忧郁型郁抑症分类诊断的生物标记物及其应用

摘要

本发明涉及一种忧郁型抑郁症血浆生物标志试剂盒检测方法，用于检测忧郁型抑郁症的血浆生物标志。本发明提供了一种通过检测血浆脂联素(Adiponectin)蛋白作为忧郁型抑郁症生物标志的应用方法，本发明方法用于非诊断目的的忧郁型抑郁症的亚型分类诊断，提高了忧郁型抑郁症筛查的灵敏度和特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及临床医学精神病学技术领域，更具体地，涉及抑郁症技术领域，特别是指判断忧郁型抑郁症的鉴别与亚型分类辅助诊断检测技术。

背景技术

抑郁症(Major depressive disorder)是一种以情绪低落、思维迟缓、认知功能下降、运动性抑制等核心症状为特点的重性慢性精神疾病，具有高患病率、高复发率、高自杀率和高致残性的特点。抑郁症12个月患病率总体约为6％，而终生患病风险增加约3倍(15～18％)，意味着几乎五分之一的人在一生中的某个时刻会经历至少一次抑郁发作。目前中国约有9500万抑郁症患者，每年因抑郁而自杀的人数约为28万，故抑郁症已成为最迫切需要解决的精神卫生问题之一。

遗憾的是，仅有不到三分之一的抑郁症患者在第一次抑郁症发作时治疗一年后的缓解或痊愈且没有复发，而有三分之一的患者即使在连续四次治疗试验后也从未缓解或痊愈，但其中20％至33％甚至发展为难治性抑郁症，这迥然相异的治疗结局可能就与抑郁症患者间的极大的异质性有关，而异质性的来源之一为其诊断标准。目前抑郁症的诊断标准精神障碍诊断与统计手册(第5版)(DSM-5)是基于多元症状特征中最少数量的症状特征来定义的(在纳入的9个症状特征中至少存在5个，且其中至少有一个必须是“情绪低落”或“兴趣或愉悦感减弱”)，约有227种不同的症状组合符合抑郁症的诊断标准，这使得诊断相同的患者间的症状模式、病程轨迹和治疗反应差异极大。因此，基于同质化的患者亚组或亚型，有助于减少抑郁症患者间的异质性，提高抑郁症患者的诊治水平，有助于患者的预后，也更有益于对特异性病因机制的理解，以及开发更具患者特异性的诊断及治疗生物标记物。因此，对抑郁症患者中具备某一类特征的特定临床亚型的精准识别具有极为重要的临床意义。

有关抑郁症的临床亚型，目前“纯”亚型患者数目占比最多的前三种亚型依次为焦虑型抑郁症(anxious depression)、忧郁型抑郁症(melancholic depression)和非典型抑郁症(atypical depression)。其中，忧郁型抑郁症影响了大约25-50％的抑郁症人群；国内大样本临床调查显示，抑郁症患者中忧郁型抑郁症占比约为53.4％，而在女性患者中可能高达81.3％，其主要临床特征为：对通常令人愉快的环境缺乏情感反应、普遍的快感缺失、动力缺乏、精神运动迟缓、认知障碍，以及典型的植物性功能障碍症状，包括早醒、情绪的昼夜变化、早晨情绪体验更糟等、体重减轻等。

忧郁型抑郁症是抑郁症的病情更为严重的一种亚型，与非忧郁型抑郁症患者相比，忧郁型抑郁症患者的预后更差，治愈可能性降低。同时，该抑郁亚型的临床治疗方式也与其他亚型存在重大差异，按照抑郁症治疗指南推荐，针对忧郁型抑郁症患者，首选一线抗抑郁药物“选择性5-羟色胺再摄取抑制剂”(SSRIs)如氟西汀等，其治疗效果较非忧郁型效果更好，且忧郁型抑郁症对于低剂量的氟西汀起效时间更早且缓解率更高。此外，“去甲肾上腺素多巴胺再摄取抑制剂”(SNDRIs)如安非他酮等对忧郁型抑郁症的疗效与SSRIs相当，此外，还可结合心理治疗和物理治疗对忧郁型抑郁症进行临床治疗。

综上，作为患者数目最多的前三种抑郁症临床亚型之一，忧郁型抑郁症是抑郁症病情更严重的一种疾病形式，其核心症状、病程、治疗方案、预后及生物学因素都与抑郁症其他临床亚型存在极大的差异，故寻找精准识别忧郁型抑郁症的客观生物标志，具有极为重要的临床应用价值。

