小麦品质标记Gli-γ1-I及应用

摘要

本发明公开了小麦品质标记Gli‑γ1‑I及应用。本发明提供了小麦1D染色体上如下SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测小麦1D染色体上如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测小麦品质中的应用；所述SNP位点位于小麦1D染色体上TraesFLD1D01G005600(Gli‑γ1‑1D)ATG下游511bp处；所述SNP位点处的核苷酸为C或T。本发明优质小麦育种提供分子标记，用于筛选、创制优质材料；同时丰富小麦品质育种分子标记，有效提升育种效率，解决品质育种过程中由于种子量少，无法进行品质分析导致的品质育种效率低的难题，实现品质育种早代分子标记辅助选择，提高育种准确性和目的性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及小麦品质标记Gli-γ1-I及应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivumL.)是世界上被广泛种植的农作物之一，为人类提供丰富的养分和蛋白质。面筋赋予了面团的弹性和延展性，是小麦粉品质的主要决定因素，决定了小麦粉的用途。弹性好的小麦粉，即强筋小麦粉适合制作面包，而弹力小，延展性好的面粉，即弱筋小麦粉，适合制作饼干。面筋由谷蛋白和醇溶蛋白组成。麦谷蛋白由高分子量谷蛋白亚基和低分子量谷蛋白亚基组成，它们通过分子间二硫键形成面筋聚合物。醇溶蛋白通过与谷蛋白的相互作用影响面团的粘度，一般认为与面团延展性密切相关。根据氨基酸一级结构的不同将醇溶蛋白分为α/β-，γ-，ω-醇溶蛋白和δ-醇溶蛋白4类。

目前谷蛋白对品质的贡献研究的相对清楚。编码高分子量谷蛋白的基因位于小麦基因组的第一同源群的A、B、D染色体长臂上，由复等位基因控制，两个基因在同一条染色体上连锁遗传。在普通小麦的基因组上，编码HMW-GS的基因分别位于Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点，每个位点编码两个HMW-GS的亚基，按照分子量大小分为x、y亚基。其中x亚基分子量较大，y亚基分子量较小。由于小麦中存在基因沉默现象，在大部分栽培小麦中Glu-Ay通常处于沉默状态，Glu-By有时也不能表达。因此普通栽培小麦种中只有4个或者5个HMW-GS亚基表达。高分子量优质亚基为1Ax2*、Bx14+By15、Bx17+By18、Dx5+Dy10，这些HWM-GS对烘焙品质起到了正向作用，而Dx2+Dy12对烘焙品质起到了负调作用，但籽粒蛋白含量超过15％时，这些因素对烘焙品质的影响会减弱。研究表明，当在总蛋白含量不变的情况下，如果提高Glu/Gli的比例，将会增加面团形成时间、揉面峰值阻力、最大抗延阻力和面包体积，面团的延展性减弱；当Glu/Gli的比例不变时，增加总蛋白含量，仍然可以增加面筋强度和面包体积。由于醇溶蛋白家族成员众多，在已经公布基因组序列的‘中国春’的参考基因组中共鉴定到29个α-醇溶蛋白、18个γ-醇溶蛋白和10个ω-醇溶蛋白。醇溶蛋白成簇分布，几乎全部的醇溶蛋白由位于小麦第一同源群的1号和6号染色体上的Gli-1和Gli-2基因座位编码，其中Gli-1位点编码ω-醇溶蛋白和γ-醇溶蛋白，Gli-2位点编码α/β-醇溶蛋白。同时醇溶蛋白在自然界中变异丰富，已经从不同的小麦中鉴定出1,200多个α-醇溶蛋白序列和400个γ-醇溶蛋白序列。醇溶蛋白编码基因结构复杂，存在大量的基因间重复序列和基因内重复序列，导致部分醇溶蛋白编码基因无法通过sanger测序及高通量短读长测序获得DNA序列，目前中国春参考基因组及10+泛基因组中醇溶蛋白编码位置，存在大量的未测通(gap)区域。因此具体某个醇溶蛋白亚基对品质的贡献尚不清楚，醇溶蛋白基因的分子标记辅助育种在小麦中的应用受到了限制。

