一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒构建方法及应用

摘要

本发明提供了一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒构建方法，该方法包括构建pMD18‑Tsimple‑pU6::shRNA(RPS‑30

说明书

技术领域

本发明属于生物科学技术领域，具体涉及一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒构建方法及应用。

背景技术

健康长寿是人类历来追求的目标，我国虽已进入了长寿时代，但长寿而不健康的问题依然突出。健康长寿的调控机制一直是医学与生命科学领域中的研究热点。

秀丽线虫因其具有生命周期短、易于培养与观察、完整的细胞谱系、强大的遗传分析手段以及高度保守的基因组等优点，已被广泛作为模式生物用于寿命调控机制的研究，许多调控寿命的信号通路都是首先在秀丽线虫中被发现并阐明的。秀丽线虫寿命受多种因素影响：遗传因素、环境因素以及多种保守的信号转导途径，如IIS、TGF-β、TOR、AMPK等。目前，延长秀丽线虫寿命的方法主要包括：低温培养、限饲、基因遗传操作等。其中基因遗传操作是通过遗传因素影响秀丽线虫寿命的方法，主要是对特定基因进行敲除或沉默，如daf-2、hcf-1、let-363、daf-15、hif-1等。但这些基因均为虫体必需基因，如类胰岛素信号途径受体基因daf-2，该基因缺失突变可导致胚胎期或幼虫发育早期致死，而用于寿命与发育研究的daf-2突变体多为功能部分缺失的点突变，是通过化学诱变剂随机诱导和高通量筛选完成的，这导致了该寿命延长技术无法在其它物种中推广；其它基因的敲除或沉默虽然能够导致虫体长寿，但同时也引起虫体或发育缓慢、不产卵；或虫体无法发育至成虫期；或虫体运动能力显著降低等非健康长寿状态。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒构建方法及应用，该延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒用于延长秀丽线虫健康寿命。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒的构建方法，该方法为：

S1、构建pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

S101、以pLKO.1puro质粒为模板，通过PCR扩增U6启动子序列，并通过TA克隆，将U6启动子PCR产物克隆到pMD18-T simple质粒中，构建pMD18-T simple-pU6质粒，然后对得到的pMD18-T simple-pU6质粒进行AgeI/EcoRI限制性内切酶双酶切，得到AgeI/EcoRI双酶切产物，并对AgeI/EcoRI双酶切产物进行胶回收，具体的步骤包括：

S1011、以pLKO.1puro质粒为模板，以上游引物U6P1和下游引物U6P2进行PCR反应扩增U6启动子，得到U6启动子PCR产物；所述上游引物U6P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物U6P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

PCR反应体系为：pLKO.1puro质粒0.2μL、上游引物U6P11μL、下游引物U6P21μL、LATaq0.25μL、10×LATaqbuffer2.5μL、ddH

PCR反应程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存；

S1012、在16℃的温度条件下，通过TA克隆，将S1011中得到的U6启动子PCR产物过夜连接到pMD18-T simple质粒中，得到TA克隆连接产物pMD18-T simple-pU6；

连接反应体系：U6启动子PCR产物4μL、pMD18-T simple质粒0.5μL、DNA连接缓冲液SolutionI4.5μL、ddH

S1013、转化涂板：

在-80℃的保存温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，加入S1012中得到的TA克隆连接产物pMD18-T simple-pU6，混合均匀，冰浴30min然后在42℃温度下热应激90s，再冰浴2min，加入1mLLB液体培养基培养，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养1h，经离心得到转化后的残留菌液，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素(AMP)抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；

S1014、测序鉴定：

在S1013中过夜培养的固体LB培养板中挑取单克隆菌落，分别置于3mL含氨苄青霉素(AMP)抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S1015、提取pMD18-T simple-pU6质粒：

将S1014中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid MiniprepKit质粒提取试剂盒提取，得到pMD18-T simple-pU6质粒；

S1016、AgeI/EcoRI限制性内切酶双酶切；

在37℃的温度条件下，对S1015中得到的pMD18-T simple-pU6质粒进行5hAgeI/EcoRI限制性内切酶双酶切反应，得到AgeI/EcoRI双酶切产物；

反应体系：pMD18-T simple-pU6质粒1.5μg、10×FastDigestGreen buffer2μL、AgeI限制性内切酶1μL、EcoRI限制性内切酶1μL、ddH

S1017、胶回收AgeI/EcoRI双酶切产物：

将S1016中得到的AgeI/EcoRI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下270bp大小的目的DNA条带，使用AxyPrepDNAGelExtractionKit胶回收试剂盒回收，得到AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物；

S102、将引物UbLshR1和引物UbLshR2退火，得到退火产物，即针对RPS-30

退火体系：引物UbLshR11.5μL、引物UbLshR21.5μL、10×NEBbuffer II5μL、ddH

退火程序：95℃预变性5min；70℃变性15min；以每秒降低0.1℃的速度降至22℃；-40℃保存；

S103、将S101中得到的AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物与S102中得到的退火产物连接，构建得到pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

S1031、在16℃的温度条件下，将S101中得到的AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物和S102中得到的退火产物过夜连接，得到连接产物pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

连接反应体系：AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物100ng、退火产物500ng、LigationMix 8μL、ddH

S1032、转化涂板：

在-80℃的保存温度中取出E.coliStbl3感受态细菌，加入S1031中得到的连接产物pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

S1033、测序鉴定：

在S1032中过夜培养转化后的固体LB培养板中挑取单克隆菌落，分别置于3mL含氨苄青霉素(AMP)抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S1034、提取pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

将S1033中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit质粒提取试剂盒提取，得到pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

S2、构建pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

S201、以秀丽线虫基因组DNA序列为模板，通过PCR扩增rps-30启动子序列，得到rps-30启动子PCR产物；以pEGFP-c2质粒为模板，通过PCR扩增GFP核酸序列，得到GFPPCR产物；以秀丽线虫RNA序列反转录获得的cDNA为模板，通过PCR扩增RPS-30

S2011、提取秀丽线虫基因组DNA：

使用提取基因组DNA的试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.0进行提取，得到秀丽线虫基因组DNA；

