新天冬氨酸蛋白酶A在微波辐射致免疫功能损伤中的应用

摘要

本发明涉及一种新天冬氨酸蛋白酶A在微波辐射致免疫功能损伤中的应用。新天冬氨酸蛋白酶A作为确定经微波辐射后生物样本是否发生免疫功能损伤的敏感蛋白，并且，新天冬氨酸蛋白酶A作为试剂可用于制备试剂盒，该试剂盒可用于确定经微波辐射后生物样本是否发生免疫功能损伤。本发明通过检测新天冬氨酸蛋白酶A，可确定微波辐射是否引起生物样本免疫功能损伤，为微波辐射的生物医学研究和临床诊断分析奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种新天冬氨酸蛋白酶A在微波辐射致免疫功能损伤中的应用。

背景技术

微波技术的迅猛发展，极大的方便了人们的生活，改变着人们的生活方式。微波在给人们提供诸多益处的同时，也给人们的健康带来了隐患和威胁，甚至被列为造成环境公害的主要污染物之一。近年来，随着微波技术的广泛应用，微波辐射对机体免疫机能的影响越来越引起人们的关注。研究发现，一定剂量的微波辐射可造成免疫功能异常，但是，目前并未有关微波辐射引起机体免疫功能损伤的敏感分子的研究。

因此，迫切需要开发出微波辐射引起机体免疫功能损伤的敏感分子。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种新天冬氨酸蛋白酶A在微波辐射致免疫功能损伤中的应用，由于新天冬氨酸蛋白酶A对于经微波辐射后免疫功能损伤具有敏感性高的特点，通过检测新天冬氨酸蛋白酶A蛋白表达量，可确定微波辐射是否引起生物样本免疫功能损伤，为微波辐射的生物医学研究和临床诊断分析奠定了基础。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

发明人发现，当微波辐射后，生物样本可能会出现免疫功能受损的现象。为了判断生物样本是否发生免疫功能受损，目前通常需要对生物样本外周血的免疫细胞和免疫因子进行检测，同时还需要对免疫器官或组织如脾脏等结构进行观察，该方法需要对多个指标进行检测，操作复杂。新天冬氨酸蛋白酶A(napsin A aspartic peptidase，NAPSA)是天冬氨酸蛋白酶家族的一员，主要分布于肺、肾和脾脏中，临床上主要用于诊断和鉴别诊断原发性肺腺癌，具有较高的特异度和灵敏度。

有鉴于此，发明人通过大量实验，对外周血和脾脏组织中的多种蛋白进行检测，最终发现NAPSA对于经微波辐射后免疫功能损伤具有敏感性高的特点，可作为判断经微波辐射后生物样本是否发生免疫功能损伤的敏感蛋白，以确定该经微波辐射后生物样本是否发生了免疫功能损伤，具有检测效率高、结果准确度高等优点。

因而，在本发明的一个方面，本发明提出了一种确定经微波辐射后生物样本是否发生免疫功能损伤的敏感蛋白。根据本发明的实施例，所述敏感蛋白选自NAPSA。发明人通过大量实验发现，NAPSA对于经微波辐射后免疫功能损伤具有敏感性高的特点，将NAPSA作为敏感蛋白，可确定微波辐射是否引起生物样本免疫功能损伤。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测NAPSA的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于确定经微波辐射后生物样本是否发生免疫功能损伤。发明人发现，该NAPSA对于经微波辐射后免疫功能损伤具有敏感性高的特点，以NAPSA作为敏感蛋白，通过试剂盒对生物样本外周血和脾脏组织的NAPSA蛋白表达量进行检测，可以快速、准确地确定经微波辐射后生物样本是否发生了免疫功能损伤，为微波辐射的生物医学研究和临床诊断分析奠定了基础。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，所述生物样本免疫功能引起损伤具有如下至少之一的症状：外周血免疫细胞失衡、外周血炎症因子失衡、脾脏组织结构损伤、脾脏淋巴细胞超微结构损伤。发明人通过大量实验发现，当生物样本经过微波辐射后，通过对生物样本外周血和脾脏组织的NAPSA蛋白表达量进行检测，能够快速、准确地判断出经微波辐射后生物样本是否发生了上述症状。