目前，品质分析的主要指标为面包的体积、面团流变学分析、面筋指数及SDS沉降值。由于制作面包需要至少1000g面粉，流变学分析单次需要50g以上的面粉，面筋指数需要10g以上的面粉，因此需要的材料相对较多，且耗时长，不利于批量、快速的进行品质分析。上述因素也导致在育种中，品质分析无法在育种早代进行选择，增加了育种的不确定性，导致品质育种工作量大，SDS沉降值单次仅需要2g全麦粉，且测定快速，目前是稳定、快速的小麦品质检测指标。

前人研究表明，醇溶蛋白与小麦品质密切相关。例如，在小麦面粉中添加γ-醇溶蛋白会缩短面团的稳定时间和抗拉伸能力，导致面团面筋强度下降。同时，当成簇的α型醇溶蛋白编码基因缺失，可以提升小麦面粉的品质。目前通过RNAi及基因编辑技术降低醇溶蛋白表达或者删除醇溶蛋白，得到多种表型变化。通过RNAi，靶向降低ω-1,ω-2及ω-5编码基因的表达，能够提升面筋含量及面筋强度；同时，通过RNAi降低γ型醇溶蛋白的表达，却没有对品质产生可见的影响。通过RNAi及基因表达降低α型醇溶蛋白，部分转基因株系品质上升，但是部分转基因株系品质下降。因此，醇溶蛋白与品质密切相关，转基因后代由于脱靶等问题，可能产生不同的品质表型变化，需要通过关联分析等手段研究醇溶蛋白序列对品质的贡献，从而开发分子标记，服务于传统育种。

发明内容

本发明的目的是提供小麦品质标记Gli-γ1-I及应用。

第一方面，本发明要求保护小麦1D染色体上如下SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测小麦1D染色体上如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测小麦品质中的应用；

所述SNP位点位于小麦1D染色体上TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)ATG下游511bp处(对应于SEQ ID No.16的第20位)；所述SNP位点处的核苷酸为C或T。

进一步地，用于检测小麦1D染色体上所述SNP位点的单核苷酸多态性的物质为后文第二方面中所述的KASP引物或后文第三方面中所述的试剂或试剂盒。

第二方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦品质的KASP引物。

本发明所要求保护的所述KASP引物由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为标签序列A和SEQ ID No.1的第22-41位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为标签序列B和SEQ ID No.2的第22-41位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。

进一步地，所述标签序列A的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位；所述标签序列B的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-21位。

更进一步地，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。

第三方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定小麦品质的试剂或试剂盒。

本发明所要求保护的用于鉴定或辅助鉴定小麦品质的试剂或试剂盒中含有前文第二方面中所述的KASP引物。

进一步地，所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。

所述荧光探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。

所述荧光探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。

在本发明的具体实施方式中，所述荧光基团A为HEX；所述荧光基团B为FAM；所述淬灭基团为BHQ。

第四方面，本发明要求保护前文第二方面中所述的KASP引物或前文第三方面中所述的试剂或试剂盒在如下任一中的应用：

(A1)鉴定或辅助鉴定小麦品质；

(A2)比较待测小麦的品质高低；

(A3)选育品质相对较好的小麦单株或株系或品系或品种；

(A4)小麦育种，如优质小麦育种。

第五方面，本发明要求保护成套蛋白或成套核酸分子在如下任一中的应用：

(A1)鉴定或辅助鉴定小麦品质；

(A2)比较待测小麦的品质高低；

(A3)选育品质相对较好的小麦单株或株系或品系或品种；

(A4)小麦育种，如优质小麦育种。

所述成套蛋白由SEQ ID No.4所示蛋白质(Gli-γ1-I蛋白)和SEQ ID No.5所示蛋白质(Gli-γ1-II蛋白)组成。

所述成套核酸分子由SEQ ID No.8所示DNA分子(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-I)、SEQ ID No.12所示DNA分子(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-V)、SEQ ID No.9所示DNA分子(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-II)、SEQ ID No.10所示DNA分子(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-III)、SEQ ID No.11所示DNA分子(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-IV)和SEQ ID No.13所示DNA分子(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-VI)。

第六方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法I：一种比较待测小麦的品质高低的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的1D染色体上如下SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，根据所述待测小麦的基因型按照如下确定所述待测小麦的品质：C:C基因型的所述待测小麦的品质高于或候选高于T:T基因型的所述待测小麦的品质。

其中，所述待测小麦为Gli-γ1-I类型或者Gli-γ1-II类型。

方法II：一种选育品质相对较好的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的1D染色体上如下SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型，选择1D染色体上所述SNP位点为C:C基因型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择1D染色体上所述SNP位点为C:C基因型的小麦，最终获得品质相对较好的小麦单株或株系或品系或品种。