S2012、以S2011中得到的秀丽线虫基因组DNA为模板，PCR扩增rps-30启动子序列：

以秀丽线虫基因组DNA为模板，以上游引物rps30P1和下游引物rps30P2进行PCR反应扩增rps-30启动子序列，得到rps-30启动子PCR产物；所述上游引物rps30P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述下游引物rps30P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

PCR反应体系：秀丽线虫基因组DNA2μL、上游引物rps30P11μL、下游引物rps30P2 1μL、LA Taq 0.25μL、10×LA Taq buffer 2.5μL、ddH

PCR反应程序：95℃预变性4min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环28次；72℃延伸10min；4℃保存；

S2013、以pEGFP-c2质粒为模板，PCR扩增GFP核酸序列：

以pEGFP-c2质粒为模板，以上游引物GFP1和下游引物GFP2进行PCR反应扩增GFP核酸序列，得到GFPPCR产物；所述上游引物GFP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述下游引物GFP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

PCR反应体系：pEGFP-c2质粒0.2μL、上游引物GFP11μL、下游引物GFP21μL、LATaq0.25μL、10×LATaqbuffer2.5μL、ddH

PCR反应程序：95℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存；

S2014、提取秀丽线虫总RNA；

S2015、秀丽线虫RNA序列反转录获得cDNA；

S2016、以S2015中得到的cDNA为模板，PCR扩增RPS-30

以S2015中得到的cDNA为模板，以上游引物s30F和下游引物s30R进行PCR反应扩增RPS-30

PCR反应体系：cDNA2μL、上游引物s30F1μL、下游引物s30R1μL、LATaq0.25μL、10×LATaqbuffer2.5μL、ddH

PCR反应程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存；

S202、通过TA克隆分别将S2012中得到的rps-30启动子PCR产物、GFPPCR产物和RPS-30

S2021、在16℃的温度条件下，通过TA克隆将S201中得到的rps-30启动子PCR产物过夜连接到pMD18-T simple质粒中，得到连接产物pMD18-T simple-pRPS-30；

在16℃的温度条件下，通过TA克隆将S2013中得到的GFPPCR产物过夜连接到pMD18-T simple质粒中，得到连接产物pMD18-Tsimple-GFP；

在16℃的温度条件下，通过TA克隆将S2016中得到的RPS-30

连接反应体系：PCR产物4μL、pMD18-T simple质粒0.5μL、DNA连接缓冲液SolutionⅠ4.5μL、ddH

S2022、转化涂板：

在-80℃的保存温度中取出3支Escherichia coli TOP10感受态细菌，第一支Escherichia coli TOP10感受态细菌中加入S2021中得到的连接产物pMD18-T simple-pRPS-30，第二支Escherichia coli TOP10感受态细菌中加入S2021中得到的连接产物pMD18-T simple-GFP，第三支E.coli TOP10感受态细菌中加入S2021中得到的连接产物pMD18-T simple-RPS-30

S2023、测序鉴定：

在S2022中过夜培养的固体LB培养板中分别挑取单克隆菌落，然后分别置于3mL含氨苄青霉素(AMP)抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S2024、提取pMD18-T simple-pRPS-30质粒、pMD18-T simple-GFP质粒和pMD18-Tsimple-RPS-30

将S2023中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit质粒提取试剂盒提取，分别得到pMD18-T simple-pRPS-30质粒、pMD18-T simple-GFP质粒和pMD18-T simple-RPS-30

S203、将S2024中得到的pMD18-T simple-pRPS-30质粒和pMD18-T simple-RPS-30

S2031、NheI/EcoRI限制性内切酶双酶切；

在37℃的温度条件下，用NheI/EcoRI限制性内切酶对S2024中得到的pMD18-Tsimple-pRPS-30质粒进行5h的双酶切反应，得到pMD18-T simple-pRPS-30质粒NheI/EcoRI双酶切产物；

在37℃的温度条件下，用NheI/EcoRI限制性内切酶对S2024中得到的pMD18-Tsimple-RPS-30

反应体系：pMD18-T simple-pRPS-30质粒或pMD18-T simple-RPS-30

S2032、胶回收NheI/EcoRI双酶切产物：

将S2031中得到的pMD18-T simple-pRPS-30质粒NheI/EcoRI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下4400bp大小的目的DNA条带，并使用AxyPrep DNA Gel ExtractionKit胶回收试剂盒回收，得到pMD18-T simple-pRPS-30质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物；

将S2031中得到的pMD18-T simple-RPS-30

S2033、在16℃的温度条件下，将S2032中得到的pMD18-T simple-pRPS-30质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物和pMD18-T simple-RPS-30

连接反应体系：pMD18-T simple-pRPS-30质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物100ng、pMD18-T simple-RPS-30

S2034、转化涂板：

在-80℃的保存温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，加入S2033中得到的NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物的连接产物，混合均匀，冰浴30min然后在42℃温度下热应激90s，再冰浴2min，加入1mLLB液体培养基培养，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养1h，经离心得到转化后的残留菌液，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素(AMP)抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；

S2035、测序鉴定：

在S2034中过夜培养的固体LB培养板中，分别挑取单克隆菌落，然后分别置于3mL含氨苄青霉素(AMP)抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S2036、提取pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

将S2035中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid MiniprepKit质粒提取试剂盒提取，得到pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

S204、将S2024中得到的pMD18-T simple-GFP质粒与S2036中得到的pMD18-Tsimple-pRPS-30::RPS-30

S2041、BglII/NheI限制性内切酶双酶切：

在37℃的温度条件下，BglII/NheI限制性内切酶对S2024中得到的pMD18-Tsimple-GFP质粒进行5h的双酶切反应，得到pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切产物；

在37℃的温度条件下，BglII/NheI限制性内切酶对S2036中得到的pMD18-Tsimple-pRPS-30::RPS-30

反应体系：pMD18-T simple-GFP质粒或pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

S2042、胶回收BglII/NheI双酶切产物：

将S2041中得到的pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下720bp大小的目的DNA条带，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收，得到pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切后胶回收产物；

将S2041中得到的pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

S2043、在16℃的温度条件下，将S2042中得到的pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切后胶回收产物和pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

