PLOD3与LRRN3作为联合标志物在早期诊断帕金森病的应用

摘要

本发明属于生物检测技术领域，涉及PLOD3与LRRN3作为联合标志物在早期诊断帕金森病的应用。本发明研究发现以PLOD3与LRRN3作为联合标志物能够对人群中帕金森病进行早期筛查和诊断，相比于传统依赖帕金森病典型临床表现的诊断方法，本发明具有早期诊断和明确帕金森病的发病和进展的优势，对于早期进行疾病的随访、管理、干预，从而延缓帕金森病的进展具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及PLOD3与LRRN3作为联合标志物在早期诊断帕金森病的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

据发明人研究了解，目前帕金森病的诊断方法在很大程度上依赖于疾病晚期典型的临床表现，例如静止性震颤、运动迟缓、肌强直等。而有研究表明，早期诊断和干预可以减缓帕金森病的进展过程。液体活检技术作为一项分子诊断技术，具有检测样本易提取，无创性或微创性，成本低，风险小等优势，目前已在肿瘤，微生物感染等领域得到了广泛应用。然而对于帕金森病的诊断，尤其是具有非典型症状的散发性帕金森病的诊断方面，目前仍然没有客观的生物标志物来用于帕金森病的早期筛查。因此，迫切需要鉴定和验证可靠的生物标志物来进行帕金森病的辅助诊断，这对于帕金森病的管理和早期干预非常重要。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供PLOD3与LRRN3作为联合标志物在早期诊断帕金森病的应用，以PLOD3与LRRN3作为联合标志物能够对人群中帕金森病进行早期筛查和诊断，相比于传统依赖帕金森病典型临床表现的诊断方法，本发明具有早期诊断和明确帕金森病的发病和进展的优势，对于早期进行疾病的随访、管理、干预，从而延缓帕金森病的进展具有重要意义。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种用于早期诊断帕金森病的生物标志物组，由PLOD3编码基因或PLOD3编码基因的表达产物以及LRRN3编码基因或LRRN3编码基因的表达产物组成。

另一方面，一种检测PLOD3表达水平和LRRN3表达水平的试剂在制备早期诊断帕金森病的诊断试剂中的应用。

进一步地，检测PLOD3表达水平的样品对象为外周血。

检测PLOD3表达水平可以通过PLOD3表达产物与PLOD3表达产物的抗体结合的方式进行，也可以通过RT-qPCR的方式进行，还可以通过其他方式进行。进一步地，检测PLOD3水平的方式为RT-qPCR。

更进一步地，RT-qPCR检测PLOD3表达水平的试剂包括总RNA抽提试剂。所述总RNA抽提试剂例如TRIzol试剂。

更进一步地，RT-qPCR检测PLOD3表达水平的试剂包括TaqMan逆转录试剂盒。用于对PLOD3编码基因的cDNA进行逆转录。

更进一步地，RT-qPCR检测PLOD3表达水平的试剂包括M-MLV逆转录酶。用于对PLOD3编码基因的cDNA进行逆转录以检测mRNA。

更进一步地，RT-qPCR检测PLOD3表达水平的试剂包括PLOD3的正向引物和PLOD3的反向引物。PLOD3的正向引物如SEQ ID NO.1所示。PLOD3的反向引物如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，检测LRRN3表达水平的样品对象为外周血。

检测LRRN3表达水平可以通过LRRN3表达产物与LRRN3表达产物的抗体结合的方式进行，也可以通过RT-qPCR的方式进行，还可以通过其他方式进行。进一步地，检测LRRN3表达水平的方式为RT-qPCR。

更进一步地，RT-qPCR检测LRRN3表达水平的试剂包括总RNA抽提试剂。所述总RNA抽提试剂例如TRIzol试剂。

更进一步地，RT-qPCR检测LRRN3表达水平的试剂包括TaqMan逆转录试剂盒。用于对LRRN3编码基因的cDNA进行逆转录。

更进一步地，RT-qPCR检测LRRN3表达水平的试剂包括M-MLV逆转录酶。用于对LRRN3编码基因的cDNA进行逆转录以检测mRNA。

更进一步地，RT-qPCR检测LRRN3表达水平的试剂包括LRRN3的正向引物和LRRN3的反向引物。LRRN3的正向引物如SEQ ID NO.1所示。LRRN3的反向引物如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，一种用于检测早期诊断帕金森病的产品，包括检测PLOD3表达水平和LRRN3表达水平的试剂。

本发明所述的产品可以为试剂盒。

进一步地，检测PLOD3表达水平的试剂为RT-qPCR检测PLOD3表达水平的试剂。

更进一步地，RT-qPCR检测PLOD3表达水平的试剂包括总RNA抽提试剂。所述总RNA抽提试剂例如TRIzol试剂。

更进一步地，RT-qPCR检测PLOD3表达水平的试剂包括TaqMan逆转录试剂盒。用于对PLOD3编码基因的cDNA进行逆转录。

更进一步地，RT-qPCR检测PLOD3表达水平的试剂包括M-MLV逆转录酶。用于对PLOD3表达编码基因的cDNA进行逆转录以检测mRNA。

更进一步地，RT-qPCR检测PLOD3表达水平的试剂包括PLOD3的正向引物和PLOD3的反向引物。PLOD3的正向引物如SEQ ID NO.1所示。PLOD3的反向引物如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，检测LRRN3表达水平的试剂为RT-qPCR检测LRRN3表达水平的试剂。