其中，所述待测小麦为Gli-γ1-I类型或者Gli-γ1-II类型。

在上述各方法中，所述SNP位点位于小麦1D染色体上TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)ATG下游511bp处(对应于SEQ ID No.16的第20位)；所述SNP位点处的核苷酸为C或T；

所述C:C基因型为在小麦1D染色体上TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)ATG下游511bp处(对应于SEQ ID No.16的第20位)为C的纯合型；

所述T:T基因型为在小麦1D染色体上TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)ATG下游511bp处(对应于SEQ ID No.16的第20位)为T的纯合型。

另外，除了所述C:C基因型、所述T:T基因型，理论上还存在C:T基因型。所述C:T基因型为在小麦1D染色体上TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)ATG下游511bp处(对应于SEQID No.16的第20位)为C和T的杂合型。

在上述各方法中，所述“检测待测小麦的1D染色体上如下SNP位点处的核苷酸，确定所述待测小麦的基因型”按照包括如下步骤的方法进行：利用前文第三方面中所述的试剂或试剂盒对所述待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测小麦的1D染色体上所述SNP位点的基因型：

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光基团A的信号，则所述待测小麦的所述SNP位点为所述C:C基因型；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光基团B的信号，则所述待测小麦的所述SNP位点为所述T:T基因型。

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号为所述荧光基团A和所述荧光基团B的信号，则所述待测小麦的所述SNP位点为所述C:T基因型。

第七方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法III：一种比较待测小麦的品质高低的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的Gli-γ1类型，根据所述待测小麦的Gli-γ1类型按照如下确定所述待测小麦的品质：Gli-γ1-I类型的所述待测小麦的品质高于或候选高于Gli-γ1-II类型的所述待测小麦的品质。

其中，所述待测小麦为Gli-γ1-I类型或者Gli-γ1-II类型。

方法IV：一种选育品质相对较好的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的Gli-γ1类型，选择Gli-γ1-I类型的所述待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择Gli-γ1-I类型的小麦，最终获得品质相对较好的小麦单株或株系或品系或品种。

其中，所述待测小麦为Gli-γ1-I类型或者Gli-γ1-II类型。

所述Gli-γ1-I类型是指在小麦1D染色体上含有SEQ ID No.4所示蛋白质(Gli-γ1-I蛋白)的编码基因(纯合)；对应前文所述的C:C基因型。

所述Gli-γ1-II类型是指在小麦1D染色体上含有SEQ ID No.5所示蛋白质(Gli-γ1-II蛋白)的编码基因(纯合)；对应前文所述的T:T基因型。

所述Gli-γ1类型除了包括所述Gli-γ1-I类型、所述Gli-γ1-II类型外，还包括Gli-γ1-III类型和Gli-γ1-IV类型。

所述Gli-γ1-III类型是指在小麦1D染色体上含有SEQ ID No.6所示蛋白质(Gli-γ1-III蛋白)的编码基因(纯合)。

所述Gli-γ1-IV类型是指在小麦1D染色体上含有SEQ ID No.7所示蛋白质(Gli-γ1-IV蛋白)的编码基因(纯合)。

进一步地，所述SEQ ID No.4所示蛋白质(Gli-γ1-I蛋白)的编码基因如SEQ IDNo.8(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-I)或SEQ ID No.12(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-V)所示。

进一步地，所述SEQ ID No.5所示蛋白质(Gli-γ1-II蛋白)的编码基因如SEQ IDNo.9(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-II)、SEQ ID No.10(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-III)、SEQ ID No.11(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-IV)或SEQ ID No.13(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-VI)所示。

进一步地，所述SEQ ID No.6所示蛋白质(Gli-γ1-III蛋白)的编码基因如SEQ IDNo.14(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-VII)所示。

进一步地，所述SEQ ID No.7所示蛋白质(Gli-γ1-IV蛋白)的编码基因如SEQ IDNo.15(对应实施例中的TraesFLD1D01G005600-VIII)所示。

在上述各方面中，所述小麦的基因型为前文所述C:C基因型或前文所述T：T基因型。或者，所述小麦为前文所述Gli-γ1-I类型或前文所述Gli-γ1-II类型。

在本发明中，所述小麦品质是通过SDS沉降值体现的。SDS沉降值越高说明小麦品质越好。

在本发明的具体实施方式中，所述小麦为高分子谷蛋白亚基为“1Ax null，Bx7+By8，Dx2+Dy12”或者“1Ax，1Bx7+1By8，1Dx2+1Dy12”的品种。进一步地，所述小麦为非1B1R异位系。