连接反应体系：pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切后胶回收产物500ng、pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

S2044、转化涂板：

在-80℃的保存温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，加入S2043中得到的BglII/NheI双酶切后胶回收产物的连接产物，冰浴30min然后在42℃温度下热应激90s，再冰浴2min，加入1mLLB液体培养基培养，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养1h，经离心得到转化后的残留菌液，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素(AMP)抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；

S2045、测序鉴定：

在S2044中过夜培养的固体LB培养板中分别挑取单克隆菌落，然后分别置于3mL含氨苄青霉素(AMP)抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S2046、提取pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

将S2045中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid MiniprepKit质粒提取试剂盒提取，得到pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

S3、构建pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

S301、KpnI/EcoRI限制性内切酶双酶切：

在37℃的温度条件下，KpnI/EcoRI限制性内切酶对pPD95.77质粒进行5h的双酶切反应，得到pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切产物；

在37℃的温度条件下，KpnI/EcoRI限制性内切酶对S2046中得到的pMD18-Tsimple-pRPS-30::GFP::RPS-30

双酶切反应体系：pPD95.77质粒或pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

S302、胶回收KpnI/EcoRI双酶切产物：

将S301中得到的pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下3562bp大小的目的DNA条带，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收，得到pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切后胶回收产物；

将S301中得到的pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

S303、在16℃的温度条件下，将S302中得到的pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切后胶回收产物和pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

连接反应体系：pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切后胶回收产物100ng、pMD18-Tsimple-pRPS-30::GFP::RPS-30

S304、转化涂板：

在-80℃的保存温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，加入S303中得到的KpnI/EcoRI双酶切后胶回收产物的连接产物，冰浴30min然后在42℃温度下热应激90s，再冰浴2min，加入1mLLB液体培养基培养，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养1h，经离心得到转化后的残留菌液，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素(AMP)抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；

S305、测序鉴定；

在S304中过夜培养的固体LB培养板中分别挑取单克隆菌落，然后分别置于3mL含氨苄青霉素(AMP)抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S306、提取pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

将S305中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid MiniprepKit质粒提取试剂盒提取，得到pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

S4、构建pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

将S306中得到的pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

S401、SmaI/KpnI限制性内切酶双酶切：

在37℃的温度条件下，SmaI/KpnI限制性内切酶对S306中得到的pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

在37℃的温度条件下，SmaI/KpnI限制性内切酶对S1034中得到的pMD18-Tsimple-pU6::shRNA(RPS-30

反应体系：pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

S402、胶回收SmaI/KpnI双酶切产物：

将S401中得到的pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

将S401中得到的pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

S403、在16℃的温度条件下，将S402中得到的pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

连接反应体系：pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

S404、转化涂板：

在-80℃的保存温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，加入S403中得到的SmaI/KpnI双酶切后胶回收产物的连接产物，冰浴30min然后在42℃温度下热应激90s，再冰浴2min，加入1mLLB液体培养基培养，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养1h，经离心得到转化后的残留菌液，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素(AMP)抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；

S405、测序鉴定：

在S404中过夜培养的固体LB培养板中分别挑取单克隆菌落，然后分别置于3mL含氨苄青霉素(AMP)抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S406、提取pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

将S405中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid MiniprepKit质粒提取试剂盒提取，得到pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

本发明还提供了上述延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒的应用，所述延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒用于延长秀丽线虫的健康寿命。

RPS-30为嵌合蛋白，在细胞质中被裂解产生泛素样蛋白RPS-30

面对长寿时代下出现的长寿而不健康的问题，本发明成功建立了一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒，有望为人类健康寿命调控研究提供理论基础。

本发明中涉及的rps-30基因编码核糖体蛋白小亚基30(RPS-30)。RPS-30是嵌合蛋白，在细胞质中被裂解产生泛素样蛋白(RPS-30

RPS-30

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明成功构建了一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例1中构建延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

图2是本发明实施例2中pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

图3是本发明实施例2中转基因虫体中基因转录水平相对定量分析图。

图4是本发明实施例2中转基因虫体寿命检测图。

图5本发明实施例2转基因虫体产卵量检测图。

图6本发明实施例2转基因虫体体长检测图。

图7本发明实施例2转基因虫体抗热应激能力检测图。

图8本发明实施例2转基因虫体氧化应激检测图。

具体实施方式

实施例1

本实施例为延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

1、主要试剂

Escherichia coli TOP10感受态菌株、pPD95.77秀丽隐杆线虫表达载体pLKO.1puro质粒(Addgene#：8453)、pEGFP-c2质粒(GenBank Accession#:U57606)由本实验室保存，克隆载体pMD18-TVector(Simple)；限制性内切酶AgeI、SmaI、KpnI、BglII、NheI、EcoRI；DNA连接酶；LATaqDNA聚合酶；DNA Marker(3427Q)；DNA连接试剂盒(DNA LigationKit)均购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。琼脂糖、Tris购自Promega公司；蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司；鼠源反转录酶(M-MLV)、TRIzol购自上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)。质粒提取试剂盒AxyPrep Plasmid Miniprep Kit；胶回收试剂盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit购自爱思进(Axygen)。

2、主要仪器和设备

PCR仪、凝胶成像系统仪、台式离心机(日本)、恒温水浴锅、生化培养箱。

3、主要溶液

溶菌肉汤(Lysogeny Broth，LB)培养基的配制：使用分析天平准确称量10g胰蛋白胨，5g酵母浸出粉和5gNaCl，配制LB固体培养基需添加15g琼脂，用ddH2O定容至1L并混合均匀，使用1M NaOH将pH值调至7.0(液体培养)或7.5(固体培养基)。

4、引物设计

参照pLKO.1 puro质粒中U6启动子序列及其下游核苷酸序列(包含AgeI和EcoRI限制性内切酶酶切位点)，设计上游引物U6P1和下游引物U6P2，用于克隆U6启动子区，两端分别加入酶切位点SmaI和KpnI；参照NCBI数据库中rps-30基因序列(NM_072606.7)，设计针对rps-30

