一组SNP分子标记集、引物及其在鉴定不结球白菜地方品种‘箭杆白’中的应用

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一组SNP分子标记集、引物及其在鉴定不结球白菜地方品种‘箭杆白’中的应用。本发明通过KASP技术开发了28个SNP分子标记集，以28个SNP分子标记及确定的分型结果为组合，结合不结球白菜地方品种‘箭杆白’的形态特征，作为鉴定标准，可快速准确的鉴定‘箭杆白’地方品种，有助于‘箭杆白’这一地方品种的保护与开发，也为地方种质资源保护提供了新的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一组SNP分子标记集、引物及其在鉴定不结球白菜地方品种‘箭杆白’中的应用。

背景技术

不结球白菜‘箭杆白’是南京地方品种，适合加工腌制。随着特色农业产业的发展，‘箭杆白’的开发价值不断提升，相关的地方种质资源保护成为市场开发的基础，也是推动相关产业健康发展的关键。

传统的地方种质资源鉴定主要依靠植株、花、果实等肉眼可见的表型特征，这些表型特征可称为形态标记。形态标记受环境与基因表达的双重影响，鉴定过程需要一定的经验积累和大量的田间工作，鉴定结果存在一定的误差，这对地方品种的保护十分不利。除了形态标记，细胞标记、生化标记和分子标记等三种遗传标记也是鉴定种质资源的重要工具，其中分子标记以数量多、多态性高、不受环境影响等特点被广泛使用。

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)是指竞争性等位基因特异性PCR，它基于touch-down PCR技术，利用通用荧光探针，可针对广泛的基因组DNA样品，包括复杂基因组DNA样品，对目标SNPs和InDels进行精准的双等位基因分型，是一种高通量分子标记分型系统。

但利用KASP技术来鉴定不结球白菜地方品种‘箭杆白’未见相关报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一组基于KASP技术开发的SNP分子标记集、引物，基于上述SNP分子标记集可以实现对不结球白菜地方品种‘箭杆白’的鉴定评价，从而有利于不结球白菜地方品种‘箭杆白’的保护。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一组SNP分子标记集作为检测靶点在鉴定不结球白菜地方品种‘箭杆白’中的应用，所述SNP分子标记集包括如下编号为SNP1～28所示的SNP标记：

