一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法及其应用

摘要

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法及其应用。本发明通过采用施加脂多糖(或脂多糖联合脂联素)的方式并对诱导条件进行筛选优化，从而成功诱导心肌细胞转化为心肌炎症细胞，同时采用差速离心法和超滤法相结合的方式提取细胞培养上清中的外泌体，得到的外泌体提取物具有产量大，纯度高等优点。同时上述技术方案通过优化的脂联素添加浓度和添加时间进一步培养心肌细胞及心肌炎症细胞，使得外泌体的产量和纯度可以获得明显的提高。从而方便后续外泌体内容物以及功能研究的进行，并提供相应的外泌体鉴定方法，为后续研究外泌体在心肌炎症中的作用机制提供方法学基础，因此具有良好的实际应用之价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

外泌体是一种由活细胞产生的直径40-160nm，具有脂质双层膜结构的细胞外囊泡，可广泛存在于多种体液及细胞培养上清中。外泌体内含有核酸、蛋白质及脂质等多种生物活性物质，在细胞间通讯中发挥重要作用。已有研究表明，在多种疾病的病理生理过程中，外泌体的含量及其内容物会有所变化，以促进或抑制疾病进展。近年来，随着对外泌体研究的不断深入，外泌体在动脉粥样硬化、急性心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病中的抗炎、改善心室重构、促进血管新生等作用受到越来越多学者的重视。

心肌炎是由多种病因引起的可危及生命的心肌炎症，可导致心功能障碍以及心律失常等严重后果，但目前心肌炎的发病机制尚不明确，外泌体在心肌炎中是否发挥作用、怎样发挥作用都有待研究。

合适的外泌体提取等纯化方式，对后续其内容物分析及功能研究起到重要的作用，已有学者对内皮细胞、心脏祖细胞等心血管细胞外泌体的收集纯化方式进行研究，但发明人发现，对人心肌细胞以及心肌炎症细胞来源的外泌体的提取及纯化方式尚未见报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法及其应用。本发明通过脂多糖诱导产生心肌炎症细胞，采用差速离心法和超滤法相结合的方式提取细胞培养上清中的外泌体，为后续研究外泌体在心肌炎症中的作用机制提供方法学基础。基于上述研究成果，从而完成本发明。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法，所述方法包括：

S1、培养心肌细胞并诱导产生心肌炎症细胞；

S2、诱导成功心肌炎症细胞继续培养并收集培养基，离心，得上清液I；

S3、将步骤S2获得的上清液I进行高速离心，收集得上清液II；

S4、将S3中收集的上清液II经滤器过滤至超速离心管中，超速离心，离心后所得沉淀即为外泌体。

本发明中采用差速离心法和超滤法相结合的方式提取细胞培养上清中的外泌体，所得外泌体纯度高，杂质少，方便后续外泌体内容物以及功能研究的进行。

此外，需要说明的是，上述提取方法中虽然以脂多糖诱导获得的心肌炎症细胞为例，对外泌体细胞提取进行了具体描述，但是上述提取方法对提取正常心肌细胞的外泌体同样适用，区别仅在于没有使用脂多糖诱导获得的心肌炎症细胞的步骤。

本发明的第二个方面，提供上述心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体的提取方法提取制得的外泌体。

本发明的第三个方面，提供上述外泌体在心血管相关疾病基础研究和临床诊治中的应用。

与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：

上述技术方案报道一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法，通过采用施加脂多糖(或脂多糖联合脂联素)的方式并对诱导条件进行筛选优化，从而成功诱导心肌细胞转化为心肌炎症细胞，同时采用差速离心法和超滤法相结合的方式提取细胞培养上清中的外泌体，得到的外泌体提取物具有产量大，纯度高等优点。

上述技术方案通过优化的脂联素添加浓度和添加时间进一步培养心肌细胞及心肌炎症细胞，使得外泌体的产量和纯度可以获得明显的提高。从而方便后续外泌体内容物以及功能研究的进行，并提供相应的外泌体鉴定方法，为后续研究外泌体在心肌炎症中的作用机制提供方法学基础，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中各刺激条件下外泌体粒子浓度图。