更进一步地，RT-qPCR检测LRRN3表达水平的试剂包括总RNA抽提试剂。所述总RNA抽提试剂例如TRIzol试剂。

更进一步地，RT-qPCR检测LRRN3表达水平的试剂包括TaqMan逆转录试剂盒。用于对LRRN3编码基因的cDNA进行逆转录。

更进一步地，RT-qPCR检测LRRN3表达水平的试剂包括M-MLV逆转录酶。用于对LRRN3编码基因的cDNA进行逆转录以检测mRNA。

更进一步地，RT-qPCR检测LRRN3表达水平的试剂包括LRRN3的正向引物和LRRN3的反向引物。LRRN3的正向引物如SEQ ID NO.1所示。LRRN3的反向引物如SEQ ID NO.2所示。

本发明的有益效果为：

本发明通过qPCR验证PLOD3在帕金森病人外周血液中高表达，而LRRN3在帕金森病人外周血液中低表达。利用受试者工作曲线(ROC)和矫正曲线(Calibration curve)评估两基因预测PD的准确性及稳定性，同时结合PLOD3和LRRN3和年龄因素构建Nomogram模型，证实PLOD3和LRRN3作为PD生物标志物的可行性。

本发明相比于传统的通过典型临床表现来诊断帕金森病的方法，通过微创性采集病人血液样本，进行离心等操作后提取循环中的RNA进行检测分析PLOD3和LRRN3的表达情况，更适合应用于人群中帕金森病的筛查和帕金森病的辅助诊断。具有微创性，易操作性，便于早期辅助诊断，和早期对帕金森病进行随访、干预，以延缓帕金森病进展的优势。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中用9个关键基因构建帕金森病危险评分模型筛选出PLOD3和LRRN3过程的结果图：A对在帕金森病人脑黑质组织和外周血清中都比对照组上调或下调的生物标志物基因集(58个基因)进行lasso回归分析，变量在不同lamada值下的纳入情况；B对lasso回归交叉验证用以确定最佳的lamada值，从而确定纳入变量为9个关键基因；C在训练集中比较PD组与对照组中风险评分；D在验证集中比较PD组与对照组中风险评分；E在训练集中计算Calibration曲线和AUC值；F在验证集中计算Calibration曲线和AUC值；G在合并人脑黑质组织数据集中对照组和帕金森病组PLOD3的表达情况；H在合并人脑黑质组织数据集中对照组和帕金森病组LRRN3的表达情况；I在GSE99039数据集中对照组和帕金森病组PLOD3的表达情况；J在GSE99039数据集中对照组和帕金森病组LRRN3的表达情况；K在GSE49036数据集中PLOD3随帕金森病Braak分期的表达情况；L在GSE49036数据集中LRRN3随金森Braak分期的表达情况。

图2为本发明实施例中验证PLOD3和LRRN3联合作为帕金森病生物标志物的表征结果图：A为PLOD3在PD组与对照组病人血清中的表达情况；B为PLOD3高低表达组患者人数分别在PD组和对照组的占比情况；C为LRRN3在PD组与对照组病人血清中的表达情况；D为LRRN3高低表达组患者人数分别在PD组和对照组的占比情况；E为PLOD3与LRRN3对区分PD和对照组的ROC曲线；F为PLOD3与LRRN3对区分PD和对照组的校准曲线；G为综合PLOD3、LRRN3表达以及年龄因素来区分PD和对照组的列线图；H为基于列线图所构建出的风险评分在PD组和对照组中的差异。

具体实施方式

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例

1.从GEO数据库下载帕金森病人脑黑质组织测序数据(GSE20141,GSE20163,GSE20164,GSE20292,GSE24378和GSE7621),并利用R语言的“combat”进行数据合并，去除批次效应。利用“limma”包进行差异分析，设置p值小于0.01。筛选出与正常对照组相比，在帕金森病人脑黑质组织中明显差异的RNA。

2.从GEO数据库获取GSE49036数据，其中包含帕金森病人的Braak分期的临床数据，可以评估帕金森病人病情的进展情况。基于GSE49036数据，对#1中所获得的差异基因进行加权基因共表达网络分析(Weighted GeneCo-expression Network Analysis，WGCNA)来识别与Braak分期相关的生物标志物。

3.从GEO数据库中获取GSE99039数据，该数据包含帕金森病人与正常对照组外周血清的RNA测序数据。利用“limma”包进行差异分析，设置p值小于0.01，筛选差异基因。

4.将#2中获得的“Braak分期相关的生物标志物”与#3中的差异基因取交集，并对交集基因进行分析，筛选出在帕金森病人脑黑质组织和外周血清中都比对照组上调或下调的生物标志物基因集(58个基因)。