所述SNP1标记为碱基G：G，位置为不结球白菜全基因组序列的第14501673位；

所述SNP2标记为碱基A：A，位置为不结球白菜全基因组序列的第21841740位；

所述SNP3标记为碱基G：G，位置为不结球白菜全基因组序列的第2274458位；

所述SNP4标记为碱基A：A，位置为不结球白菜全基因组序列的第30940322位；

所述SNP5标记为碱基G：G，位置为不结球白菜全基因组序列的第25272632位；

所述SNP6标记为碱基C：C，位置为不结球白菜全基因组序列的第754454位；

所述SNP7标记为碱基G：G，位置为不结球白菜全基因组序列的第2173987位；

所述SNP8标记为碱基C：C，位置为不结球白菜全基因组序列的第3991751位；

所述SNP9标记为碱基G：G，位置为不结球白菜全基因组序列的第2402629位；

所述SNP10标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第21133506位；

所述SNP11标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第9762361位；

所述SNP12标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第2250855位；

所述SNP13标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第527148位；

所述SNP14标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第1505096位；

所述SNP15标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第1602304位；

所述SNP16标记为碱基A：A，位置为不结球白菜全基因组序列的第5066326位；

所述SNP17标记为碱基A：A，位置为不结球白菜全基因组序列的第23832273位；

所述SNP18标记为碱基G：G，位置为不结球白菜全基因组序列的第10554158位；

所述SNP19标记为碱基A：A，位置为不结球白菜全基因组序列的第10109067位；

所述SNP20标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第15594560位；

所述SNP21标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第1091260位；

所述SNP22标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第26144635位；

所述SNP23标记为碱基A：A，位置为不结球白菜全基因组序列的第2076877位；

所述SNP24标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第16936641位；

所述SNP25标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第469636位；

所述SNP26标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第8127184位；

所述SNP27标记为碱基A：A，位置为不结球白菜全基因组序列的第18539085位；

所述SNP28标记为碱基T：T，位置为不结球白菜全基因组序列的第11874325位。

本发明还提供了用于扩增所述应用中的鉴定不结球白菜地方品种‘箭杆白’的SNP分子标记集的KASP引物。

进一步的，所述KASP引物由28个KASP引物组合组成，每个KASP引物组合由两条末端碱基不同的等位基因正向引物F1和F2以及一条反向引物R构成。

具体的，所述SNP1标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:1～3的核苷酸序列所示，所述SNP2标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:4～6的核苷酸序列所示，所述SNP3标记对应的KASP引物组合如SEQ IDNO:7～9的核苷酸序列所示，所述SNP4标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:10～12的核苷酸序列所示，所述SNP5标记对应的KASP引物组合如SEQID NO:13～15的核苷酸序列所示，所述SNP6标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:16～18的核苷酸序列所示，所述SNP7标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:19～21的核苷酸序列所示，所述SNP8标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:22～24的核苷酸序列所示，所述SNP9标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:25～27的核苷酸序列所示，所述SNP10标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:28～30的核苷酸序列所示，所述SNP11标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:31～33的核苷酸序列所示，所述SNP12标记对应的KASP引物组合如SEQID NO:34～36的核苷酸序列所示，所述SNP13标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:37～39的核苷酸序列所示，所述SNP14标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:40～42的核苷酸序列所示，所述SNP15标记对应的KASP引物组合如SEQ IDNO:43～45的核苷酸序列所示，所述SNP16标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:46～48的核苷酸序列所示，所述SNP17标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:49～51的核苷酸序列所示，所述SNP18标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:52～54的核苷酸序列所示，所述SNP19标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:55～57的核苷酸序列所示，所述SNP20标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:58～60的核苷酸序列所示，所述SNP21标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:61～63的核苷酸序列所示，所述SNP22标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:64～66的核苷酸序列所示，所述SNP23标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:67～69的核苷酸序列所示，所述SNP24标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:70～72的核苷酸序列所示，所述SNP25标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:73～75的核苷酸序列所示，所述SNP26标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:76～78的核苷酸序列所示，所述SNP27标记对应的KASP引物组合如SEQID NO:79～81的核苷酸序列所示，所述SNP28标记对应的KASP引物组合如SEQ ID NO:82～84的核苷酸序列所示。

本发明还提供了所述SNP分子标记集或所述引物在鉴定不结球白菜地方品种‘箭杆白’中的应用。

优选的，上述应用的具体方法包括：采用所述引物对待检测品种的基因组DNA进行扩增，以28个KASP标记及确定的分型结果为组合，结合不结球白菜地方品种‘箭杆白’的形态特征，作为鉴定标准；所述不结球白菜地方品种‘箭杆白’的形态特征包括：植株直立，株高60-70cm，皱叶，叶片绿色；长椭圆形，叶片长20-30cm，宽10-16cm；叶柄白色，长梗型，扁平，长33-40cm，宽3-4cm，厚0.5-1cm；单株收获叶片数20-25片，单株重1300-1600g；若所述28个分子标记的分型结果完全一致，形态学特征全部满足，则鉴定为不结球白菜‘箭杆白’品种。

通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

本发明结合了不结球白菜地方品种‘箭杆白’的典型形态特征和28个KASP标记的组合及其分型结果作为鉴定标准，能够快速、准确的鉴定‘箭杆白’种质资源，解决了地方品种‘箭杆白’的保护与开发中出现的知识产权纠纷问题。

附图说明

图1为第21841740位KASP标记在47份种质中的多态性图谱。

图2为30940322KASP标记在47份种质中的多态性图谱。

图3为不结球白菜地方品种‘箭杆白’的典型特征图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得到的。

实施例1 KASP标记开发

1.地方品种收集

充分收集本地的‘箭杆白’地方品种4个，田间鉴定后符合‘箭杆白’品种特征特性。收集其它常规种43个，详情见表1。

表1 43个不结球白菜品种名称及来源

注：珍宝和珍奇是自主选育的常规种品种。

2.提纯复壮

开展4～5代的提纯复壮工作，使品种一致性达到要求。

3.KASP标记开发

利用不结球白菜公共数据库信息开发均匀分布的KASP标记80个并合成引物。引物合成由南京集思慧远生物科技有限公司完成。

实施例2 PCR扩增

S1、提取不结球白菜样品的基因组DNA；

S2、以步骤S1中的DNA为模板，采用所述KASP引物进行PCR扩增，并将PCR扩增产物放置在

S3、对步骤S2的实验结果进行分析。

其中，PCR扩增的反应体系如表2所示：

表2 PCR反应体系构建内容

PCR扩增的反应条件如表3所示：

表3 PCR反应条件

如果在上述扩增反应条件下分型结果不理想，可以在步骤3后面增加PCR反应优化步骤，条件如表4。

表4 PCR反应优化条件

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实施例3 KASP标记筛选

利用实施例1所述的80个KASP标记检测47份种质，获得46个多态性符合要求的KASP标记。46个KASP标记在4份‘箭杆白’种质中有28个完全重复，分型结果显示等位基因处于纯合子状态。28个标记全部满足，MAF(次要等位基因频率)值大于0.4，PIC(多态性信息含量)值大于0.4，缺失率小于0.1，杂合率小于0.5。28个KASP标记信息及分型结果见表5。

表5 KASP标记组合信息及分型结果

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注F1：上游分型引物；F2：下游分型引物；R：下游通用引物

实施例4 KASP标记鉴定方法及43份种质检测结果

1.KASP标记鉴定方法

利用所述28个KASP标记及确定的分型结果为组合，作为不结球白菜‘箭杆白’地方品种的鉴定标准。所述不结球白菜地方品种‘箭杆白’的形态特征包括：植株直立，株高60-70cm，皱叶，叶片绿色；长椭圆形，叶片长25-27cm，宽12-14cm；叶柄白色，长梗型，扁平，长35-37cm，宽3.3-3.7cm，厚0.7-0.8cm；单株收获叶片数20-25片，单株重1400-1600g。分型结果相似度越高，同源性越高。若所述28个分子标记的分型结果完全一致，形态学特征全部满足，则鉴定为不结球白菜‘箭杆白’品种。

2.43份种质检测结果

利用上述28个KASP标记多次检测发现，43份种质中的‘马耳朵白菜’和‘小叶白菜’与‘箭杆白’同源程度较高，28个KASP标记分型结果一致。结合田间形态特征对比分析，可以认为‘马耳朵白菜’、‘小叶白菜’两个地方品种与‘箭杆白’属于同种不同名的情况，在地方品种保护与开发过程中应注意。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。