所述上游引物U6P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述下游引物U6P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述引物UbLshR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述引物UbLshR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述上游引物rps30P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述下游引物rps30P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述上游引物GFP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述下游引物GFP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述上游引物s30F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

所述下游引物s30R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

构建延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

5、质粒构建：

S1、构建pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

S101、以pLKO.1puro质粒(Addgene#：8453)为模板，通过PCR扩增U6启动子序列，并通过TA克隆，将U6启动子PCR产物克隆到pMD18-T simple质粒中，构建pMD18-T simple-pU6质粒，然后对得到的pMD18-T simple-pU6质粒进行AgeI/EcoRI限制性内切酶双酶切，得到AgeI/EcoRI双酶切产物，并对AgeI/EcoRI双酶切产物进行胶回收，具体的步骤包括：

S1011、以pLKO.1puro质粒为模板，以上游引物U6P1和下游引物U6P2进行PCR反应扩增U6启动子，得到U6启动子PCR产物；所述上游引物U6P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物U6P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

PCR反应体系为：pLKO.1puro质粒0.2μL、上游引物U6P11μL、下游引物U6P21μL、LATaq0.25μL、10×LATaqbuffer2.5μL、ddH

PCR反应程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存；

S1012、在16℃的温度条件下，通过TA克隆，将S1011中得到的U6启动子PCR产物过夜连接到pMD18-T simple质粒中，得到TA克隆连接产物pMD18-T simple-pU6；

连接反应体系：U6启动子PCR产物4μL、pMD18-T simple质粒0.5μL、DNA连接缓冲液SolutionI4.5μL、ddH

S1013、转化涂板；

在-80℃保存温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，置于冰上融化后，加入S1012中得到的TA克隆连接产物pMD18-T simple-pU6，轻轻吹打混匀，冰浴30min，42℃热应激90s，然后冰浴2min，加入1mL LB液体培养基(氯化钠1g/100mL；胰蛋白胨1g/100mL；酵母浸出液0.5g/100mL)培养，于温度为37℃、转速为250rpm/min的条件下摇床震荡培养1h，4000g条件下离心4min，舍弃上清液，留下约30μL转化后的残留菌液，轻轻捶打沉淀至转化后的残留菌液均匀，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素抗性(AMP)的固体LB培养板(氯化钠1g/100mL；胰蛋白胨1g/100mL；酵母浸出液0.5g/100mL；琼脂1.5g/100mL；AMP50mM)中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；

S1014、测序鉴定：

在S1013中过夜培养的固体LB培养板中挑取单克隆菌落，分别置于3mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡的条件下培养10h；分别取1mL菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S1015、提取pMD18-T simple-pU6质粒：

使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，按照试剂盒质粒提取操作说明书进行：根据S1014中的测序结果，选择测序正确的单克隆菌落，取1mL菌液于1.5mL EP管(离心管)中，12000g离心1min，舍弃上清液，加入250μL S1溶液(悬浮溶液)，吹打混匀，加入250μL S2溶液(裂解溶液)，温和颠倒混匀6-8次，加入350μL S3溶液(中和溶液)，温和颠倒混匀6-8次，12000g离心10min，取上清液至吸附柱，12000g离心1min，舍弃滤液，加入500μL清洗溶液W1缓冲液，12000g离心1min，弃滤液，加入700μL清洗溶液W2缓冲液洗2次，12000g离心1min，舍弃滤液；将吸附柱放置在新的1.5mL EP管上，开盖干燥3min，加入50μL ddH

S1016、AgeI/EcoRI限制性内切酶双酶切：

在37℃的温度条件下，对S1015中得到的pMD18-T simple-pU6质粒在37℃的温度条件下进行AgeI/EcoRI双酶切反应5h，得到AgeI/EcoRI双酶切产物；

反应体系：pMD18-T simple-pU6质粒1.5μg、10×FastDigest Green buffer 2μL、AgeI限制性内切酶1μL、EcoRI限制性内切酶1μL、ddH

S1017、胶回收AgeI/EcoRI双酶切产物：

使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，按照试剂盒胶回收操作说明书进行：将S1016中得到的AgeI/EcoRI双酶切产物20μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，将目的DNA条带(270bp)切割下来，胶块约100～150mg，分别置于1.5mL EP管中，加入300～450μLDE-A，将EP管置于温度为75℃的水浴中10min(每隔2-3min震荡混匀一次)，再加入DE-B并震荡1min；将液体移入置于2mL离心管的回收柱中，12000g离心1min，弃掉离心管中的液体，用500μL缓冲液W1洗一次，12000g离心1min，弃掉离心管中的液体；用700μL缓冲液W2洗二次，分别12000g离心1min，弃掉离心管中的液体；12000g空离2min，弃掉离心管，将回收柱置于新的1.5mLEP管中，加入25μL ddH

S102、将引物UbLshR1和引物UbLshR2退火，得到退火产物，即针对RPS-30

退火体系：引物UbLshR11.5μL、引物UbLshR21.5μL、10×NEBbuffer II5μL、ddH

退火程序：95℃预变性5min；70℃变性15min；以每秒降低0.1℃的速度降至22℃；-40℃保存；

S103、将S101中得到的AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物与S102中得到的退火产物连接，构建得到pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

S1031、在16℃温度条件下，使用DNA Ligation Kit过夜连接S101中得到的AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物与S102中得到的退火产物，得到连接产物pMD18-Tsimple-pU6::shRNA(RPS-30

连接反应体系：AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物100ng、退火产物500ng、LigationMix 8μL、ddH

S1032、转化涂板：

在-80℃温度中取出E.coliStbl3感受态细菌，置于冰上融化后，将S1031中得到的25μL连接产物pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

S1033、测序鉴定：

在S1032中过夜培养的固体LB培养板中挑取单克隆菌落，分别置于3mL含氨苄青霉素抗性的的液体LB培养基中，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡条件下培养10h；分别取1mL菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S1034、提取pMD18-T simple-pU6::shRNA(RPS-30

