NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物及其筛选鉴定方法和应用

摘要

本发明公开NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物及其筛选鉴定方法和应用，所述的铁死亡分子标志物为铁死亡差异表达基因：PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3。本发明通过生物信息学分析方法识别NKTCL中的Fer‑DEGs，并分析NKTCL中的免疫浸润与Fer‑DEGs的关系，为NKTCL的诊断及治疗提供新的靶点。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物及其筛选鉴定方法和应用。

背景技术

NK/T细胞淋巴瘤(NTKCL)，或结外NK/T细胞淋巴瘤，是一种具有高度侵袭性且罕见的非霍奇金淋巴瘤。NTKCL主要发生在亚洲和拉丁美洲人群中，这种人群分布的差异一定程度上与该地区EB病毒(EBV)的发病率有关。NKTCL肿瘤细胞的瘤变主要发生在周围成熟NK细胞中，较少来自细胞毒性T细胞，这意味着淋巴结外受累长多见，最常发生在上呼吸道、消化道(UADT)，较少发生在局部性淋巴结部位。NKTCL患者的治疗主要是只化疗不放疗的方式，以早期蒽环类为基础的化疗方案由于NKTCL中p-糖蛋白的高表达导致预后不良，进而导致内源性耐药，因此，NKTCL的传统的治疗方法仍存在缺陷。I/II期NKTCL患者局部肿瘤控制概率为大于90％，5年总生存率约为70％，III/IV期NKTCL患者联合使用SMILE方案(地塞米松、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、l-天冬酰胺酶和依泊苷)的1年OS率为50％。免疫疗法已成为癌症治疗的重要策略，但仍需进一步探索。研究表明程序性细胞死亡配体1(PD-L1)在NKTCL细胞中表达上调，与不良预后相关，尤其是在血液或肿瘤组织中的单核细胞中，这提示免疫逃逸在NKTCL的肿瘤发生和进展中发挥作用。但PD-L1是否为预测免疫治疗或常规治疗联合免疫治疗疗效的优秀生物标志物，针对这一重要课题，多项研究的结论是不一致的。在Keynote052研究中，派姆单抗治疗的尿路上皮癌患者PD-L1表达在1％-10％之间，随着PD-L1表达的增加，派姆单抗的疗效也相应提高，PD-L1表达高于10％的患者的ORR显著高于PD-L1表达低于1％的患者(39％VS 11％)，该研究表明PD-L1的高表达提高了免疫治疗的治疗有效率和临床疗效。然而，这一结论与Checkmate032的研究结果相反，该研究表明尿路上皮癌的高PD-L1表达(>1％)与低PD-L1表达(<1％)其对于Opdivo治疗反应无显著性差异(24％vs.26.2％)。此外，有研究表明，在I/II期NKTCL患者中，血清可溶性PDL1浓度高(≥3.4ng/ml)或肿瘤标本中PDL1表达比例高(≥38％)的NKTCL患者对治疗的有效率明显较低，生存期明显较差，并且PDL1的表达是患者的独立不良预后因素。因此，在NKTCL诊断及治疗中，寻找生物标记物来预测免疫治疗的疗效是迫切需要的。

铁死亡是一种新的细胞程序性死亡形式，由Stockwell在2012年发现，其特征是铁依赖性细胞膜脂质过氧化。铁死亡的主要机制是，在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡；此外，还表现为抗氧化体系(谷胱甘肽系统)的调控核心酶GPX4的降低。半胱氨酸为铁死亡通路中重要的负调控因子，有研究表明，淋巴细胞无法合成半胱氨酸，此重要发现或可成为淋巴瘤治疗的突破点。有研究表明，大鼠和小鼠动物模型中，铁死亡诱导剂imidazole-ketone-erastin(IKE)可显著降低弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的生长。铁死亡已被发现在放疗、化疗和免疫治疗中发挥积极作用，因此，铁死亡激活可能是克服癌症治疗耐药机制的一种潜在策略。研究表明，p53介导的铁死亡在自然产物Kayadiol治疗后可发生、诱导NKTCL细胞发生铁死亡过程，Kayadiol的作用机制主要是通过促进p53的表达，抑制SLC7A11，影响GSH的合成，从而降低GPX4活性，导致铁死亡的发生。然而，铁死亡基因在NKTCL中的作用，特别是在免疫调节方面，还没有被深入研究。因此，如何利用生物信息学及分子生物学方法检测与NKTCL的显著相关铁死亡分子标志物及其在肿瘤免疫细胞浸润和免疫分子相关分析，具有重要的临床意义。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物及其筛选鉴定方法和应用。