图2为本发明实施例1中心肌细胞和心肌炎症细胞培养情况观察图；其中，A为饥饿处理前心肌细胞生长情况观察图；B为饥饿8小时后心肌细胞生长情况；C为加入PBS的对照组心肌细胞；D为加LPS刺激30小时后的心肌炎症细胞。图3为本发明实施例1中透射电镜观察外泌体的代表图；其中，A为对照组外泌体电镜下形态，B为炎症组外泌体电镜下形态。

图4为本发明实施例1中外泌体粒径分布统计图；其中，A为对照组外泌体粒径分布统计图，B为炎症组外泌体粒径分布统计图。

图5为本发明实施例1中外泌体特异性蛋白CD63和TSG101、Calnexin的Western检测代表图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，合适的外泌体提取等纯化方式，对后续其内容物分析及功能研究起到重要的作用，已有学者对内皮细胞、心脏祖细胞等心血管细胞外泌体的收集纯化方式进行研究，但对人心肌细胞以及心肌炎症细胞来源的外泌体的提取及纯化方式尚未见报道。

有鉴于此，本发明的一种典型具体实施方式中，提供一种心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体提取方法，所述方法包括：

S1、培养心肌细胞并诱导产生心肌炎症细胞；其中，诱导产生心肌炎症细胞的方法包括加入10-20μg/ml脂多糖培养24-48h诱导产生心肌炎症细胞；并在脂多糖加入后的0-8小时加入10-25ng/ml的脂联素；

S2、诱导成功心肌炎症细胞继续培养并收集培养基，离心，得上清液I；

S3、将步骤S2获得的上清液I进行高速离心，收集得上清液II；

S4、将S3中收集的上清液II经滤器过滤至超速离心管中，超速离心，离心后所得沉淀即为外泌体。

本发明的又一具体实施方式中，

所述步骤S1中，所述心肌细胞为AC16心肌细胞，其是一种从正常人类心室组织中分离出来并做永生化处理的心肌细胞系；

所述步骤S1具体方法包括：培养心肌细胞的具体方法包括：选用含有10％胎牛血清的完全培养基对心肌细胞进行培养，其培养条件为：30-40℃，3-8％CO

同时，为防止胎牛血清中原有外泌体对提取方法的干扰，需要使用去除外泌体的胎牛血清培养细胞。去除外泌体的胎牛血清制备条件：血清与培养基1：4混合后，4℃100000g离心18个小时。

本发明中选用的脂多糖(LPS)，其是革兰氏阴性杆菌细胞壁中的一种内毒素，感染后LPS可直接对受体细胞产生损害，或可作为重要的抗原分子被抗原递呈细胞(apc)捕获从而引起机体的免疫反应，采用LPS诱导产生心肌炎症细胞，一方面可以评估其对心肌细胞的直接影响，另一方面可获得心肌细胞在感染后产生的信号分子，对炎症过程中细胞间的信息传递、信号交流进行研究。在加入脂多糖时，对脂多糖加入浓度和加入时间进行优化，从而控制凋亡细胞的凋亡比例，经试验证明，20μg/ml的LPS浓度诱导30小时的刺激条件，为最理想的心肌炎症细胞外泌体提取条件。而脂联素作为一种心脏保护因子，可以通过调节AMPK等信号通路，在免疫调节及抗炎作用中发挥一定的作用。因此发明人推测，在炎症细胞培养过程中加入脂联素，会促进细胞外泌体的产生，然而，本发明通过研究发现，脂联素的加入时间对外泌体加入量会产生显著影响，在20μg/ml LPS刺激心肌细胞后2小时加入15ng/ml脂联素，产生的外泌体总量显著少于其他时间段，而在LPS刺激心肌细胞后4-6小时加入15ng/ml脂联素，产生外泌体最多。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，具体离心方法包括：将收集到的培养基在低温(如4℃)200-500g(优选为300g)离心5-20min(优选为10min)，从而用于去除培养基中的悬浮细胞，然后在低温(如4℃)1500-2500g(优选为2000g)离心5-20(优选为10min)，去除死细胞，收取获得上清液I；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3中，具体高速离心方法包括：在低温(如4℃)8000-10000g离心20-50分钟(优选为30分钟)，从而进一步去除细胞碎片；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S4具体方法包括：将收集到的上清液II经0.22μm滤膜过滤至超速离心管中，去除上清中直径大于0.22μm的大分子物质，将滤液于低温(如4℃)90000-120000g(优选为100000g)超速离心60-80min(优选70min)，弃去上清液，留0.5-1mL液体，吹打混匀后，将多个离心管内液体收集于同一离心管内，以便对相同来源的外泌体进行富集，在低温(如4℃)90000-120000g(优选为100000g)再次超速离心60-80min(优选70min)，所得沉淀即为外泌体。