使用AxyPrep Plasmid MiniprepKit，按照试剂盒质粒提取操作说明书进行：根据S1033的测序结果，选择测序正确的单克隆菌落，取1mL菌液于1.5mL EP管中，12000g离心1min，弃上清液，加入250μL S1溶液，捶打混匀，加入250μL S2溶液，温和颠倒混匀6-8次，加入350μL S3溶液，温和颠倒混匀6-8次，12000g离心10min，取上清液至吸附柱，12000g离心1min，弃滤液，加入500μLW1缓冲液，12000g离心1min，弃滤液，加入700μLW2缓冲液洗2次，12000g离心1min，弃滤液；将吸附柱放置在新的1.5mL EP管上，开盖干燥3min，加入50μLddH

S2、构建pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

S201、以秀丽线虫基因组DNA序列为模板，通过PCR扩增rps-30启动子序列，得到rps-30启动子PCR产物；以pEGFP-c2质粒(GenBank Accession#:U57606)为模板，通过PCR扩增GFP核酸序列，得到GFP PCR产物；以秀丽线虫RNA序列反转录获得的cDNA为模板，通过PCR扩增RPS-30

S2011、提取秀丽线虫基因组DNA：

使用提取基因组DNA的试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.0(code：9765)，按照试剂盒说明，方法如下：

a.取20mg秀丽线虫虫体置于1.5mL EP管中，于冰上使用研磨棒研磨至匀浆；

b.加入180μL Buffer GL、20μL蛋白酶K、10μL浓度为10mg/mL的RNase A，轻轻混匀后于56℃水浴孵育2h，至组织完全裂解；

c.裂解后溶液12000g条件下离心2min，去除杂质，将上清液转移至新的1.5mL EP管中，得到裂解液；

d.向裂解液中加入200μL Buffer GB和200μL无水乙醇，充分吸打混匀；

e.将Spin柱安置于收集管上，溶液移至Spin柱中，12000g离心2min，弃滤液；

f.将500μL的Buffer WA加入至Spin柱中，12000g离心1min，弃滤液；

g.将700μL的Buffer WB加入至Spin柱中，12000g离心1min，弃滤液，并重复用Buffer WB洗一次；

h.将Spin柱安置于收集管上，12000g空离2min；

i.将Spin柱安置于新的1.5mL EP管上，在Spin柱膜的中央处滴加100μL ElutionBuffer，室温静置5min；

j.12000g离心2min洗脱，即得秀丽线虫基因组DNA；

S2012、以S2011中得到的秀丽线虫基因组DNA为模板，PCR扩增rps-30启动子序列：

以秀丽线虫基因组DNA为模板，以上游引物rps30P1和下游引物rps30P2进行PCR反应扩增rps-30启动子序列，得到rps-30启动子PCR产物；所述上游引物rps30P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述下游引物rps30P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

PCR反应体系：秀丽线虫基因组DNA 2μL、上游引物rps30P1 1μL、下游引物rps30P21μL、LATaq0.25μL、10×LATaqbuffer2.5μL、ddH

PCR反应程序：95℃预变性4min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环28次；72℃延伸10min；4℃保存；

S2013、以pEGFP-c2质粒为模板，PCR扩增GFP核酸序列；

以pEGFP-c2质粒为模板，以上游引物GFP1和下游引物GFP2进行PCR反应扩增GFP核酸序列，得到GFPPCR产物；所述上游引物GFP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述下游引物GFP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

PCR反应体系：pEGFP-c2质粒2μL、上游引物GFP11μL、下游引物GFP21μL、LATaq0.25μL、10×LATaqbuffer2.5μL、ddH

PCR反应程序：95℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存；

S2014、提取秀丽线虫总RNA：

a.取20～40mg秀丽线虫虫体置于1.5mL EP管中，于冰上使用研磨棒研磨至匀浆；

b.加入500μLTRIzol试剂后剧烈震荡1min，室温静置10min；

c.加入400μL氯仿，剧烈震荡1min，室温静置10min；

d.在4℃温度下，12000g离心15min，吸取上清液转移入于新的1.5mL EP管中；

e.加入异丙醇至加满EP管，于-20℃温度条件下静置30min；

f.在4℃温度下，13000g离心15min，得到的EP管底的沉淀即为所提取的秀丽线虫总RNA；

g.弃去液体，将RNA自然干燥约5min后，加入20μLRNaseFree ddH

S2015、秀丽线虫RNA序列反转录获得cDNA；

a.-80℃取出秀丽线虫总RNA，于冰上融化后，吸取19μL于0.5mL EP管中；

b.向EP管中加入4μL dNTP和4μL随机引物，混匀后置于温度为70℃的水浴中5min；

c.取出EP管放于冰上冷却1～2min后分别加入4μL DDT、8μL5×First-StrandBuffer，混匀后置于温度为37℃的水浴中1min；

d.向EP管中加入1μL M-MLV反转录酶，轻轻混匀后在37℃孵育3h，并进行反转录；

e.反转录结束后，将EP管放于70℃温度条件下水浴10min，再放到冰上冷却2min，即可得到cDNA，将产物cDNA置于-20℃中保存备用；

S2016、以S2015中得到的cDNA为模板，PCR扩增RPS-30

以S2015中得到的cDNA为模板，以上游引物s30F和下游引物s30R进行PCR反应扩增RPS-30

PCR反应体系：cDNA 2μL、上游引物s30F1μL、下游引物s30R1μL、LA Taq 0.25μL、10×LA Taq buffer 2.5μL、ddH

PCR反应程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存；

S202、通过TA克隆分别将S201中得到的rps-30启动子PCR产物、GFP PCR产物和RPS-30

S2021、在16℃的温度条件下，通过TA克隆将S201中得到的rps-30启动子PCR产物过夜连接到pMD18-T simple质粒中，得到连接产物pMD18-T simple-pRPS-30；

在16℃的温度条件下，通过TA克隆将S2013中得到的GFP PCR产物过夜连接到pMD18-T simple质粒(TaKaRaCode：D103A)中，得到连接产物pMD18-T simple-GFP；