本发明的技术方案概述如下：

NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物，所述的铁死亡分子标志物为铁死亡差异表达基因：PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3。

进一步地，所述的铁死亡分子标志物为铁死亡差异表达基因：ANXA2、HSPA8、ANXA1、CFL1；

所述的铁死亡分子标志物为所述铁死亡差异表达基因中至少两种的组合。

本发明还进一步提供NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物的筛选鉴定方法，包括以下步骤：

(1)通过NCBI GEO公共数据库检索基因表达谱，并下载GSE80632和GSE169644数据集，并将两数据集进行交集后，确定26个铁死亡差异表达基因：PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3；

(2)对所述26个铁死亡差异基因进行基因功能富集分析，并利用Metscape数据库进行通路分析；

(3)利用STRING数据库获取所述26个铁死亡差异基因中相关的蛋白质相互作用对，进行PPI分子互作网络评估，并通过Cytoscape中的MCODE进行模块分析，确定4个关键铁死亡差异基因：ANXA2、HSPA8、ANXA1、CFL1；

(4)利用CIBERSORT算法，先对比分析NKTCL和正常对照之间肿瘤微环境中免疫细胞亚群浸润的差异性，再对26个铁死亡差异基因的表达水平与免疫细胞亚群浸润水平进行Pearson相关分析，并进一步分析4个关键铁死亡差异基因与肿瘤免疫细胞亚群浸润的相关性；

(5)通过TISIDB数据库确定所述4个关键铁死亡差异基因与不同免疫因子之间的相关性；

(6)通过GeneCards数据库获取447个NKTCL疾病相关基因，并利用CIBERSORT算法分析与NKTCL疾病相关系数最高的前20位基因在正常对照队列和NKTCL队列中的差异表达水平，并进一步对所述4个关键铁死亡差异基因的表达水平与NKTCL疾病相关系数最高的前20位基因表达进行相关性分析；

(7)利用ROC曲线评估、利用人类蛋白质图谱数据库验证所述4个关键铁死亡差异基因在NKTCL诊断中的准确性。

进一步地，所述基因功能富集分析包括GO富集分析、KEGG富集分析、GSEA富集分析。

进一步地，所述不同免疫因子包括趋化因子、免疫抑制剂、MHC、免疫刺激剂、细胞受体。

进一步地，所述NKTCL疾病相关系数最高的前20位基因为：TP53、MTC、BCL2、BCL10、BCL6、ATM、ALK、PTPRC、JAK3、CDKN2A、KIT、PTEN、STAT3、FAS、KRAS、AKT1、BAX、IL6、FASLG、PAX5。

进一步地，步骤(7)中，所述利用ROC曲线评估的方法为：若所述4个关键铁死亡差异基因的ROC曲线下与坐标轴围成的面积AUC＞0.7，则表示所述4个关键铁死亡差异基因的表达水平对NKTCL的发生和发展具有良好的临床预测效力。

进一步地，ANXA1基因的AUC为0.8704，ANXA2基因的AUC为0.7611，CFL1基因的AUC为0.8219，HSPA8基因的AUC为0.7247。

进一步地，步骤(7)中，利用人类蛋白质图谱数据库验证的方法为：利用人类蛋白质图谱数据库获取所述4个关键铁死亡差异基因的蛋白质表达水平，进行免疫组织化学分析以验证表达变化情况。

本发明还进一步提供NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物在NK/T细胞淋巴瘤诊断和治疗中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明通过从NCBI GEO公共数据库中检索基因表达谱，并在GSE80632和GSE169644数据集中确定26个铁死亡差异表达基因，由此利用PPI分子互作网络评估，确定了包含4个关键Fer-DEGs(ANXA2,HSPA8,ANXA1和CFL1)，采用CIBERSORT算法分析NKTCL中的免疫细胞浸润，发现4个关键Fer-DEGs与肿瘤免疫细胞浸润和免疫因子高度相关，并采用GSEA分析下游调控网络，且分析表明：4个关键Fer-DEGs在NKTCL的铁死亡、HIF-1信号通路、活性氧响应和中性粒细胞胞外陷阱形成中发挥关键作用，最后，通过人类蛋白质图谱数据库(HumanproteinAtlas database)获取4个关键Fer-DEGs在组织蛋白水平的表达差异，并通过ROC曲线和蛋白表达水平预测NKTCL发生、发展。