本发明的有益效果：为优质小麦育种提供分子标记，用于筛选、创制优质材料；同时丰富小麦品质育种分子标记，有效提升育种效率，解决品质育种过程中由于种子量少，无法进行品质分析导致的品质育种效率低的难题，实现品质育种早代分子标记辅助选择，提高育种准确性和目的性。

附图说明

图1为TraesFLD1D01G005600基因编辑。a为TraesFLD1D01G005600基因编辑。该基因在sgRNA位置发生了碱基插入，导入了氨基酸移码突变，造成基因功能丧失。b为TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)编码Gli-γ1。通过A-PAGE电泳技术鉴定醇溶蛋白变化，发现TraesFLD1D01G005600突变系中，Gli-γ1条带缺失，认为Gli-γ1主要由TraesFLD1D01G005600编码。

图2为TraesFLD1D01G005600单倍型。

图3为Gli-γ1的4种氨基酸序列差异。a为氨基酸序列比对。b为序列差异位置。

图4为Gli-γ1-I和Gli-γ1-II农家种、育种品种、优质品种中的分布。

图5为Gli-γ1-I和Gli-γ1-II品质分析。高分子谷蛋白亚基背景：1A-null，1Bx7+1By8,1Dx2+1Dy12。

图6为Gli-γ1-I分子标记开发。a为KASP标记位置。利用511bp的SNP设计KASP引物用于区分Gli-γ1-I和Gli-γ1-II。b为KASP标记检测。使用40份携带Gli-γ1-I和40份携带Gli-γ1-II材料进行验证，开发的标记能有高效的区分2种单倍型。c为藏1817和农大3331构建的RIL群体验证标记的可靠性。农大3331携带Gli-γ1-I，藏1817携带Gli-γ1-II，使用非1B1R，高分子谷蛋白亚基为1Ax，1Bx7+1By8，1Dx2+1Dy12为背景的后代进行验证。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.DNA提取

使用CTAB法提取DNA。具体操作如下：

(1)选取苗期幼嫩叶片，放置于装有钢珠的圆底2.0mL离心管中。

(2)将样品管置于液氮中速冻，直至液氮沸腾状消失。

(3)将冷冻的样品管置于研磨机配备的研磨盒中(研磨盒液氮预冷)，进行研磨。

(4)在研磨好的样品加入600μL 2×CTAB(SL2071-500 mL,Coolaber，北京，中国)，60℃水浴40min，期间每10min颠倒混匀一次。

(5)在通风橱内加入600μL氯仿，颠倒混匀，静置10min后，12000rpm，室温离心10min。

(6)吸取上清600μL置于新的1.5mL的离心管中，并在离心管中加入600μL异丙醇，颠倒混匀，置于-20℃过夜沉淀DNA。

(7)12000rpm，4℃离心5min。

(8)加入1mL 75％乙醇，12000rpm，4℃离心5min，倒掉上清，洗涤DNA，重复一次。

(9)过夜吹干DNA。

(10)加入100μL ddH

2.SDS分析

参照马传喜等介绍的方法，用2g面粉测定微量SDS沉降值，具体步骤如下：

试剂配制：

溴酚蓝母液(1L)：1g溴酚蓝溶于1L去离子水。

溴酚蓝工作液(1L)：10ml溴酚蓝母液+990ml去离子水。

乳酸水溶液：100ml 85％乳酸(沪试，30108518)加水800ml，回流6h以上。

10％ SDS(1L)：400ml去离子水+100g SDS，混匀，60℃溶解，定容到1L。

1：50乳酸-SDS工作液(1L)：20ml乳酸水溶液+200ml 10％SDS+800ml去离子水。

(1)称取面粉样品2g±0.01g，于35mL带塞量筒中(三次重复)；

(2)加入16.7mL的溴酚蓝工作，加上塞子。将面粉与溶液混匀，放到沉淀值测定仪上(频率13)摇匀5min；

(3)取下量筒，加入16.7mL 1：50乳酸-SDS工作液，盖上塞子，上下颠倒混匀，将量筒放置于摇床上(频率13)震荡5min；

(4)从摇床上取下量筒，立即将其竖立在水平桌面上，静置5min，迅速读取沉淀物体积，即为微量SDS-沉降值，读数估计至0.1mL。

3.KASP标记开发

位于Gli-γ1-1D基因ATG下游511bp一个碱基差异被用于开发KASP标记用于区分Gli-γ1-I和Gli-γ1-II。

使用96孔PCR板建立8μL反应体系：DNA模板50ng；HiGeno 2×Probe MixA 4μL；引物1μL(0.12μM上游引物F1，0.12μM上游引物F2，30μM下游引物R)；ddH