发明内容

本发明目的是针对现有技术对抑郁症不同亚型识别不足，提供一种对忧郁型抑郁症进行精准筛查与亚型分类诊断的方法：即测量血浆脂联素蛋白差异表达水平，提供临床诊断的客观指标。

为了实现上述的目的，本发明提供了一种生物标记物在制备抑郁症的筛查或亚型分类诊断的产品中的应用，其主要特点是，所述的生物标记物为脂联素蛋白。

较佳地，所述的产品为用于筛查忧郁型郁抑症的产品。

较佳地，所述的产品为用于亚型分类诊断忧郁型抑郁症的产品。

本发明还提供了一种检测生物标记物含量的试剂在制备抑郁症的筛查或亚型分类诊断的试剂盒中的应用，其主要特点是，所述的生物标记物为脂联素蛋白。

本发明还提供了一种试剂盒在抑郁症的筛查或亚型分类诊断方面的应用，其主要特点是，所述的试剂盒用于检测生物标记物含量，所述的生物标记物为脂联素蛋白。

较佳地，检测样品为血浆。

本发明提供了一种通过检测脂联素蛋白差异表达水平作为忧郁型抑郁症血浆生物标志的应用方法，本发明方法可用于筛查抑郁症，特别是忧郁型抑郁症，同时，还可以用于非诊断目的忧郁型抑郁症的亚型分类诊断，提高了忧郁型抑郁症筛查的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为通过检测血浆脂联素蛋白水平对忧郁型抑郁症进行亚型分类诊断的整体流程示意图。

图2为血浆脂联素蛋白差异表达水平用于忧郁型抑郁症的亚型分类诊断，为忧郁型抑郁症患者与健康对照及非典型抑郁症、焦虑型抑郁症患者的血浆脂联素蛋白表达水平(单位为pg/ml)的比较，中心点为中位数，误差线为均值的95％置信区间。图中“**”代表忧郁型抑郁症组的脂联素表达水平经双对数转换后(log2)，与其他各组相比，差异具有统计学意义，即采用Bonferroni法校正后P<0.001。本发明中，忧郁型抑郁症的血浆脂联素蛋白表达水平中位数及95％置信区间为1.12×10

图3为血浆脂联素蛋白用于鉴别忧郁型抑郁症与健康对照及非典型抑郁症、焦虑型抑郁症的ROC曲线结果，其中，脂联素蛋白分别用于鉴别忧郁型抑郁症与健康对照(C)及非典型抑郁症(A)、焦虑型抑郁症(B)的ROC曲线结果。横坐标为1-特异性，纵坐标为敏感性，AUC(Area Under Curve)为ROC曲线下与坐标轴围成的面积。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。

考虑抑郁症作为一种临床异质性极高的疾病，其临床症状、治疗策略、治疗效果及预后，乃至生物学表型都存在极大的异质性的特点，本发明提供了一种通过检测血浆脂联素蛋白来达到亚型分类诊断忧郁型抑郁症的方法，可用于忧郁型抑郁症与健康对照，以及抑郁症其他临床亚型非典型抑郁症、焦虑型抑郁症的亚型诊断生物标志。为忧郁型抑郁症这一抑郁症重要亚型的辅助诊断提供客观标志，应用在常规精神检查确诊为抑郁症的病人中。通过血浆脂联素蛋白的检测结果，计算其蛋白差异表达水平，得到一个忧郁型抑郁症辅助诊断的参考值，对精神检查为抑郁发作病人进一步确诊与亚型分类，对提高临床医生诊断的准确性提供帮助，避免误诊误治，改善疾病预后。

可以采用蛋白芯片技术检测患者的脂联素蛋白表达水平，一方面，可有效区分忧郁型抑郁症患者与健康对照人群，以及抑郁症其他临床亚型患者，主要是抑郁症患者数目最多的另两组临床亚型患者，包括非典型抑郁和焦虑型抑郁，从而作为忧郁型抑郁症精准筛查与辅助诊断的客观指标；另一方面，还可对精神检查为抑郁症的病人进一步确诊和亚型分类，避免出现假阳性。

因此，通过血浆脂联素蛋白差异表达水平的检测得到忧郁型抑郁症亚型的诊断提示，可直接提供给临床医生参考，使其在较短时间内，确定精准的治疗方案，从而缩短诊疗时间，提高了工作效率和诊疗方案的准确性。