2、本发明通过生物信息学分析方法识别NKTCL中的Fer-DEGs，并分析NKTCL中的免疫浸润与Fer-DEGs的关系，为NKTCL在铁死亡生物分子标志物和肿瘤免疫调节之间提供新的诊断和治疗靶点。

附图说明

图1为差异基因与铁死亡相关差异基因及表达图：其中，图1A为GSE80632数据集中NKTCL与正常对照队列之间的4068个差异基因；图1B为GSE80632数据集中NKTCL与正常对照队列之间的71个Fer-DEGs基因表达韦恩图；图1C为GSE169644数据集中NKTCL与正常对照队列之间的46个Fer-DEGs差异基因；图1D为GSE80632和GSE169644数据集中NKTCL与正常对照队列之间的相同的26个Fer-DEGs基因表达韦恩图；

图2为26个Fer-DEGs的GO和KEGG富集分析及Metascape数据库富集分析图：其中，图2A为26个Fer-DEGs的GO富集分析图；图2B为26个Fer-DEGs的KEGG富集分析图；图2C为26个Fer-DEGs的Metascape数据库富集分析图；

图3为4个关键Fer-DEGs ANXA1、ANXA2、CFL1、HSPA8的KEGG富集分析图，且图3A-D依次表示ANXA1、ANXA2、CFL1、HSPA8的KEGG富集分析图；

图4为NKTCL中26个Fer-DEGs的蛋白质分子相互作用网络模型图；

图5为NKTCL组与正常对照组间免疫细胞浸润情况：其中，图5A为GSE80632数据集中13例正常组和19例NKTCL每个病例中22个亚群的免疫细胞浸润相对百分比图；图5B为NKTCL组与正常对照组免疫细胞浸润的差异图；图5C为26个Fer-DEGs的表达水平与22个免疫细胞亚群浸润水平之间的Pearson相关分析图；

图6为4个关键Fer-DEGs(ANXA1、ANXA2、HSPA8和CFL1)与免疫细胞浸润的相关性图，其中，图6A表示ANXA1与幼稚的CD4 T细胞和活化NK细胞相关性；图6B表示ANXA2与幼稚的CD4 T细胞、活化的树突状细胞和静息CD4记忆T细胞相关性；图6C表示CFL1与激活的树突状细胞、单核细胞和激活的NK细胞相关性；图6D表示HSPA8与记忆B细胞、M0巨噬细胞和激活肥大细胞相关性。

图7为4个关键Fer-DEGs与(ANXA1、ANXA2、HSPA8和CFL1)与不同免疫因子的相关性图，其中，图7A-7E依次表示4个关键Fer-DEGs与趋化因子、免疫抑制剂、MHC、免疫刺激剂、细胞受体之间的相关性；

图8为NKTCL相关基因与4个关键Fer-DEGs(ANXA1、ANXA2、HSPA8和CFL1)的相关表达水平图，其中，图8A表示正常对照组与NKTCL组间NKTCL相关基因表达水平，图8B表示正常对照组与NKTCL组之间NKTCL相关显著基因及4个关键Fer-DEGs的相关表达水平；

图9为4个关键Fer-DEGs的ROC预测曲线图，其中，图9A-9D依次表示ANXA1、ANXA2、CFL1、HSPA8的ROC预测曲线；

图10为人类蛋白质图谱数据库中非霍奇金淋巴瘤与正常组织间4个关键Fer-DEGs的代表性免疫组化；

图11为本发明NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物筛选鉴定方法流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物的筛选鉴定方法，包括以下步骤：

通过NCBI GEO公共数据库检索基因表达谱，并下载GSE80632和GSE169644数据集，并将两数据集进行交集后，确定26个铁死亡差异表达基因：PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3；所述的铁死亡分子标志物为所述铁死亡差异表达基因的数量组合，也就是说，所述的铁死亡分子标志物为所述铁死亡差异表达基因中至少两种的组合。

