miR-219调控NMDAR信号通路在微波辐射致突触可塑性损伤中的作用研究

摘要

目的和意义:微波技术在给人们带来极大益处的同时，其生物危害越来越受到关注，可造成包括突触可塑性在内的脑损伤，但致伤机制未明。miRNA是一类单链小分子RNA，具有非常广泛的生物功能，可通过对NMDAR通路的调节影响突触可塑性，但其在微波辐射损伤中的作用研究尚属空白。因此，本研究为深入认识微波辐射致突触可塑性损伤的分子机制、探寻生物标志物和防治靶标提供新思路。
　　材料与方法:(1)采用0和30mW/cm2微波辐射Wistar雄性大鼠48只，隔日辐射1次，共3次，10min/次，于末次辐射后1、7、14和28d，采用光镜、透射电镜观察大鼠海马组织及超微结构。Western Blot检测大鼠海马组织中NMDAR信号通路相关分子NR1、NR2A、NR2B、CaMKIIγ、CREB及p-CREB蛋白;Real-time PCR检测海马组织NR1、NR2A、NR2B mRNA及miR-219;原位杂交检测海马组织中miR-219分布特点。(2)采用0和30mW/cm2微波辐射经NGF诱导的PC12细胞，于辐射后即刻或6h采用原子力显微镜、扫描电镜、HPLC、免疫荧光及流式细胞术等手段检测突触结构及功能改变;于辐射后1h、6h、12h和24h采用Western Blot检测PC12细胞NMDAR信号通路中相关分子NR1、NR2A、NR2B、CaMKIIγ、CREB及p-CREB蛋白;于辐射后1h、6h、12h和24h采用Real-time PCR检测PC12细胞中NR1、NR2A、NR2B mRNA及miR-219的表达。(3)利用靶基因预测数据库（TargetScan、 miRanda和miRDB）对miR-219靶基因进行预测，通过Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes(KEGG)分别对靶基因进行功能分类和通路分析;双荧光素酶活性分析确认miR-219靶基因;稳定转染miR-219过表达和沉默载体至PC12细胞，WesternBlot检测微波辐射后6h miR-219靶基因CaMKIIγ及NMDAR通路分子NR1、NR2A、NR2B、CREB及p-CREB的表达变化。
　　实验结果:(1)大鼠海马组织及超微结构改变:辐射后1d，大鼠海马组织部分神经元固缩、深染，细胞周间隙增宽;辐射后7d，上述损伤加重，突触间隙不清，囊泡减少，线粒体肿胀、空化;辐射后14d，上述改变呈恢复趋势，至28d基本恢复正常;(2)大鼠海马组织中miR-219分布及表达变化:假辐射组miR-219主要分布于海马颗粒细胞和锥体细胞的胞浆和胞核;辐射后7d, miR-219于上述部位减少（P＜0.05或P＜0.01），14d未见明显改变;(3)大鼠海马组织NMDAR通路分子表达变化:辐射后1d,NR1、NR2A、NR2B及CaMKIIγ蛋白表达均见增加(P＜0.05)，辐射后7d p-CREB蛋白表达减少（P＜0.05），NR2A和NR2B mRNA表达上调（P＜0.05或P＜0.01）;(4)突触可塑性损伤细胞模型建立:辐射后6h可见PC12细胞突起缩短、减少，突触表面粗糙不平;Gly、 Glu和GABA释放减少(P＜0.05)，Glu/GABA比值增加(P＜0.05);辐射后即刻可见细胞内Ca2+增加（P＜0.01）;(5)PC12细胞NMDAR通路分子表达变化:辐射后1h和6h,NR1、NR2A、NR2B、CaMKIIγ及p-CREB表达均见增加(P＜0.05)，NR1、NR2A和NR2B mRNA表达上调（P＜0.05或P＜0.01）;(6)PC12细胞miR-219变化:辐射后6h及12h可见miR-219下调（P＜0.05或P＜0.01）;(7)miR-219靶基因预测及功能分析:共预测到14个miR-219靶基因，涉及到与突触可塑性相关的生物过程包括钙离子转运、神经递质转运、谷氨酸分泌、长时程增强和长时程抑制等，7个预测出的miR-219靶基因涉及到与突触可塑性相关的通路;(8)miR-219靶基因确认:经Dual-luciferase确认CaMKIIγ为miR-219靶基因(P＜0.05);（9)miR-219与靶基因CaMKIIγ相互作用，及对NMDAR通路分子表达的影响:辐射后6h,miR-219过表达组CaMKIIγ、NR1、NR2A和p-CREB表达显著降低(P＜0.05)，miR-219沉默组CaMKIIγ、NR1和p-CREB表达显著增加(P＜0.05或P＜0.01)。
　　结论:(1)30mW/cm2微波辐射可使大鼠海马组织尤其是突触可塑性损伤;NMDAR通路活化参与微波辐射致突触可塑性损伤的病理生理过程。(2)预测到14个与微波辐射致突触可塑性损伤相关的miR-219靶基因，其中7个参与突触可塑性相关信号通路;30mW/cm2微波辐射后miR-219下调可能通过增加靶基因表达促进突触可塑性损伤。(3)30mW/cm2微波辐射可致PC12细胞突触可塑性损伤;微波辐射后miR-219下调可通过增加靶基因CaMKIIγ表达，增强NMDAR信号通路活化，可能是微波辐射造成突触可塑性损伤的重要机制。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

参考文献

第一部分 微波辐射对大鼠海马NMDAR信号通路和miR-219影响研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 微波辐射对PC12细胞突触可塑性影响研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 miR-219对NMDAR信号通路调控与微波辐射致突触可塑性损伤关系研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文结论

文献综述 miRNA与NMDAR通路对学习和记忆的调控

代表性论著

个人简历

攻读博士学位期间发表论文及申请专利一览表

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