通过降落PCR程序进行扩增：95℃10min；95℃20sec，65-55℃每个循环降低0.6℃，共10个循环；95℃20sec，55℃40sec，32个循环。

通过CFX96实时定量PCR仪读取荧光信号(Bio-Rad,Hercules,California,USA)。

通过BIO-RAD CFX Maestro原件转化荧光信号为基因型。根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇和荧光类型确定待测小麦1D染色体上本发明SNP位点的基因型(即小麦1D染色体上TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)ATG下游511bp处(对应于SEQ ID No.16的第20位)处的碱基为C还是T)：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析靠近Y轴(HEX信号)，则待测小麦1D染色体上本发明SNP位点的基因型为C：C(即小麦1D染色体上TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)ATG下游511bp处(对应于SEQ ID No.16的第20位)处的碱基为C：C纯合)；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析靠近X轴(FAM信号)，则待测小麦1D染色体上本发明SNP位点的基因型为T:T(即小麦1D染色体上TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)ATG下游511bp处(对应于SEQ ID No.16的第20位)的碱基为T:T纯合)。

实施例1、小麦品质标记Gli-γ1-I及应用

一、TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)编码Gli-γ1

通过醇溶蛋白序列比对，设计特异sgRNA，并递送到小麦受体Fielder中。经过筛选，我们到了一个TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)发生碱基插入，其它γ型醇溶蛋白编码基因未发生改变的材料(图1中a)。A-PAGE电泳发现，该材料中的Gli-γ1带谱消失，其余醇溶蛋白带谱无明显变化(图1中b)。说明TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)编码Gli-γ1。

二、Gli-γ1-I为优异等位变异，可用于品质育种

通过包含育成品种和农家种的181份自然群体进行TraesFLD1D01G005600(Gli-γ1-1D)测序，共得到8种DNA序列，标记为TraesFLD1D01G005600-I(SEQ ID No.8)、TraesFLD1D01G005600-II(SEQ ID No.9)、TraesFLD1D01G005600-III(SEQ ID No.10)、TraesFLD1D01G005600-IV(SEQ ID No.11)、TraesFLD1D01G005600-V(SEQ ID No.12)、TraesFLD1D01G005600-VI(SEQ ID No.13)、TraesFLD1D01G005600-VII(SEQ ID No.14)、TraesFLD1D01G005600-VIII(SEQ ID No.15)。由于转录过程中第三位密码子的摆动性，8种DNA序列共编码4种氨基酸序列。其中TraesFLD1D01G005600-I和TraesFLD1D01G005600-V编码Gli-γ1-I(SEQ ID No.4)，TraesFLD1D01G005600-II、TraesFLD1D01G005600-III、TraesFLD1D01G005600-IV、TraesFLD1D01G005600-VI编码Gli-γ1-II(SEQ ID No.5)，TraesFLD1D01G005600-VII编码Gli-γ1-III(SEQ ID No.6)、TraesFLD1D01G005600-VIII编码Gli-γ1-IV(SEQ ID No.7)(图2)。序列分析发现，4种氨基酸主要在Gli-γ1的重复区及polyQ结构域内存在序列差异(图3)

在181份测序材料中，我们发现仅1份材料为Gli-γ1-III，2份材料为Gli-γ1-IV。说明Gli-γ1-III和Gli-γ1-IV不是主要Gli-γ1在181份材料中的主要类型。进一步研究发现，113份材料为Gli-γ1-I，占总测试材料的62.4％，65份材料为Gli-γ1-II，占总测序材料的35.9％。说明Gli-γ1-I和Gli-γ1-II为主要的存在形式(表1和表2)。