具体地：通过NCBI GEO公共数据库检索基因表达谱，并下载GSE80632数据集，共获得32组数据，其中正常组13例，NKTCL组19例，再按P值＜0.05和|logFC|＞0.585的遗传筛选条件使用Limma包对NKTCL组与正常组样本基因的差异进行统计分析，共筛选出4068个差异基因(2001个上调基因和2067个下调基因，图1A示出)，其中71个铁死亡基因(48个上调基因和23个下调基因，图1B示出)；再通过NCBI GEO公共数据库下载GSE169644数据集，并通过上述71个铁死亡差异基因的表达水平的分析与对比，筛选出在GSE169644数据集中存在差异表达的46个铁死亡基因(23个上调基因和23个下调基因，图1C示出)，但其中只有26个铁死亡差异基因的变化趋势在GSE80632和GSE169644数据集中相同(18个上调基因和8个下调基因，图1D示出)；

(1)对所述26个铁死亡差异基因进行GO富集分析、KEGG富集分析、GSEA富集分析，并利用Metscape数据库进行通路分析；具体地：

对所述26个铁死亡差异基因(Fer-DEGs)进行GO富集分析(Gene Ontology(GO))，结果如图2A所示：上述26个Fer-DEGs共富集在170个基因功能富集条目，其中127个生物学过程相关富集条目，21个细胞定位相关富集条目，22个分子功能相关富集条目；且上述26个Fer-DEGs候选基因主要富集在调控蛋白质稳定性、色素颗粒和钙粘蛋白结合等途径；

对所述26个铁死亡差异基因进行KEGG富集分析，结果如图2B所示：上述26个Fer-DEGs主要富集于HIF-1信号通路、铁死亡和中性粒细胞胞外陷阱形成等信号通路；

对所述26个铁死亡差异基因中的ANXA1、ANXA2、CFL1、HSPA8进行GSEA富集分析，结果如图3所示：ANXA1正性富集的通路包括同种异体排斥反应、内吞作用、移植物抗宿主疾病和核糖体，ANXA1负性富集的信号通路包括花生四烯酸代谢和亚油酸代谢(图3A示出)；ANXA2正性富集的途径包括阿尔茨海默病、慢性髓性白血病、柠檬酸循环、TCA循环和核苷酸切除修复；其负性富集的信号通路包括糖胺聚糖生物合成硫酸软骨素和糖胺聚糖合成硫酸肝素(图3B示出)；CFL1阳性富集的信号通路包括慢性髓性白血病、乙醛酸和二羧酸代谢、肾细胞癌和系统性红斑狼疮，与此同时，CFL1负性富集的信号通路包括烟酸和烟酰胺代谢以及嗅觉转导(图3C示出)；KEGG分析中HSPA8阳性富集的信号通路包括ErbB信号通路、胰岛素信号通路、mTOR信号通路和肾细胞癌；负性富集的信号通路包括嗅觉转导和鞘糖脂生物合成、乳糖和新内酯系列(图3D示出)；

利用Metscape数据库对所述26个铁死亡差异基因进行进一步的通路分析，结果如图2C所示：这26个Fer-DEGs主要富集于细胞器组织的正调控、对活性氧的响应和HIF-1信号通路；

上述基因富集结果表明，26个Fer-DEGs在NKTCL的铁死亡、HIF-1信号通路、活性氧响应和中性粒细胞胞外陷阱形成中起着至关重要的作用；

(2)利用STRING数据库获取所述26个铁死亡差异基因中相关的蛋白质相互作用对，进行PPI分子互作网络评估，并通过Cytoscape中的MCODE(分子复合物检测)进行模块分析，确定4个关键铁死亡差异基因：ANXA2、HSPA8、ANXA1、CFL1；

(3)利用CIBERSORT算法，先对比分析NKTCL和正常对照之间肿瘤微环境中免疫细胞亚群浸润的差异性，再对26个铁死亡差异基因的表达水平与免疫细胞亚群浸润水平进行Pearson相关分析，并进一步分析4个关键铁死亡差异基因与肿瘤免疫细胞亚群浸润的相关性；具体地：