根据本发明的实施例，所述脾脏组织损伤包含脾脏组织淤血、脾脏淋巴细胞核碎裂中的至少之一。由此，通过对生物样本脾脏组织的NAPSA蛋白表达量进行检测，能够快速、准确地判断出经微波辐射后生物样本脾脏组织是否发生了上述症状。

根据本发明的实施例，所述脾脏淋巴细胞超微结构损伤包含脾脏淋巴细胞核染色质浓缩、脾脏淋巴细胞胞浆细胞器凝固中的至少之一。由此，通过对生物样本脾脏组织的NAPSA蛋白表达量进行检测，能够快速、准确地判断出经微波辐射后生物样本是否发生了上述症状。

根据本发明的实施例，所述外周血炎症因子包括白介素12、干扰素γ、肿瘤生长因子α和白介素17A中的至少之一。由此，通过对生物样本外周血的NAPSA蛋白表达量进行检测，能够快速、准确地判断出经微波辐射后生物样本外周血是否发生了上述炎症因子的变化。

根据本发明的实施例，所述外周血免疫细胞包括白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。由此，通过对生物样本外周血的NAPSA蛋白表达量进行检测，能够快速、准确地判断出经微波辐射后生物样本外周血是否发生了上述免疫细胞的变化。

根据本发明的实施例，所述淋巴细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、DC细胞和NK细胞。由此，通过对生物样本外周血的NAPSA蛋白表达量进行检测，能够快速、准确地判断出经微波辐射后生物样本外周血是否发生了上述淋巴细胞的变化。

根据本发明的实施例，所述试剂包括质谱试剂、免疫组织化学试剂、蛋白免疫印迹试剂中的至少之一。采用上述试剂，能够快速、准确地对生物样本中的NAPSA蛋白表达量进行检测，且具有准确度高、使用方便等优点。

根据本发明的实施例，当所述检测NAPSA的试剂检测出所述NAPSA的蛋白表达量下降，则所述试剂盒可用于确定经微波辐射后生物样本发生免疫功能损伤；当所述检测NAPSA的试剂检测出所述NAPSA的蛋白表达量未下降，则所述试剂盒可用于确定经微波辐射后生物样本未引起免疫功能损伤。由此，能够对经微波辐射后生物样本是否发生免疫功能损伤进行准确判断，该方法具有操作简单、检测速度快、准确度高等优点。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种确定经微波辐射后生物样本是否发生免疫功能损伤的系统。根据本发明的实施例，包括：提取装置，所述提取装置用于提取生物样本中的NAPSA蛋白；测定装置，所述测定装置与所述提取装置相连，用于测定所述NAPSA的蛋白表达量；确定装置，所述确定装置与所述测定装置相连，用于基于所述NAPSA的蛋白表达量确定经微波辐射后生物样本是否发生免疫功能损伤。由此，利用根据本发明实施例的系统可以快速、准确地确定判断经微波辐射后生物样本是否发生免疫功能损伤，该系统具有操作简单、检测准确度高等优点。

根据本发明的实施例，所述生物样本选自外周血或脾脏组织。采用上述样本，方便对生物样本中的NAPSA蛋白表达量进行检测。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组的外周血白细胞计数检测结果图(A)、外周血中性粒细胞计数检测结果图(B)、外周血中性粒细胞百分比检测结果图(C)、外周血淋巴细胞计数检测结果图(D)和外周血淋巴细胞百分比检测结果图(E)；

图2是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组的外周血T淋巴细胞分群检测结果图(A)、外周血B淋巴细胞分群检测结果图(B)和外周血NK淋巴细胞分群检测结果图(C)；

图3是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组大鼠血清白介素12浓度分析结果图(A)、干扰素γ浓度分析结果图(B)、肿瘤生长因子α浓度分析结果图(C)和白介素17A浓度分析结果图(D)；

