，其下游相关cl-caspasel、IL-1β和IL-18表达也同步降低。此外，内皮标志物(CD31、VE-cadherin)表达显著升高，而间质标志物(Vimentin、aSMA)则明显降低。体外实验也进一步发现ONX0914不仅可以抑制H9c2细胞NLRP3炎症小体信号通路活化，即可以抑制心肌炎；而且也可以显著抑制TGF-β诱导的HUVEC细胞间质标志物(Vimentin、aSMA)表达并同时促进内皮标志物(CD31、VE-cadherin)的表达，即可以抑制心肌纤维化。因此本发明的免疫蛋白酶体抑制剂ONX0914有望制备成治疗糖尿病心肌病的药物中，为糖尿病心肌病新药物的开发提供依据。同时还为糖尿病心肌病的寻找新的靶位点提供了依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。