本发明中采用差速离心法和超滤法相结合的方式提取细胞培养上清中的外泌体，所得外泌体纯度高，杂质少，方便后续外泌体内容物以及功能研究的进行。

此外，需要说明的是，上述提取方法中虽然以脂多糖诱导获得的心肌炎症细胞为例，对外泌体细胞提取进行了具体描述，但是上述提取方法对提取正常的心肌细胞的外泌体同样适用，区别仅在于没有使用脂多糖(或脂多糖联合脂联素)诱导获得的心肌炎症细胞的步骤。

本发明的又一具体实施方式中，本发明提取方法还包括对获得心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体进行鉴定的步骤，所述鉴定的步骤包括但不限于采用透射电镜对所提取外泌体的形态进行评估、采用Western blot对外泌体表面标志蛋白CD63、TSG101进行验证以及采用纳米颗粒跟踪分析技术对所得外泌体大小以及数量进行评估。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体的提取方法提取制得的外泌体。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述外泌体在心血管相关疾病基础研究和临床诊治中的应用。

以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。

实施例1心肌细胞及心肌炎症细胞外泌体外泌体提取方法(一)预实验筛选心肌炎症细胞外泌体提取的最佳刺激条件

10μg/ml、20μg/ml浓度的脂多糖(LPS)刺激24-48小时均可诱导产生心肌炎症细胞模型，故本实验设计10μg/ml、20μg/ml两个浓度梯度，24、30、36、42、48五个时间梯度，共10组分别培养并诱导产生炎症细胞模型，分别如下标记：24-1(10μg/ml LPS浓度诱导24小时)、24-2(20μg/ml LPS浓度诱导24小时)、30-1(10μg/ml LPS浓度诱导30小时)、30-2(20μg/ml LPS浓度诱导30小时)、36-1(10μg/ml LPS浓度诱导36小时)、36-2(20μg/ml LPS浓度诱导36小时)、42-1(10μg/ml LPS浓度诱导42小时)、42-2(20μg/ml LPS浓度诱导42小时)、48-1(10μg/ml LPS浓度诱导48小时)、48-2(20μg/ml LPS浓度诱导48小时)。流式细胞术检测细胞凋亡百分比，结果如下：24-1凋亡细胞占比6.3％、24-2凋亡细胞占比7.8％、30-1凋亡细胞占比8％、30-2凋亡细胞占比7.8％、36-1凋亡细胞占比8.3％、36-2凋亡细胞占比19.8％、42-1凋亡细胞占比15.5％、42-2凋亡细胞占比20％、48-1凋亡细胞占比17.6％、48-2凋亡细胞占比22％。筛选凋亡百分比小于10％的培养条件，有五种培养条件入选，分别是24-1、24-2、30-1、30-2、36-1，按上述五种诱导条件分别诱导产生心肌炎症细胞，各收集100ml培养上清，差速离心法提取外泌体，NTA检测外泌体粒子浓度，结果表1，结合细胞培养凋亡细胞占比，可得出在20μg/ml LPS浓度诱导30小时的刺激条件，为最理想的心肌炎症细胞外泌体提取条件。

(二)培养心肌细胞并诱导产生心肌炎症细胞

人心肌细胞(AC16细胞，一种从正常人类心室组织中分离出来并做永生化处理的心肌细胞系，购买于上海中乔新舟生物科技有限公司)培养于T75细胞(Corning Inc)培养瓶内，用含有10％胎牛血清+DMEM高糖培养基培养，培养于37℃、5％CO

(三)、外泌体收集

加入LPS培养30小时后，细胞生长情况参见图2C、2D，其中图2C为对照组细胞生长状况，图2D为LPS刺激组细胞生长状况，收集培养基，炎症组及对照组各收取150mL培养基，4℃300g离心10min，去除培养基中的悬浮细胞；4℃2000g离心10min，去除死细胞，收取上清液；4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片，小心收集上清液。