5.将GSE99039随机按照7：3的比例分成训练集和验证集。利用“glmnet”包对训练集进行最小绝对收缩和选择算子回归(least absolute shrinkage andselectionoperator regression，LASSO)分析，选取最佳的λ值构建帕金森病相关基因集，并对58个生物标志物基因集中的9个关键基因(ABHD2,BASP1,CTBP2,GCM1,GMPR2,GPX3,LRRN3,PLOD3,RBM38)进一步行逻辑回归，构建帕金森病危险评分模型。

6.将帕金森病相关基因集和危险评分模型应用于训练集和验证集，进而利用受试者工作曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)和矫正曲线(Calibrationcurve)来评估预测模型的准确性及稳定性。

7.对基因集中9个关键基因进一步分析，筛选出PLOD3(原胶原-赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶3)和LRRN3(富亮氨酸重复神经元3)与帕金森Braak分期具有明显的相关性。利用单样本基因功能富集分析(ssGSEA)分别分析两基因与组织免疫细胞浸润的关系。

8.从GEO数据库获取GSE184950数据，该数据为人脑黑质组织的单细胞测序数据，利用“Seraut”包对该数据进行分析，利用“UMAP”功能对单细胞进行分群，通过经典细胞亚群标志物的表达情况对聚类结果进行细胞亚群注释。分别分析PLOD3和LRRN3的细胞亚群表达情况。

9.从山东大学齐鲁医院神经外科获得帕金森病人与正常对照组外周血液样本，4℃进行静止2小时后，对血液样本进行离心(1000转/分钟，10分钟)，收集血清成分。利用使用TRIzol试剂(Invitrogen)根据制造商的协议从细胞中分离出总RNA。使用TaqMan逆转录试剂盒(Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)对用于检测的cDNA进行逆转录。利用M-MLV逆转录酶(BioTeke，北京，中国)对cDNA进行逆转录以检测mRNA。RT-qPCR采用PowerSYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行，使用ABI 7500real-time PCR系统(Applied Biosystems)进行。GAPDH分别作为内控，使PLOD3和LRRN3表达正常化。引物序列如下：PLOD3，F:5′-ACCTGAAGGCGGTCTCTGT-3′(SEQID NO.1)和R:5′-CCTTGCTGCCATCTCGAATC-3′(SEQ ID NO.2)；LRRN3，F:5′-TGGTACCATTGAGTCTCTGCCA-3′(SEQID NO.3)和R:

5′-TGCCGAACATTCTGACCTTGG-3′(SEQ ID NO.4)；GADPH F:

5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′(SEQ ID NO.5)和R:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′(SEQ ID NO.6)。最终qPCR验证PLOD3在帕金森病人外周血液中高表达，而LRRN3在帕金森病人外周血液中低表达。利用受试者工作曲线(ROC)和矫正曲线(Calibration curve)评估两基因预测PD的准确性及稳定性，同时结合PLOD3和LRRN3和年龄因素构建Nomogram模型，证实PLOD3和LRRN3作为PD生物标志物的可行性。

用9个关键基因(hub genes)构建帕金森病危险评分模型，进而利用受试者工作曲线(ROC)和矫正曲线(Calibration curve)评估预测模型的准确性及稳定性，进一步对9个关键基因生物标记物进一步分析，筛选出PLOD3和LRRN3与帕金森Braak分期具有明显的相关性，如图1所示：首先利用LASSO回归构建9个关键基因帕金森病风险评分模型(图1A、B)，比较PD组与对照组中风险评分发现：PD组患者的风险评分显著高于对照组(图1C、D)；进一步计算Calibration曲线和AUC值发现风险评分对于PD组和对照组具有良好的区分效能(图1E、F)；通过比较9个关键基因生物标志物在合并人脑黑质组织数据集(图1G、H)、GSE99039数据集(图1I、J)、和GSE49036数据集(图1K、L)中的表达情况，发现PLOD3和LRRN3分别在帕金森病患者黑质组织和血液中高表达和低表达，并且与帕金森Braak分期具有明显的相关性。

从山东大学齐鲁医院神经外科获得帕金森病人与正常对照组外周血液样本行PCR检测PLOD3和LRRN3表达量后进行分析，证实PLOD3和LRRN3联合作为PD生物标志物的可行性，如图2所示：首先，qPCR验证帕金森病人与正常对照组外周血样本中PLOD3和LRRN3的表达，发现PLOD3在PD患者外周血中的表达显著高于正常对照组(图2A,B)；而LRRN3在PD患者外周血中的表达显著低于正常对照组(图2C，D)。利用受试者工作曲线(ROC)和矫正曲线(Calibration curve)证明PLOD3和LRRN3对于区分PD和正常对照均具有的较高的准确性及稳定性(图2E，F)。进一步结合PLOD3和LRRN3的表达情况和年龄构建Nomogram模型(图2G)并得到Nomogram评分；通过比较正常对照组和PD组的Nomogram评分发现，PD组的Nomogram评分明显高于正常对照组(图2H)，最终验证了联合检测PLOD3和LRRN3对于诊断PD的有效性和准确性，并证实了PLOD3和LRRN3联合作为PD生物标志物的可行性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。