使用CIBERSORT算法，首先分析NKTCL和正常对照之间肿瘤微环境中免疫细胞浸润的差异，每个样本中肿瘤微环境中的免疫细胞各亚群的含量如图5A所示；根据图5B(NKTCL组与正常对照组免疫细胞浸润的差异图)可知，与正常对照队列相比，NKTCL队列中的静息的CD4记忆T细胞和单核细胞水平显著降低，而活化的树突状细胞和幼稚的CD4 T细胞水平显著升高；再对26个铁死亡差异基因的表达水平与免疫细胞亚群浸润水平进行Pearson相关分析，根据图5C(26个Fer-DEGs的表达水平与22个免疫细胞亚群浸润水平之间的Pearson相关分析图)可知，这26个Fer-DEGs的表达水平与免疫细胞亚群浸润水平之间存在显著相关性；并进一步分析4个关键铁死亡差异基因与肿瘤免疫细胞亚群浸润的相关性，根据图6(4个关键Fer-DEGs(ANXA1、ANXA2、HSPA8和CFL1)与免疫细胞浸润的相关性图)可知，这4个关键Fer-DEGs与肿瘤免疫细胞亚群浸润高度相关，并在肿瘤免疫微环境中发挥重要作用；其中，根据图6A(ANXA1与幼稚的CD4 T细胞和活化NK细胞相关性)可知，ANXA1与幼稚的CD4T细胞呈正相关(相关系数，0.55；P值，0.001)，与活化的NK细胞呈负相关(相关系数，-0.41；P值，0.016)；根据图6B(ANXA2与幼稚的CD4 T细胞、活化的树突状细胞和静息CD4记忆T细胞相关性)可知，幼稚的CD4 T细胞(相关系数，0.41；P值0.018)和活化的树突状细胞(相关系数，0.55；P值0.001)与ANXA2表达呈正相关，而静息的CD4记忆T细胞(相关系数，-0.38；P值0.031)与ANXA2表达呈负相关；根据图6C(CFL1与激活的树突状细胞、单核细胞和激活的NK细胞相关性)可知，CFL1与活化的树突状细胞(相关系数，-0.43；P值0.012)表达呈正相关关系，和单核细胞(相关系数，-0.43；P值，0.012)及活化的NK细胞(相关系数，-0.36；P值，0.039)呈负相关关系；根据图6D(HSPA8与记忆B细胞、M0巨噬细胞和激活肥大细胞相关性)可知，HSPA8与记忆B细胞(相关系数,0.42；P值，0.014)和M0巨噬细胞(相关系数,0.56；P值，0.001)呈正相关，但与激活的肥大细胞呈负相关(相关系数，-0.41；P值，0.018；

(4)通过TISIDB数据库确定所述4个关键铁死亡差异基因与趋化因子、免疫抑制剂、MHC、免疫刺激剂、细胞受体之间的相关性，图7A-7E依次表示4个关键Fer-DEGs与趋化因子、免疫抑制剂、MHC、免疫刺激剂、细胞受体之间的相关性：根据图7证实了4个关键铁死亡相关差异基因Fer-DEGs在NKTCL中与不同免疫因子高度相关；

(5)通过GeneCards数据库获取447个NKTCL疾病相关基因，并利用CIBERSORT算法分析与NKTCL疾病相关系数最高的前20位基因TP53、MTC、BCL2、BCL10、BCL6、ATM、ALK、PTPRC、JAK3、CDKN2A、KIT、PTEN、STAT3、FAS、KRAS、AKT1、BAX、IL6、FASLG、PAX5在正常对照队列和NKTCL队列中的差异表达水平，根据图8A(表示正常对照组与NKTCL组间NKTCL相关基因表达水平)可知：与正常对照组相比，NKTCL组TP53表达水平明显降低，而PTPRC、JAK3、CDKN2A、FAS、AKT1、IL6的表达水平明显升高，具有统计学差异；并进一步对所述4个关键铁死亡差异基因的表达水平与NKTCL疾病相关系数最高的前20位基因表达进行相关性分析，根据图8B(表示正常对照组与NKTCL组之间NKTCL相关显著基因及4个关键Fer-DEGs的相关表达水平)可知：ANXA1和CFL1表达水平与CDKN2A表达水平呈正相关，并具有显著性差异。ANXA2的表达水平与AKT1表达水平呈正相关，并具有显著性差异；