将收集到的上清液经0.22μm滤膜过滤至超速离心管中，去除上清中直径大于0.22μm的大分子物质，将滤液于4℃100000g超速离心70min，小心弃去上清液，留0.5-1mL液体，吹打混匀后，将多个离心管内液体收集于同一离心管内，以便对相同来源的外泌体进行富集，4℃100000g再次超速离心70min，所得沉淀即为外泌体。

用200μl PBS重悬外泌体，4℃短期保存或-80℃长期保存。

(四)、外泌体鉴定

采用透射电镜观察所提取外泌体形态，图3为透射电镜观察到的外泌体的大小和形态结果。其中图3A为正常对照组心肌细胞来源的外泌体，图3B为心肌炎症细胞来源的外泌体。外泌体透射电镜结果显示，外泌体大小在40-160nm之间，囊膜状的超微结构清晰可见，符合外泌体的形态特征。

采用纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)测定外泌体数量及粒径大小，ZataView8.04.02软件分析外泌体颗粒浓度和粒径分布。图4A粒径统计分析得出对照组平均粒径为144.2±1.82nm，图4B粒径统计分析得出LPS炎症刺激组外泌体的平均粒径为137.8±0.57nm。

采用Western blotting检测外泌体表特异性蛋白CD63、TSG101的表达情况。首先用RIPA提取总蛋白，经10％SDDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭后，分别加入一抗1:2000(抗CD63单克隆抗体、抗TSG101单克隆抗体、抗Calnexin单克隆抗体(Abcam Co.)4℃摇床过夜孵育，辣根过氧化酶标记的二抗(山羊抗兔IgG多克隆抗体)1:5000(Abcam Co.)，室温孵育2小时，TBST漂洗后ECL检测、曝光、显影，结果参照图5。

表1实施例1中各刺激条件下外泌体粒子浓度(粒子/ml)及凋亡细胞占比(％)

实施例2

培养心肌细胞并诱导产生心肌炎症细胞

人心肌细胞(AC16细胞，一种从正常人类心室组织中分离出来并做永生化处理的心肌细胞系，购买于上海中乔新舟生物科技有限公司)培养于T75细胞(Corning Inc)培养瓶内，用含有10％胎牛血清+DMEM高糖培养基培养，培养于37℃、5％CO

实施例3

与实施例2的不同之处在于，脂联素的浓度不同，本实施例中同时加入的脂联素浓度为15ng/ml。

实施例4

与实施例2的不同之处在于，脂联素的浓度不同，本实施例中同时加入的脂联素浓度为20ng/ml。

实施例5

与实施例2的不同之处在于，脂联素的浓度不同，本实施例中同时加入的脂联素浓度为25ng/ml。

表2各实施例炎症组的外泌体粒子浓度(粒子/ml)和主峰粒子大小(nm)

由实施例1-5可以可知，加入脂联素后，有利于提高炎症组的心肌炎细胞的外泌体产量，粒子浓度得到提高，其中以加入15ng/ml的脂联素(即实施例3)外泌体产量最高。

实施例6

为进一步探讨脂联素加入的时间是否会对炎症心肌细胞外泌体分泌产生影响，分别于加入20μg/ml LPS刺激后0小时(即实施例3)、2小时、4小时、6小时、8小时加入15ng/ml的脂联素，结果如表3所示，不同时间段加入脂联素均可增加炎症心肌细胞外泌体的产生数量，然而我们发现在LPS刺激2小时后加入脂联素，炎症细胞产生的外泌体数量较其组别明显减少。已有研究表明，脂联素作为一种心脏保护因子，可以通过调节AMPK等信号通路，在免疫调节及抗炎作用中发挥一定的作用。因此我们推测，在炎症细胞培养过程中加入脂联素，会促进细胞外泌体的产生，同时减轻细胞炎症水平，当LPS刺激炎症产生2小时后加入脂联素，抗炎作用最强，细胞炎症减轻，因正常细胞与炎症细胞相比产生的外泌体的数量明显减少，所以在LPS刺激心肌细胞后2小时加入脂联素，产生的外泌体总量会较其他组减少。

表3不同时间段添加15ng/ml的脂联素，所得炎症组的外泌体粒子浓度(粒子/ml)和主峰粒子大小(nm)

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。