图4是本发明实施例中假辐射组脾脏组织结构(A)和微波辐射组大鼠脾脏组织结构(B)；

图5是本发明实施例假辐射组和微波辐射组大鼠脾脏组织白介素6浓度分析结果图(A)以及大鼠脾脏组织白介素17A浓度分析结果图(B)；

图6是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组大鼠血清差异表达的蛋白质聚类分析图(A)和蛋白质火山图(B)；

图7是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组大鼠经过10毫瓦每平方厘米微波辐射6分钟后第7天血清蛋白质表达谱中NAPSA蛋白的结果；

图8是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组大鼠血清NAPSA肽段碎片离子峰面积分布图；

图9是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组大鼠血清NAPSA蛋白平行反应监测绝对定量结果图；

图10是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组大鼠脾脏差异表达的蛋白质聚类分析图(A)和蛋白质火山图(B)；

图11是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组大鼠经过10毫瓦每平方厘米微波辐射6分钟后第7天脾脏组织差异表达的蛋白质表达谱中NAPSA蛋白的结果；

图12是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组大鼠脾脏组织NAPSA肽段碎片离子峰面积分布图；

图13是本发明实施例中假辐射组和微波辐射组大鼠脾脏NAPSA蛋白平行反应监测绝对定量结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

需要说明的是，在本文中所指出的“失衡”是指，与正常样本相比，待测样本的检测物质含量存在明显差别，其差别可为含量过高或者过低。其中，待测物质可为免疫细胞、炎症因子等。

实施例1：对大鼠进行微波辐射

将40只体重为180±20克的二级雄性Wistar大鼠(军事医学研究院)，随机分为假辐射组和微波辐射组，每组各20只。采用微波辐射源对微波辐射组大鼠进行全身均匀辐射，微波辐射源的平均功率密度为10毫瓦每平方厘米，辐射6分钟。将假辐射组大鼠置于辐射盒中，不予辐射。

实施例2：大鼠外周血常规检测

将微波辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射(或假辐射)后第7天，用1％戊巴比妥钠(30毫克/千克)经腹腔注射麻醉，经腹主静脉取血0.5毫升，采用全自动血细胞计数仪检测血常规中免疫细胞计数及百分比，包括白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞，具体结果参见图1。

由图1结果可知，与假辐射组相比，微波辐射组大鼠外周血中的白细胞计数显著减少(P<0.01)；中性粒细胞计数明显升高(P<0.05)；淋巴细胞计数和比例明显降低(P<0.05或P<0.01)。因此，该结果表明微波辐射后大鼠外周血中的免疫细胞计数和比例失衡。

实施例3：大鼠外周血淋巴细胞分群检测

将微波辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射(或假辐射)后第7天，用1％戊巴比妥钠(30毫克/千克)经腹腔注射麻醉，经腹主静脉取血0.5毫升，分别收集大鼠外周血200微升置于流式检测管中，加入抗CD抗体各1.0微升，室温孵育30分钟，加入2毫升裂解缓冲液，室温避光孵育10分钟，加入2毫升生理盐水，1600转/分钟离心8分钟收集细胞，加入4毫升生理盐水洗涤细胞，1600转/分钟离心6分钟收集细胞，加入500微升2％多聚甲醛固定，4℃避光保存；流式细胞术检测。检测血常规中免疫细胞分群及比例，包括T淋巴细胞和B细胞淋巴比例和NK细胞比例，具体结果参见图2。

由图2结果可知，与假辐射组相比，微波辐射组大鼠外周血T淋巴细胞比例明显减少(P<0.05)；B淋巴细胞比例显著升高(P<0.01)；NK细胞比例显著升高(P<0.01)。因此，该结果表明微波辐射后大鼠外周血中的淋巴细胞比例失衡。