在16℃的温度条件下，通过TA克隆将S2016中得到的RPS-30

连接反应体系：PCR产物4μL、pMD18-T simple质粒0.5μL、DNA连接缓冲液SolutionⅠ4.5μL、ddH

S2022、转化涂板：

在-80℃的保存温度中取出3支Escherichia coli TOP10感受态细菌，第一支Escherichia coli TOP10感受态细菌中加入S2021中得到的连接产物pMD18-T simple-pRPS-30，第二支Escherichia coli TOP10感受态细菌中加入S2021中得到的连接产物pMD18-T simple-GFP，第三支Escherichiacoli TOP10感受态细菌中加入S2021中得到的连接产物pMD18-Tsimple-RPS-30

S2023、测序鉴定：

在S2022中过夜培养的固体LB培养板中分别挑取单克隆菌落，分别置于3mL含AMP抗性的液体LB培养基中，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡条件下培养10h；分别取1mL菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S2024、提取pMD18-T simple-pRPS-30质粒、pMD18-T simple-GFP质粒和pMD18-Tsimple-RPS-30

使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，按照试剂盒质粒提取操作说明书进行：根据S2023测序结果，选择测序正确的单克隆菌落，分别取1mL菌液于1.5mL EP管中，12000g离心1min，弃上清液，加入250μL S1溶液，吹打混匀，加入250μL S2溶液，温和颠倒混匀6-8次，加入350μL S3溶液，温和颠倒混匀6-8次，12000g离心10min，取上清液至吸附柱，12000g离心1min，弃滤液，加入500μLW1缓冲液，12000g离心1min，弃滤液，加入700μL W2缓冲液洗2次，12000g离心1min，弃滤液，将吸附柱放置在新的1.5mL EP管上，开盖干燥3min，加入50μLddH

S203、将S202中得到的pMD18-T simple-pRPS-30质粒和pMD18-T simple-RPS-30

S2031、NheI/EcoRI限制性内切酶双酶切：

在37℃的温度条件下，用NheI/EcoRI限制性内切酶对S2024中得到的pMD18-Tsimple-pRPS-30质粒进行5h的双酶切反应，得到pMD18-T simple-pRPS-30质粒NheI/EcoRI双酶切产物；

在37℃的温度条件下，用NheI/EcoRI限制性内切酶对S2024中得到的pMD18-Tsimple-RPS-30

反应体系：pMD18-T simple-pRPS-30质粒或pMD18-T simple-RPS-30

S2032、胶回收NheI/EcoRI双酶切产物：

使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，按照试剂盒胶回收操作说明书进行：分别将S2031中得到的20μLNheI/EcoRI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，将目的DNA条带(4400bp)切割下来；将S2031中得到的pMD18-T simple-RPS-30

回收后，分别得到pMD18-T simple-pRPS-30质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物、pMD18-T simple-RPS-30

S2033、在16℃的温度条件下，使用DNA Ligation Kit过夜连接S2032中得到的pMD18-T simple-pRPS-30质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物和pMD18-Tsimple-RPS-30

连接反应体系：pMD18-T simple-pRPS-30质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物100ng、pMD18-T simple-RPS-30

S2034、转化涂板：

在-80℃温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，置于冰上融化后，将25μL S2033中得到的NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物的连接产物加入其中，轻轻吹打混匀，冰浴30min；42℃温度下热应激90s，然后冰浴2min，加入1mLLB液体培养基培养，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡条件下培养1h；4000g离心4min，弃上清液，留下30μL残留菌液，轻轻捶打沉淀至菌液均匀，将菌液滴加至含氨苄青霉素抗性的固体LB培养基中，并涂布均匀，置于37℃的细菌培养箱中过夜培养；

S2035、测序鉴定：

在S2034中过夜培养的固体LB培养基中挑取单克隆菌落，分别置于3mL含AMP抗性的液体LB培养基中，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡条件下培养10h，分别取1mL菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S2036、提取pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，按照试剂盒质粒提取操作说明书进行：根据S2035的测序结果，选择测序正确的单克隆菌落，取1mL菌液于1.5mL EP管中，12000g离心1min，弃上清液，加入250μL S1溶液，吹打混匀，加入250μL S2溶液，温和颠倒混匀6-8次，加入350μL S3溶液，温和颠倒混匀6-8次，12000g离心10min，取上清至吸附柱，12000g离心1min，弃滤液，加入500μL W1缓冲液，12000g离心1min，弃滤液，加入700μLW2缓冲液洗2次，12000g离心1min，弃滤液；将吸附柱放置在新的1.5mL EP管上，开盖干燥3min，加入50μLddH

S204、将S202中得到的pMD18-T simple-GFP质粒与S203中得到的pMD18-Tsimple-pRPS-30::RPS-30

S2041、BglII/NheI限制性内切酶双酶切：

在37℃的温度条件下，BglII/NheI限制性内切酶对S2024中得到的pMD18-Tsimple-GFP质粒进行5h的双酶切反应，得到pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切产物；

在37℃的温度条件下，BglII/NheI限制性内切酶对S2036中得到的pMD18-Tsimple-pRPS-30::RPS-30

反应体系：pMD18-T simple-GFP质粒或pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

S2042、胶回收BglII/NheI双酶切产物：

使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，按照试剂盒胶回收操作说明书进行：将S2041中得到的pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下720bp大小的目的DNA条带；将S2041中得到的pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

分别使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收，分别得到pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切后胶回收产物，pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

S2043、在16℃的温度条件下，使用DNA Ligation Kit将S2042中得到的pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切后胶回收产物和pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

连接反应体系：pMD18-T simple-GFP质粒BglII/NheI双酶切后胶回收产物500ng、pMD18-T simple-pRPS-30::RPS-30

S2044、转化涂板：

在-80℃温度中取出E.coli TOP10感受态细菌，置于冰上融化后，将25μL S2043中得到的BglII/NheI双酶切后胶回收产物的连接产物加入其中，轻轻吹打混匀，冰浴30min；42℃温度下热应激90s，然后冰浴2min，加入1mLLB培养，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡条件下培养1h；4000g离心4min，弃上清液，留下30μL残留菌液，轻轻捶打沉淀至菌液均匀，将菌液滴加至含AMP抗性的固体LB培养基中，并涂布均匀，置于37℃细菌培养箱中过夜培养；