在本发明中，所述的生物标记物为脂联素，适用于对忧郁型抑郁症的分类诊断。

本发明中，“抑郁症”、“抑郁症状”、“抑郁发作”等术语及其含义，如下所示：

抑郁症(Major depressive disorder)是一类以情绪或心境低落为主要表现的疾病总称，伴有不同程度的认知和行为改变，可伴有精神病性症状，如幻觉、妄想等，存在高患病率、高复发率、高自杀率和高致残性的特点，目前，临床上主要采用国际疾病分类第10版(ICD-10)、《精神疾病诊断与统计手册》第5版(DSM-5)等分类诊断系统对抑郁症进行诊断。

抑郁发作(major depressive episode)是以抑郁为特征的疾病状态，以情绪低落、兴趣减退、快感缺失为核心特点，还常常伴有其他认知、躯体以及行为学表现，如注意力不集中、反应迟钝、睡眠障碍、行为活动减少以及疲乏感等。单次抑郁发作至少持续2周，常会反复发作，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性，可造成严重的社会功能损害。

抑郁症状(depressive symptoms)是指抑郁发作时患者的临床表现，主要可分为核心症状群、心理症状群与躯体症状群。其中，核心症状群包括情绪低落、兴趣减退和快感缺失；心理症状群包括焦虑、思维迟缓、认知症状、自罪自责、自杀未遂和行为、精神运动迟滞或激越、精神病性症状、自知力等；躯体症状群包括睡眠障碍、饮食及体重障碍、精力丧失、抑郁情绪昼重夜轻、性功能障碍、其他非特异性躯体症状等。

在本发明中，所述的脂联素为人源蛋白，其基本信息及其功能如下：

人脂联素(Adiponectin)蛋白是由脂联素、C1Q和胶原结构域基因(Adiponectin，C1Qand collagen domain containing，ADIPOQ)编码的、由脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽，也是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白质产物之一，由244个氨基酸组成，分子量为30KD，大量存在于血液循环和脂肪组织中，但脑内并不存在。脂联素单聚体和三聚体是其生物活性形式或受体亲和配基，可特异性地结合骨骼肌或肝脏细胞膜上的G蛋白偶联受体或脂联素受体，进而调节脂肪酸氧化和糖代谢。脂联素的主要功能是参与控制脂肪代谢和胰岛素敏感性的重要脂肪因子，具有直接的抗糖尿病、抗动脉粥样硬化和抗炎活性。脂联素还可在肝脏和巨噬细胞等各种组织中负调节肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNFα)的表达并拮抗TNFα的功能。此外，还可通过结合和隔离具有不同结合亲和力的各种生长因子，从而在细胞生长、血管生成和组织重塑中发挥作用。

本发明所用的术语“ROC曲线”(receiver operator characteristic curve)，工作特征曲线，是指展示二元分类系统的性能随着其辨别阈值变化的图形曲线，是基于在不同阈值设置的条件下绘制真阳性率对假阳性率的曲线来创建该曲线。此处，真阳性率被称为灵敏度；假阳性率则计为1-特异性。因此，ROC曲线是基于一系列截断值范围内的真阳性率(灵敏度)对假阳性率(1-特异性)的图形显示、进而选择最佳截断值的临床使用方式，其准确度表示为ROC曲线下面积(AUC)，从而为比较测试性能提供了切实可行的参数。在ROC曲线中，AUC值越接近1，表示该测试高度灵敏且具有高度特异性，而AUC值接近0.5，则表明该测试既不灵敏也不具有特异性。

当涉及测试样品与对照样品或参考样品之间的差异时，术语“统计学差异”或“统计学意义”涉及在使用适当的统计分析方法时，各组相同的概率小于5％(例如P<0.05)的情况，即在完全随机基础上获得相同结果的概率在100次尝试中少于5次。同理，若各组相同的概率小于1‰(例如P<0.001)的情况，即在完全随机基础上获得相同结果的概率在1000次尝试中少于1次。本发明中，我们选择了适当的统计分析方法，例如，根据研究变量是否为正态分布(采用Kolmogorov-Smirnov检验)，选择使用参数模型检验如t检验或ANOVA检验(正态分布)，或非参数模型如MannWhitney U检验或Kruskal-Wallis检验(非正态分布)。同时，对于脂联素蛋白芯片检测数据还进行了双对数转换(log2转换)，使得经由log2转换后的脂联素蛋白检测数据符合正态分布(由Kolmogorov-Smirnov检验确定)。

