一种基于核酸序列检测的浓香型白酒窖泥功能微生物的筛选方法

摘要

本发明提供了一种基于核酸序列检测的浓香型白酒窖泥功能微生物的筛选方法，包括以下步骤：根据浓香型白酒生产用窖泥的感官品质、理化性质及所产浓香型白酒的感官优劣，确定优质窖泥和劣质窖泥后，提取窖泥中的微生物总DNA，用通用引物进行扩增、建库、高通量测序后，进行OTU聚类获得每个OTU的物种信息，再通过差异倍数Log2FC和P‑值计算优质窖泥和劣质窖泥之间的物种生物量差异大小，确定功能微生物，然后通过预测的最佳筛选培养基结合PCR分析快速筛选出功能微生物。本发明方法能有效避免功能微生物筛选过程中的不确定性和假阳性，可快速筛选出窖泥中的功能微生物，减小筛选过程的工作量，在筛选不同地区浓香型白酒窖泥的功能微生物中具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物分离技术领域，特别是涉及一种基于核酸序列检测的浓香型白酒窖泥功能微生物的筛选方法。

背景技术

在浓香型白酒酿造过程中，窖泥微生物对其风味品质有重要影响。但是，不同的环境因子会导致窖泥微生物群落结构的显著变化，加之窖泥中复杂的微生物群落结构使其中功能微生物的确定和筛选都存在很大的困难。

现有的窖泥微生物筛选技术普遍存在以下缺陷和不足：

1.窖泥中的功能微生物难以确定，筛选具有盲目性。窖泥微生物群落结构极其复杂，目前仍未全部探明，其中并非所有微生物都是都对浓香型白酒的风味品质有积极作用，因此传统的微生物筛选方法在无法确定微生物功能的前提下进行筛选，具有很大的盲目性。

2.筛选过程费时、费力，具有很大的不确定性。由于窖泥微生物群落结构非常复杂，以通用的微生物筛选方法进行窖泥功能微生物的筛选具有很大的随机性和不确定性，并且分离过程需反复进行，非常耗时和费力。

3.以通用培养基和培养条件进行筛选，筛选目标难以实现。目前的微生物筛选技术大多根据某类微生物的性质或功能，以通用的培养基和培养条件进行筛选，很少针对某种特定的窖泥微生物选择专门的培养基和培养条件进行筛选，由于多数窖泥微生物在实验室条件下培养难度较大，导致采用通用培养基筛选时可能难以实现预期的筛选目标。

鉴于上述缺陷和不足，亟需建立一种能够快速确定浓香型白酒窖泥中的功能微生物的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速确定并筛选浓香型白酒窖泥功能微生物的方法，该方法方便快捷、综合成本低，能够克服现有技术中存在的假阳性、筛选盲目性、随机性、操作繁琐等问题，适于推广应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

提供了一种基于核酸序列检测的浓香型白酒窖泥功能微生物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)根据同一浓香型白酒生产企业不同窖池窖泥的形态、理化指标或下层糟所产的白酒感官品质优劣，确定优质窖泥和劣质窖泥；

(2)提取优质窖泥、劣质窖泥的微生物总DNA后，用通用引物扩增其中的原核微生物16S rRNA基因片段，并将纯化后的扩增产物进行建库、高通量测序；

(3)对下机序列进行质控、拼接，按照97％的相似度进行OTU聚类，去除丰度值低于全体样本测序总量0.001％的OTU聚类，将各个OTU的代表序列与Greengenes数据库的模板序列进行比对，获得每个OTU的物种信息；

(4)通过差异倍数Log2FC值和P-值计算优质窖泥、劣质窖泥之间的物种生物量差异大小，对比分析确定功能微生物；

(5)根据功能微生物的OTU序列在NCBI上比对，获取完整的16S rRNA序列，并根据16S rRNA序列预测该功能微生物的最佳筛选培养基，通过所述培养基筛选出功能微生物，并进行菌落PCR验证筛选结果，最后通过16s rRNA基因测序排除假阳性。

进一步地，步骤(2)中所述高通量测序的方法为：选择通用引物扩增细菌的16SrRNA V3-V4区，建库后使用高通量测序平台进行高通量测序。在本发明的具体实施方式中，采用IlluminaMiseq PE300高通量测序平台进行高通量测序。

进一步地，步骤(4)中Log2FC＞1且P＜0.05被认定为显著性差异，功能微生物为具有显著性差异的物种。

所述菌落PCR引物序列根据功能微生物的16S rRNA序列进行设计，在本发明的具体实施方式中，步骤(5)中，菌落PCR引物序列为：

F：5’-ACCTTATTAGAAAGCCACG-3’,

R：5’-GCACTCAAGTCTCCCAGTT-3’。

本发明PCR程序根据引物的长短、GC含量等情况进行适应性设置。

进一步地，用KOMODO中的GRPWREC工具，预测功能微生物的最佳筛选培养基。

进一步地，步骤(5)中，培养基筛选功能微生物的方法为：将优质窖泥在液体筛选培养基上富集，收集富集培养液，将培养液涂布于固体筛选培养基上，再培养得到具有细菌菌落特征的单菌落。