S2045、测序鉴定：

在S2044中过夜培养的固体LB培养板中分别挑取单克隆菌落，分别置于3mL含AMP抗性的液体LB培养基中，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡条件下培养10h；分别取1mL菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S2046、提取pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，按照试剂盒质粒提取操作说明书进行：根据S2045得测序结果，选择测序正确的单克隆菌落，取1mL菌液于1.5mL EP管中，12000g离心1min，弃上清液，加入250μL S1溶液，吹打混匀，加入250μL S2溶液，温和颠倒混匀6-8次，加入350μL S3溶液，温和颠倒混匀6-8次，12000g离心10min，取上清至吸附柱，12000g离心1min，弃滤液，加入500μLW1缓冲液，12000g离心1min，弃滤液，加入700μLW2缓冲液洗2次，12000g离心1min，弃滤液；将吸附柱放置在新的1.5mL EP管上，开盖干燥3min，加入50μLddH

S3、构建p PD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

S301、KpnI/EcoRI限制性内切酶双酶切；

在37℃的温度条件下，KpnI/EcoRI限制性内切酶对pPD95.77质粒进行5h的双酶切反应，得到pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切产物；

在37℃的温度条件下，KpnI/EcoRI限制性内切酶对S2046中得到的pMD18-Tsimple-pRPS-30::GFP::RPS-30

反应体系：pPD95.77质粒或pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

S302、胶回收KpnI/EcoRI双酶切产物：

使用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit，按照试剂盒胶回收操作说明书进行：将S301中得到的pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下3562bp大小的目的DNA条带；将S301中得到的pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

经过AxyPrepDNAGelExtractionKit胶回收试剂盒回收，分别得到pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切后胶回收产物，pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

S303、在16℃的温度条件下，使用DNA Ligation Kit将S302中得到的pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切后胶回收产物和pMD18-T simple-pRPS-30::GFP::RPS-30

连接反应体系：pPD95.77质粒KpnI/EcoRI双酶切后胶回收产物100ng、pMD18-Tsimple-pRPS-30::GFP::RPS-30

S304、转化涂板：

在-80℃的保存温度中取出E.coli TOP10感受态细菌，加入S303中得到的KpnI/EcoRI双酶切后胶回收产物的连接产物，冰浴30min然后在42℃温度下热应激90s，再冰浴2min，加入1mLLB液体培养基培养，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养1h，经离心得到转化后的残留菌液，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；

S305、测序鉴定：

在S304中过夜培养的固体LB培养板中分别挑取单克隆菌落，分别置于3mL含AMP抗性的液体LB培养基中，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡条件下培养10h；分别取1mL菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S306、提取pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，按照试剂盒质粒提取操作说明书进行：根据S305的测序结果，选择测序正确的单克隆菌落，取1mL菌液于1.5mL EP管中，12000g离心1min，弃上清，加入250μL S1溶液，吹打混匀，加入250μL S2溶液，温和颠倒混匀6-8次，加入350μL S3溶液，温和颠倒混匀6-8次，12000g离心10min，取上清液至吸附柱，12000g离心1min，弃滤液，加入500μLW1缓冲液，12000g离心1min，弃滤液，加入700μL W2缓冲液洗2次，12000g离心1min，弃滤液；将吸附柱放置在新的1.5mL EP管上，开盖干燥3min，加入50mLddH

S4、构建pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

S401、SmaI/KpnI限制性内切酶双酶切；

在37℃的温度条件下，SmaI/KpnI限制性内切酶对S306中得到的pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

在37℃的温度条件下，SmaI/KpnI限制性内切酶对S1034中得到的pMD18-Tsimple-pU6::shRNA(RPS-30

反应体系：pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

S402、胶回收SmaI/KpnI双酶切产物：

使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，按照试剂盒胶回收操作说明书进行：将S401中得到的pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

经过AxyPrepDNAGelExtractionKit胶回收试剂盒回收，分别得到pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

S403、在16℃的温度条件下，使用DNA Ligation Kit将S402中得到的pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

连接反应体系：pPD95.77-pRPS-30::GFP::RPS-30

S404、转化涂板：

在-80℃温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，置于冰上融化后，将25μL S403中得到的KpnI/EcoRI双酶切后胶回收产物的连接产物加入其中，轻轻吹打混匀，冰浴30min；42℃热应激90s，然后冰浴2min，加入1mLLB液体培养基，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡条件下培养1h；4000g离心4min，弃上清液，留下30μL残留菌液，轻轻捶打沉淀至菌液均匀，将菌液滴加至含AMP抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于37℃细菌培养箱中过夜培养；

S405、测序鉴定：

在S404中过夜培养的固体LB培养板中分别挑取单克隆菌落，分别置于3mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃，转速为250rpm/min摇床震荡条件下培养10h；分别取1mL菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；

S406、提取pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，按照试剂盒质粒提取操作说明书进行：根据S405的测序结果，选择测序正确的单克隆菌落，取1mL菌液于1.5mL EP管中，12000g离心1min，弃上清液，加入250μL S1溶液，吹打混匀，加入250μL S2溶液，温和颠倒混匀6-8次，加入350μL S3溶液，温和颠倒混匀6-8次，12000g离心10min，取上清液至吸附柱，12000g离心1min，弃滤液，加入500μLW1缓冲液，12000g离心1min，弃滤液，加入700μLW2缓冲液洗2次，12000g离心1min，弃滤液；将吸附柱放置在新的1.5mL EP管上，开盖干燥3min，加入50μLddH

实施例2

本实施例为实施例1的延长秀丽线虫健康寿命的转基因—即质粒pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

1、实验所用秀丽线虫；

秀丽隐杆线虫野生型标准株N2由本实验室保存培养。

2、主要试剂；

Escherichia coli尿嘧啶突变菌株(OP50)由本实验室保存；显微注射用油Halocarbon oil 700；购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma)。

3、仪器和设备；

台式离心机(日本)、倒置荧光显微镜(OlympusIX71)、微操作注射器(IM300，Narishige)、MOTIC体式解剖镜(中国)、P-2000水平程控激光微电极拉制仪(美国Sutter公司)、生化培养箱。