下面结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行实验操作。

实施例

S1临床医生首先纳入符合ICD-10/DSM-5中的抑郁症诊断标准，目前处于抑郁发作阶段的首发或复发的急性期患者，并纳入健康对照，进行精神评估及临床评估，请参阅图1所示。

本实施例中，共纳入120例研究对象，其中，健康对照人群、忧郁型抑郁症、非典型抑郁症及焦虑型抑郁症患者各30例。

本实施例中，健康对照人群及抑郁症及其三种不同临床亚型(忧郁型抑郁症、非典型抑郁症及焦虑型抑郁症)患者的纳入及排除标准分别为：

健康对照

入组标准：

(1)年龄18-55岁；

(2)无精神疾病及精神疾病家族史；

(3)HAMD-17量表总分≤5分；

(4)无神经系统变性类疾病、脑外伤或脑血管病史；

(5)无物质滥用或物质成瘾；

(6)无不稳定性心绞痛，心肌梗塞，充血性心衰，严重肝硬化，急慢性肾功能衰竭，严重糖尿病，再生障碍性贫血，癫痫，等严重心、肝、肾、内分泌、血液系统等躯体疾病或可能干扰试验评估的疾病(实验室异常指标高于正常值2倍以上)；

(7)自愿参与研究，并签署知情同意书。

排除标准：

(1)排除有精神疾病、严重躯体疾病及脑血管疾病或脑外伤史；

(2)排除曾出现严重过敏反应或曾患有免疫系统疾病者；

(3)1个月内使用过抗炎药物或者免疫抑制剂；

(4)发生脑外伤，或伴有严重躯体疾病患者；

(5)怀孕、哺乳期妇女或计划妊娠者。

抑郁症患者

入组标准：

(1)符合ICD-10/DSM-5中的抑郁发作诊断标准，目前处于抑郁发作阶段的首发或复发的急性期患者；

(2)年龄18-55岁；

(3)17项汉密尔顿抑郁量表(HAMD-17)评分总分≥17分；

(4)入组前半年内未服用过任何抗抑郁药物，未接受过任何物理治疗及心理治疗；

(5)具有一定的文化程度，能理解研究相关内容；

(6)自愿参加本研究，并签署书面知情同意书。

排除标准：

(1)其他器质性疾病引起的继发性抑郁症；

(2)药物引起的继发性抑郁症；

(3)酒精或其他物质滥用及依赖；

(4)怀孕、哺乳期妇女或计划妊娠者；

(5)严重自杀企图(HAMD-17第3项“自杀”评分≥3分，或本次抑郁发作期间有自杀行为)；

(6)共病其他精神障碍；

(7)伴有严重躯体疾病患者。

其中，抑郁症患者的三个临床亚型(忧郁型抑郁症、非典型抑郁症和焦虑型抑郁症)主要根据30项抑郁症状自评量表(IDS-30)和HAMD-17量表进行临床亚型分类判定，具体如下所示：

(1)忧郁型抑郁症

主要通过IDS-30中相关条目的得分来进行判定，要求同时满足：

①IDS-30第9项(情绪变化)或第21项(愉快或享乐的能力(性活动除外))中，至少有1项得分≥2分

②以下5项特征中至少存在3项：极度绝望或忧郁，或情绪空虚、极其明显的抑郁情绪；抑郁症状早晨更严重；易怒；精神运动激越或迟缓；严重厌食或体重减轻。

(2)非典型抑郁症

主要通过IDS-30中的相关条目来进行判定，要求同时满足：

①IDS-30的第21项≥2分；

②食欲增加或体重显著增加；

③人际关系敏感；

④铅性麻痹(沉重，或手臂或腿部感觉沉重)。

(3)焦虑型抑郁症

焦虑型抑郁的判定主要依据HAMD-17量表相关条目，要求同时满足：

①HAMD-17量表的焦虑/躯体因子分(包括第10、11、12、13、15和第17项)≥7分；

②以下5项中至少存在2项：感到紧张或不安；感到异常不安；由于担心而难以集中注意力；害怕可怕的事情发生；以及害怕失去对自己的控制。

S2采集血浆样本，并采用蛋白芯片技术测量患者血浆脂联素蛋白水平。

在本实施例中，使用定量蛋白芯片试剂盒对血浆样本的脂联素蛋白表达水平进行检测。

该试剂盒包含以下物品：定量蛋白玻璃芯片(QAH-CUSTOM)、样品稀释液、20×洗液I、20×洗液II、标准品混合物、脂联素蛋白的免疫球蛋白G抗体、Cy3-链霉亲和素、玻片清洗和干燥器、密封条等。