(7)利用ROC曲线评估、利用人类蛋白质图谱数据库验证所述4个关键铁死亡差异基因在NKTCL诊断中的准确性；具体地：

所述利用ROC曲线评估的方法为：若所述4个关键铁死亡差异基因的ROC曲线下与坐标轴围成的面积AUC＞0.7，则表示所述4个关键铁死亡差异基因的表达水平对NKTCL的发生和发展具有良好的临床预测效力，根据图9(4个关键Fer-DEGs的ROC预测曲线图)可知，ANXA1基因的AUC为0.8704，ANXA2基因的AUC为0.7611，CFL1基因的AUC为0.8219，HSPA8基因的AUC为0.7247，提示4个关键Fer-DEGs作为生物分子标志物具有良好临床预测效率；

所述利用人类蛋白质图谱数据库验证的方法为：利用人类蛋白质图谱数据库获取所述4个关键铁死亡差异基因的蛋白质表达水平，进行免疫组织化学分析以验证表达变化情况，根据图10(人类蛋白质图谱数据库中非霍奇金淋巴瘤与正常组织间4个关键Fer-DEGs的代表性免疫组化)可知，4个关键Fer-DEGs在非霍奇金淋巴瘤与正常组织中的蛋白质表达呈现明显差异化，说明4个关键Fer-DEGs作为生物分子标志物在NK/T细胞淋巴瘤诊断中准确率高，具有良好临床预测效率。

实施例1通过生物信息学的方法在NKTCL中筛选出4个关键Fer-DEGs，并通过验证发现这4个关键Fer-DEGs与NKTCL的肿瘤免疫微环境相关，其可通过铁死亡、HIF-1信号通路、活性氧响应信号通路参与调节NKTCL相关基因CDKN2A的表达，并且这4个关键Fer-DEGs的表达水平具有预测NKTCL临床疗效的作用，可应用于NK/T细胞淋巴瘤诊断和治疗。

实施例2

NK/T细胞淋巴瘤的铁死亡分子标志物的应用，包括以下步骤：

通过收集临床NK/T细胞淋巴瘤初诊患者的肿瘤标本组织(通过手术、或内镜活检取样)，进行mRNA水平、免疫组化蛋白水平检测，确定26个铁死亡差异表达基因：PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3；在不同NK/T细胞淋巴结初诊患者肿瘤标本组织中的表达水平。所述的铁死亡分子标志物为所述铁死亡差异表达基因的数量组合，也就是说，所述的铁死亡分子标志物为所述铁死亡差异表达基因中至少两种的组合。

具体地：通过收取临床NK/T细胞淋巴瘤初诊患者的肿瘤标本组织，将收集到的肿瘤标本组织分取两部分，一份置于Trizol试剂1ml中裂解提取mRNA，一份置于石蜡中形成石蜡组织标本。

1)提取mRNA进行26个铁死亡差异表达基因：PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3表达水平验证的应用：

A.收取临床NK/T细胞淋巴瘤初诊患者的肿瘤标本组织，一份置于Trizol试剂1ml中，用去酶枪头吹打均匀，将Trizol用移液器转移到去酶的1。5mlEP管中。(若不马上操作可将其保存在-20℃或-80℃冰箱)。

B.向每个EP管中加入200ul的三氯甲烷，上下快速剧烈震荡混匀1min，然后室温静置5min。

C.将高速冷冻离心机遇冷后于12000rpm离心15min。

D.吸取上清400ul，并将其转移至另一個去酶EP管中；在每管中加入等体积(400ul)的异丙醇，上下快速剧烈颠倒混匀，室温静置10min。

E.后12000rpm离心10min。

F.去上清液，沉淀中加入1ml的75％乙醇清洗沉淀，并不吹散。

G.后12000rpm离心5min。

H.去上清液，在沉淀中加入5-10ul去酶水溶解沉淀。

I.测量提取mRNA的浓度、纯度。取1ul mRNA样本，上机测定OD值，λ260/280比值检测范围在1.8-2.0之间。记录每个标本的mRNA浓度，根据此浓度调整逆转录体系(如不马上操作可将mRNA标本置于-80℃长期保存)。