实施例4：大鼠血清细胞因子白介素12、干扰素γ、肿瘤生长因子α和白介素17A浓度检测

将微波辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射(或假辐射)后恢复喂养的第7天进行处死，采集外周血并分离血清，采用高通量多因子试剂盒检测白介素12、干扰素γ、肿瘤生长因子α和白介素17A免疫细胞因子浓度，结果见图3。

由图3中结果可知，与假辐射组相比，微波辐射组大鼠血清细胞因子白介素12、干扰素γ、肿瘤生长因子α和白介素17A浓度均显著增加(P<0.05或P<0.01)。因此，该结果表明微波辐射后大鼠血清中的炎症因子失衡，且浓度均显著增加。

实施例5：大鼠脾脏组织结构观察

将微波辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射(或假辐射)后恢复常规喂养的第7天，采用腹腔注射1％戊巴比妥钠(30毫克/公斤)对大鼠进行麻醉后，取脾脏组织，并用10％缓冲福尔马林固定1周后，采用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度为3微米，脱蜡至蒸馏水，苏木素染核，70％盐酸乙醇分化，1％乙醇伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察并摄像，结果见图4，该图中的标尺为50微米。

由图4中结果可知，假辐射组大鼠脾脏呈正常组织结构，表现为脾小体完整，红白髓分界清晰，淋巴细胞增生活跃。微波辐射组大鼠脾脏组织部分淤血，部分淋巴细胞核碎裂。因此，该结果表明微波辐射后大鼠的脾脏组织结构损伤。

实施例6：大鼠脾脏组织超微结构观察

将微波辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射(或假辐射)后恢复喂养的第7天进行处死，分离新鲜脾脏组织，取1立方毫米脾脏组织，迅速放入2.5％戊二醛固定2小时，1％锇酸后固定2小时，梯度乙醇和丙酮脱水，树脂包埋，半薄切片定位后，制作超薄切片(厚70纳米)，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并摄像，结果见图5，该图中的标尺为500纳米。

由图5中结果可见，假辐射组大鼠脾脏组织呈正常超微结构，表现为细胞结构完整、核染色质排列有序，线粒体嵴完整；内质网未见扩张。微波辐射组脾脏淋巴细胞胞核染色质浓缩，胞浆细胞器凝固。因此，该结果表明微波辐射后大鼠的脾脏淋巴细胞超微结构损伤。

实施例7：大鼠血清蛋白质组表达谱检测

7.1、大鼠血清取样

将微波辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射后第7天，用1％戊巴比妥钠(30毫克每公斤体重)经腹腔注射麻醉，采集外周血并分离血清，冻存-80摄氏度冰箱，进行蛋白质组检测。

7.2、大鼠血清蛋白质组文库

蛋白提取：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度。

蛋白质酶解：全溶液酶切获得肽段。

数据依赖获取文库建立：高效液相色谱分离混合肽段。

数据非依赖数据采集：每个样品酶解后的肽段单独上机采集。

7.3、大鼠血清蛋白质组表达谱信息分析

数据质控与鉴定：数据依赖获取数据质控进行蛋白数据库搜索。数据依赖获取数据库鉴定肽段数和蛋白数。数据质量评估包括肽段长度分布、母离子质量容差分布、蛋白覆盖度分布、蛋白分子量分布、数据非依赖获取数据质控。

数据非依赖差异蛋白的筛选：全局分析；差异蛋白筛选；功能注释和分析；对差异蛋白进行基因本体/京都基因与基因组百科全书功能注释以及功能富集分析，发掘差异蛋白差异化表达的功能和调控关系，具体参见图6。

图6(A)结果显示，假辐射组和微波辐射组组内差别小，表明所制备样品的组内一致性较好，假辐射组和微波辐射组的组间有筛选获得差异蛋白。

图6(B)中，定量值在进行中值归一化后得到的结果，进一步进行归一化，并且，由于样品的重复次数为6次，因此直接采用t检验进行差异分析，卡P值0.05，变化倍数1.5倍，得到差异蛋白的分析结果。结果显示，经过微波辐射后，显著上调的蛋白有16个，显著下调的蛋白有80个。