具体检测实施方法如下所述：

(1)干燥定量蛋白芯片：

取出定量蛋白芯片，在室温下平衡20-30分钟后，将芯片置于真空干燥器干燥中1-2小时，即可完全干燥蛋白芯片。

(2)配置标准品：

①添加500μL的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下吹打溶解粉末，标记这个小管为Std 1。

②分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7，添加200μL的样品稀释液到每个小管中。

③抽取100μL的Std 1加入到Std2中轻轻混合，然后从Std 2中抽取100μL加入到Std 3中，如此梯度稀释至Std7，从而得到标准液。

(3)抽取100μL的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CT，作为阴性对照。

(4)取出完全干燥的玻片芯片，往每个孔中加100μL的样品稀释液，于室温条件下载摇床上孵育1小时，封闭定量抗体芯片。继而采用缓冲液洗涤。

(5)吸去每个孔中的缓冲液，添加60μL的标准液和样品(样品2倍稀释上样)到孔中，4℃过夜孵育。

(6)使用芯片洗板机清洗玻片。在本申请中使用Thermo Scientific Well WashVersa芯片洗板机来进行玻片清洗，主要分为两步，首先用1×洗液I进行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液I。然后换用1×洗液II通道进行清洗，每孔250μL的1×洗液II，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液II。

(7)孵育抗体混合物

离心装有脂联素抗体的混合物eppendorf管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心，继而添加80μL的脂联素抗体到每个孔中，室温下于摇床上孵育2小时。

(8)再次清洗，步骤同(6)。

(9)孵育Cy3-链霉亲和素

离心Cy3-链霉亲和素eppendorf管，继而加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μL的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住定量蛋白芯片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。

(10)再次清洗，步骤同(6)。

(11)将芯片放在洗干仪中，采用1000rpm转速离心并进行充分干燥。

(12)对干燥后的玻璃芯片进行荧光检测。在本实施例中，采用InnoScan300Microarray Scanner荧光扫描仪来扫描仪扫描信号，扫描参数为：WaveLengh：532nm；Resolution：10μm。采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)，使用Mapix软件捕获信号值。

S3采用QAH-CUST的数据分析软件来进行数据分析，以获取血浆样本中脂联素蛋白表达水平。具体如下：

首先对蛋白芯片实验原始检测数据做归一化处理，即芯片扫描得到的原始数据经芯片背景去除、将标准品的数据取平均值，做归一化处理。因原始测量数据呈偏态分布，故对原始测量数据做双对数转换(log2)后即呈正态分布，再用于后续统计分析。此外，还对数据的离散程度进行分析，对于偏离均值±2标准误差(SD)之外的数据，不计入数据统计。本实施例中，健康对照人群及忧郁型抑郁症、非典型抑郁症、焦虑型抑郁症组的离散数据(均值±2SD)个数分别为1例、3例、3例、2例，脂联素原始测量值及离散值具体如下表1所示。

表1血浆脂联素蛋白的原始测量值及进行双对数转换后的数值

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注：斜体显示的为离群值，即测量值在均值±2SD之外，视为离群值。

S4本发明的统计结果如图2所示，忧郁型抑郁症组与健康对照以及非典型抑郁症、焦虑型抑郁症组的“**”表示脂联素蛋白表达水平的统计学差异P<0.01。因此，忧郁型抑郁症组中血浆脂联素蛋白水平显著升高，且与健康对照及抑郁症其他两种患者数目最多的临床亚型非典型抑郁症和焦虑型抑郁症患者组之间的差异具有统计学意义。

此外，更进一步对数据进行分析，ROC曲线的结果如图3所示，忧郁型抑郁症患者的脂联素蛋白相较于健康对照及非典型、焦虑型抑郁症患者的AUC值及95％置信区间分别为0.967(0.926～1.000)、0.888(0.801～0.974)、0.936(0.874～0.998)，说明脂联素可作为忧郁型抑郁症的客观生物标志，具备极其优异的亚型分类诊断效能。

通过本发明中对脂联素蛋白水平检测可精准诊断忧郁型抑郁症患者，避免因误诊漏诊而影响治疗方案的准确性和针对性，提高了工作效率。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。