进一步地，采用液体培养基的培养条件为：20～50℃富集1～14天；进一步地，采用液体培养基的培养条件为：37℃厌氧富集10天；

采用固体培养基的培养条件为：20～50℃培养1～14天。

进一步地，采用固体培养基的培养条件为：37℃厌氧培养7天。

本发明还提供了一种前述筛选方法在筛选浓香型白酒窖泥功能微生物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明方法能够快速确定浓香型白酒窖泥中的功能微生物，解决了传统技术筛选窖泥功能微生物时存在的盲目性、假阳性、随机性、操作繁琐等问题，提高了筛选效率，节省了大量成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

实施例中使用的试剂若无特殊说明，均可以通过市售得到。

实施例1

(1)根据同一浓香型白酒生产企业不同窖池窖泥的形态、理化指标或下层糟所产的白酒感官品质优劣，确定优质窖泥和劣质窖泥。

(2)优质窖泥和劣质窖泥都分别取自于其相应的窖池底部，每个窖池在窖池底部的四角和中心共五点取窖底泥各100g，取出的窖泥迅速混合均匀，混匀后取大约20g装入15mL的无菌无酶离心管后迅速放入-80℃保存，用于提总DNA，另取约200g于4℃保存，用于筛选功能微生物。

(3)优质窖泥和劣质窖泥分别用FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒(Mpbio，美国)提取窖泥微生物总DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的完整性，用NanoDrop2000超微量分光光度计进行进行总DNA的纯度和浓度检测。

(4)以提取的总DNA为模板，以通用引物

338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，

806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’

扩增细菌的16S rRNA V3-V4区，扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒(Axygen,美国)纯化扩增产物。纯化后的扩增产物用微型荧光计定量，按照测序量要求用

(5)对下机序列进行质控、拼接，按照97％的相似度进行OTU聚类，去除丰度值低于全体样本测序总量0.001％的OTU。将各个OTU的代表序列与Greengenes数据库的模板序列进行比对，获得每个OTU的物种信息。

(6)通过差异倍数(Log2FCs)和P-值来计算优质窖泥和劣质窖泥之间的物种生物量差异大小，Log2FC＞1且P＜0.05被认定为显著性差异，Log2FC越大，差异越显著。

(7)经对比分析，得出微生物Rummeliibacillussuwonensis是一个显著差异物种，其在优质窖泥中的生物量远大于劣质窖泥，可确定为功能微生物。将功能微生物Rummeliibacillussuwonensis的OTU序列在NCBI上比对，获取完整的16S rRNA序列。

(8)根据Rummeliibacillussuwonensis的16S rRNA序列信息，用Primer premier设计特异性扩增引物，引物RSF：5’-ACCTTATTAGAAAGCCACG-3’，RSR：5’-GCACTCAAGTCTCCCAGTT-3’；扩增程序为：98℃2min；98℃10s,55℃15s,72℃30s,循环33次；72℃5min。

(9)根据Rummeliibacillussuwonensis的16S rRNA序列信息，用KOMODO中的GRPWREC工具，预测Rummeliibacillussuwonensis的最佳筛选培养基，得到最佳筛选培养基为DSMZ_898。

(10)按照筛选培养基DSMZ_898的配方，配制液体培养基1L用于富集窖泥微生物，配制固体培养基1L并倒入培养皿制作出固体平板培养基用于筛选功能微生物。

(11)称取优质窖泥1g，迅速放入装有15mL液体DSMZ_898培养基的厌氧培养管，快速密封后在37℃厌氧富集10天。

(12)用注射器刺穿厌氧培养管密封胶垫，从中吸取0.5mL富集培养液，在超净工作台中的酒精灯火焰旁，快速涂布于DSMZ_898固体培养基平板上。将涂布后的平板置于厌氧培养盒中，培养盒内放置厌氧产气袋并密封培养盒以保证培养盒内的厌氧状态，37℃培养7天至长出菌落。

(13)随机挑取平板上生长的具有细菌菌落特征的单菌落，溶于10μL无菌脱氧的双蒸水中，取2μL菌液作为PCR扩增模板，用RSF/RSR引物进行菌落PCR。PCR产物用浓度1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测条带位置是否正确。余下的8μL菌液转入2mL液体DSMZ_898培养基，在厌氧培养袋中37℃培养120h。

(14)菌落PCR验证扩增条带位置正确的菌落，经培养后进行16s rRNA基因测序，测序结果结果在NCBI数据库中进行同源序列比对，根据比对结果确定筛选到的菌株为Rummeliibacillussuwonensis(简称RS)。

(15)筛选到的Rummeliibacillussuwonensis(简称RS)，以5％的接种量接种到浓香型白酒酒醅中，以未接种的酒醅为参照样(CK)。经35天的发酵试验，分析其中的主要风味物质含量差异(见表1)。

表1接种Rummeliibacillussuwonensis发酵35天后的主要风味物质变化

可以看到，经接种RS发酵后除乳酸乙酯含量相较于参照样下降了14.39％以外，其它风味物质的含量都明显增加，分别增加了14.32％～80.87％。可见，本发明方法筛选得到的RS有利于浓香型白酒主要风味物质的形成。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。