J.逆转录：利用Takara逆转录试剂盒，按照10ul反应体系，将mRNA逆转录成cDNA。先配置公共试剂及3.5ul的(5Xbuffer、PrimeScript TM RT Enzyme、Oligo(dT)Primer(50uM)、Random 6mers(100uM)混合)。将配置好的混合液分别加到做好标记的100ul去酶EP管中，根据RNA的浓度和纯度，决定RNA加样量。吹弹混匀每个管中的逆转录体系，放置于PCR逆转录系统。反应条件为：37℃15min；85℃3s；4℃正无穷，保存。将逆转录好的cDNA用30ulDEPC水稀释，4℃保存。

K.引物的溶解与稀释：引物序列如表1所示，引物稀释如下：将装有引物粉末的EP管放到离心机里离心10s，查看管侧壁上标注的nmol数，取其10倍的去酶水加入其中后吹打混匀，标记为母液(母液长期保存在-20℃)。取其中的10ul，再同90ul的去酶水稀释作为引物的工作液(工作液放于4℃长期保存)。

L.实时定量PCR：反应体系为10ul(PCR水3.6ul、上、下游引物各0.2ul、Taq酶5.0ul、cDNA 1.0ul)，在需要加样的孔中加入9ul的反应体系，然后将cDNA加入到相应孔中，每孔加入1ul的cDNA。加完样后，用封口膜将孔密封好，然后将PCR板放到离心机中进行离心。1000rpm，5min。将离心后的PCR板放至罗氏定量荧光PCR仪中。扩增条件：95℃2min预变性；95℃30s变性，60℃35s退火，PCR反应总共设置40个循环，并于每个循环的延伸末端收集荧光信号，绘制扩增曲线；40个循环后设置如下温度控制反应步骤：95℃15s-60℃30s-95℃15s，并且对60℃到95℃升温的整个过程进行全程荧光信号的收集以绘制出溶解曲线。数据处理：根据所测得目标和内参基因的循环数值(Ct值)，计算目标基因相对表达量：ΔCt＝Ct目标基因-Ct内参基因，ΔΔCt＝ΔCt肿瘤组-ΔCt对照组；相对表达量＝2-ΔΔCt。

表1

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2)提取肿瘤标本进行免疫组化染色，进行26个铁死亡差异表达基因：PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3蛋白表达水平验证的应用：收取临床NK/T细胞淋巴瘤初诊患者的肿瘤标本组织，收取临床NK/T细胞淋巴瘤初诊患者的肿瘤标本组织，一份置于石蜡中形成石蜡组织标本，采用免疫组化方法检测26个铁死亡差异表达基因：PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3在NK/T细胞淋巴瘤组织中的表达量并计算免疫组化评分，具体步骤如下

A.制备NK/T细胞淋巴瘤组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

B.脱蜡及复水：二甲苯10min-100％乙醇5min-95％乙醇5min-90％乙醇5min-85％乙醇5min-80％乙醇5min-75％乙醇5min-60％乙醇5min-50％乙醇5min-30％乙醇5min-自来水1min-双氧水1min。

C.1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min。

D.微波修复：将切片进入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力(98-100℃)加热至沸腾，冷却，反复两次。

E.将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次每次5min。

F.封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体。

G.滴加一抗(PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3)，4℃过夜。

H.PBS洗涤3次，每次3min。

I.滴加二抗，37℃，15-30min。

J.PBS洗涤3次，每次3min。

K.滴加SABC，37℃，30min。

L.PBS洗涤3次，每次3min。

M.1ml蒸馏水中分别加入显色剂，混匀。

N.DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间。

O.自来水冲洗干净，过蒸馏水。

P.苏木素复染2min，自来水冲洗。

Q.脱水：30％乙醇3min-50％乙醇3min-70％乙醇3min-80％乙醇3min-90％乙醇3min-95％乙醇3min-100％乙醇3min-二甲苯20min；

R.树脂封片，镜下观察。采用以上免疫组化方法的实验步骤检测26个铁死亡差异表达基因PARK7、ECH1、SLC39A7、ATF3、VDAC1、PDSS2、VDAC3、ATG7、ANXA2、HSPA8、KRT6B、RBX1、ANXA1、CFL1、CCT3、CCT8、RUFY1、DIAPH3、TFRC、RELA、ZFP36、OTUB1、TPM1、ENO2、PFN2、YTHDF3蛋白在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤标本中的表达情况。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。