表1、181份小麦自然群体的单倍型

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表2、TraesFLD1D01G005600序列信息

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我们对Gli-γ1-I型和Gli-γ1-II型序列分析发现，其中Gli-γ1-I在育成品种中比例高于农家种中，推测在育种过程中对该基因型进行了选择，可能为品质的优异的单倍型(图4)。由于高分子量谷蛋白亚基对品质起重要的存在，尤其是不同高分子谷蛋白亚基组成，能够对烘焙品质产生重要影响。例如Dx5和Dy10为优质亚基，对烘焙品质起到了正向作用；Dx2和Dy12为非优质亚基，对烘焙品质起到了负向作用。因此，为了排除不同高分子量谷蛋白亚基对品质的贡献差异，我们使用1Ax null，Bx7+By8，Dx2+Dy12高分子量谷蛋白亚基背景的材料进行Gli-γ1-I和Gli-γ1-II的品质分析。同时，由于1B1R异位系严重影响品质，因此选择非1B1R异位系进行分析。发现Gli-γ1-I的SDS沉降值显著高于Gli-γ1-II(P<0.05)，说明Gli-γ1-I为优异的单倍型(图5和表3)。

表3、在自然群体中Gli-γ1-I的SDS沉降值显著高于Gli-γ1-II

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注：表中DX2代表Dx2+Dy12，Dx2和Dy12连锁。

我们通过分析Gli-γ1-I型和Gli-γ1-II型的DNA序列发现，在511bp处存在单核苷酸多态性。据此我们开发1组KASP分子标记，用于区分Gli-γ1-I和Gli-γ1-II(图6中a)。

KASP上游引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCCCCAACAACAACGG

KASP上游引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTCCCCCAACAACAACGG

KASP下游引物R：5’-ATTATTGACCAGAGGGATGACACC-3’(SEQ ID No.3)。

两条上游引物的3’末端最后一个碱基对应该SNP位点。该SNP位点在小麦1D染色体上对应SEQ ID No.16的第20位；所述SNP位点处的核苷酸为C或T(在SEQ IDNo.16中用Y表示)。

上游引物F1用于扩增小麦1D染色体上所述SNP位点处核苷酸为C的情况，上游引物F2用于扩增小麦1D染色体上所述SNP位点处核苷酸为T的情况；下游引物R为通用引物。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦1D染色体上所述SNP位点处核苷酸为C:C纯合型(即小麦1D染色体上SEQ IDNo.16的第20位处碱基为C:C纯合)的片段。理论扩增产物(不含特异荧光标签序列)的序列如SEQ IDNo.16(第20位为C)所示。

上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增小麦1D染色体上所述SNP位点处核苷酸为T:T纯合型(即小麦1D染色体上SEQ IDNo.16的第20位处碱基为T:T纯合)的片段。理论扩增产物(不含特异荧光标签序列)的序列如SEQ IDNo.16(第20位为T)所示。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ IDNo.3所示的单链DNA分子扩增小麦1D染色体上所述SNP位点处核苷酸为C:T杂合型(即小麦1D染色体上SEQ ID No.16的第20位处碱基为C:T杂合)的片段。理论扩增产物(不含特异荧光标签序列)有两条，分别是如SEQ ID No.16(第20位为C)所示的DNA片段1和如SEQ IDNo.16(第20位为T)的DNA片段2。

为了验证KASP标记的准确性，我们随机筛选40个Gli-γ1-I(纯合)和40个Gli-γ1-II(纯合)的材料，进行KASP标记分型验证，发现KASP分型与测序结果一致，说明标记可以区分Gli-γ1-I和Gli-γ1-II(图6中b，表4)。为了验证标记的准确性，我们在RIL群体中对标记进行了验证。通过对农大3331(携带Gli-γ1-I)和藏1817(携带Gli-γ1-II)的RIL后代中高分子谷蛋白亚基为1Ax，1Bx7+1By8，1Dx2+1Dy12的后代进行KASP标记分型，并进行品质分析，发现Gli-γ1-I的SDS沉降值显著高于Gli-γ1-II(图6中c,表5)，验证Gli-γ1-I为优异的单倍型，并且标记稳定可靠。因此Gli-γ1-I的KASP可以用于品质育种中的分子标记辅助选择。

表4、40个Gli-γ1-I和40个Gli-γ1-II的材料的KASP标记分型结果

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表5、农大3331和藏1817的RIL后代SDS沉降值检测结果

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注：双亲农大3331和藏1817的高分谷蛋白亚基1D染色体上均为1Dx2+1Dy12亚基，因此后代必然是1Dx2+1Dy12亚基。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。