蛋白质组结果中NAPSA蛋白表达差异及显著性见图7，结果表明，NAPSA蛋白表达明显下调(P<0.05)。

实施例8：大鼠血清NAPSA蛋白表达验证

提取及定量微波辐射组和假辐射组大鼠的血清蛋白。蛋白还原烷基化及酪氨酸酶解。数据依赖预实验质谱分析(具体参见Lyu JW,Wang Y,Mao JW,Yao YT,Wang SJ,ZhengY,Ye ML.A pseudo-targeted MS method for the sensitive analysis of proteinphosphorylation in protein complexes.Anal Chem,2018,90(10):6214-6221)，筛选目标蛋白和肽段。每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析。利用Skyline软件对质谱数据进行建库、提取和分析。

NAPSA蛋白的质谱表达结果见图8-9，结果显示了质谱方法检测大鼠血清NAPSA蛋白的表达情况。与假辐射组相比，微波辐射组大鼠血清中的NAPSA蛋白表达量显著降低(P<0.01)，与蛋白质表达谱结果一致。

实施例9：大鼠脾脏组织蛋白质组表达谱检测

9.1、大鼠脾脏组织取样

将微波辐射组和假辐射组大鼠分别于辐射后第7天，用1％戊巴比妥钠(30毫克每公斤体重)经腹腔注射麻醉，取1/2脾脏组织置于冻存管，冻存-80摄氏度冰箱，进行蛋白质组检测。

9.2、大鼠脾脏组织蛋白质组文库

蛋白提取：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度。

蛋白质酶解：全溶液酶切获得肽段。

数据依赖获取文库建立：高效液相色谱分离混合肽段。

数据非依赖数据采集：每个样品酶解后的肽段单独上机采集。

9.3、大鼠脾脏组织蛋白质组表达谱信息分析

数据质控与鉴定：数据依赖获取数据库质控进行蛋白数据库搜索。数据依赖获取数据库鉴定肽段数和蛋白数。数据质量评估包括肽段长度分布、母离子质量容差分布、蛋白覆盖度分布、蛋白分子量分布、数据非依赖获取数据质控。

数据非依赖差异蛋白的筛选：全局分析；差异蛋白筛选；功能注释和分析；对差异蛋白进行基因本体/京都基因与基因组百科全书功能注释以及功能富集分析，发掘差异蛋白差异化表达的功能和调控关系，具体参见图10。

图10(A)结果显示，假辐射组和微波辐射组组内差别小，表明所制备样品的组内一致性较好；假辐射组和微波辐射组的组间有筛选获得差异蛋白。

图10(B)中，定量值在进行中值归一化后得到的结果，进一步进行归一化，并且，由于样品的重复次数为6次，因此直接采用t检验进行差异分析，卡P值0.05，变化倍数1.5倍，得到差异蛋白的分析结果。结果发现，微波辐射后，显著上调的蛋白有79个，显著下调的蛋白有65个。

蛋白质组结果中NAPSA蛋白表达差异及显著性见图11，结果显示，NAPSA蛋白显著下调(P<0.01)。

实施例10：大鼠脾脏组织NAPSA表达验证

提取及定量微波辐射组和假辐射组大鼠的脾脏组织蛋白。蛋白还原烷基化及酪氨酸酶解。数据依赖预实验质谱分析(具体参见Lyu JW,Wang Y,Mao JW,Yao YT,Wang SJ,Zheng Y,Ye ML.A pseudo-targeted MS method for the sensitive analysis ofprotein phosphorylation in protein complexes.Anal Chem,2018,90(10):6214-6221)，筛选目标蛋白和肽段。每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析。利用Skyline软件对质谱数据进行建库、提取和分析。

NAPSA蛋白的质谱表达结果见图12-13，结果显示了质谱方法检测大鼠脾脏组织NAPSA蛋白的表达情况。与假辐射组相比，微波辐射组大鼠脾脏组织的NAPSA蛋白表达量显著降低(P<0.01)，与蛋白质表达谱结果一致。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。