4、主要溶液

(1)M9缓冲液的配制：使用分析天平准确称量3g KH

(2)线虫生长培养基(Nematode Growth Medium，NGM)的配制：使用分析天平准确称量3gNaCl，2.5g胰蛋白胨、17g琼脂，添加975mL ddH

5、秀丽线虫转染质粒；

实施例1中制备的延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒，即为pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

6、显微注射转染秀丽线虫；

①显微注射准备工作；

Pad的制作：将2％琼脂糖滴于盖玻片上，用另一个盖玻压成极薄的琼脂糖薄片，放置室温干燥过夜，4℃保存备用；

显微注射用针的制备：使用P-200水平程控光微电极拉制仪(美国Sutter公司)将毛细玻璃管(FHC，Borosil1.0mmOD×0.75mmID/Fiber)制成显微注射用针；

显微注射用油：卤化碳油Halocarbonoil700；

②C.elegans(N2)虫体准备；

在NGM培养基培养C.elegans(N2)，20℃培养至四期幼虫(L4)时，挑取近L4幼虫于新的NGM培养基中，培养12～14h后进行显微注射；

③显微注射质粒的制备；

将实施例1中制备的pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

④显微注射程序；

a.打开显微注射仪，按下mode键，调节至action界面；

b.打开N

c.按下显微注射仪上的balance键；

d.脚踏踏板检查载针器出气是否流畅；

e.装针，将载针器的端部轻轻拧松，然后把已装有注射质粒的玻璃针的尾部轻轻插入载针器中，拧紧端部使针固定；

f.找针，先将10×物镜调至最上端，调节针尖使其成30～45度角位于物镜中心垂直上方较近的距离，打开光源，在视野下调节物镜使其缓慢下降，直至视野中出现针尖为止，然后调节针尖在40×视野下的最佳位置；

g.撞针，将预先制备好的撞针载玻片放到载物台上，调节40×物镜至能够清晰看到玻璃管，并调节载玻片使玻璃管垂直与注射针。调节载针器，使针缓慢下移至视野里出现针尖，并与玻璃管处于同一平面，轻轻用针撞击玻璃管(最好撞击同时踩踏板)，然后踩踏板检查是否液体流出成液滴；

h.挑虫，在制备好的pad上滴一滴Halocarbonoil700，观察NGM培养基中的虫体(C.elegans)，挑取约有5个以上～单排虫卵的虫体，将其固定在pad上的卤化碳油中(最好头部不要固定)；

i.注射，视野下尾部上缘和咽部下缘有两处较明显的透明处为虫体的性腺部位，将针尖斜插进性腺合胞体区域，踩踏踏板进行注射(最好当针尖进入合胞体同时踩踏，以免堵塞针尖)；

j.注射后，调节载针器使针抬起，取下pad在显微镜下将虫体挑到NGM培养基中；7、筛选转基因虫株；

经显微注射转染后的虫体(F0)放于NGM培养基中，4条/皿。3天后于荧光显微镜下挑取发绿荧光L4虫体为F1代，置于新的NGM培养基中，4条/皿；4天后于荧光显微镜下挑取绿荧光L4虫体为F2代。用F2代虫体进行下一步紫外辐照构建稳转转基因品系。

8、紫外辐照构建稳转转基因虫株(使用Spectrolinker紫外交联仪XLE-1000)

挑取60条发绿荧光的L4虫体，放入新NGM培养板中(无OP50)，20条/板。15℃培养2h后，打开皿盖，在紫外交联仪中以120J/m2紫外照射量对虫体进行辐照。辐照后的虫体为F0代，于20℃培养。于荧光显微镜下挑取100条绿荧光的F1代L4虫体，1条/板，20℃培养。观察F2代虫体，选择产生大量(约70％)具有绿荧光F2代的F1代平板，每板挑取4条F2代L4虫体，1条/板，20℃培养。观察F3代虫体，找到100％具有绿荧光F3代的F2代平板，每板挑取8条具有绿荧光的F3代L4虫体，1条/板，20℃培养。持续扩繁虫体，至虫体所发荧光强度不变，则建立了稳定遗传的pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

9、转基因虫体各种生物学表型检测；

(1)虫体同期化处理

在NGM培养基中，将秀丽隐杆线虫培养至成虫阶段，用3mLM9缓冲液将虫体洗下，转移到5mL离心管中，调整溶液总体积达到2.8mL，然后依次加入0.8mLNaOCl溶液，0.4mL5MNaOH溶液，充分混匀，待约有2/3的虫体裂解时，5500rpm离心1min，弃上清液，用M9缓冲液洗两遍，获得成虫体内虫卵；将制备好的虫卵置于4mLM9缓冲液中孵化过夜，即可获得L1期幼虫；将L1期幼虫接种于NGM培养基中，20℃培养，于12h、20h、30h、48h即可分别获得L2、L3、L4、成虫期虫体。

(2)shRNA(RPS-30

①提取虫体总RNA、反转录获得cDNA

方法同S2014和S2015。

②为了检测针对rps-30基因泛素样蛋白RPS-30

RTrps30P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

RTrps30P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

RT s30P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；

RT s30P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

RTUbLP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

RTUbLP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；

qRT-PCR采用25μl体系，具体操作按照THUNDERBIRDSYBRq PCRMix(TOYOBO)进行。qRT-PCR反应体系：cDNA，2μL；RTrps30P1或RT s30P1或RTUbLP1,0.5μL；RTrps30P2或RTs30P2或RTUbLP2，0.5μL；qPCRMix5μL；H

RTact-1P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；

RTact-1P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；

相对定量的计算采用比较CT值的方法。将所取得的数据进行one-wa yANOVA统计学分析和Student'st-tests，取p<0.05定为差异显著。

结果显示：

转基因虫体中rps-30、rps-30

pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

结果表明：pU6::shRNA(RPS-30

(3)转基因虫体寿命检测

挑取10条L4期虫体放置在NGM培养基中20℃培养15h。虫体产卵后，挑出成虫。虫卵孵化后，幼虫放置于新的NGM培养基中，1条/皿，20℃培养。每天观察一次，直至虫体死亡。产卵期，则要将虫体每两天更换新的培养基。判定线虫死亡的标准为用铂金丝触碰虫体无反应即为死亡，记录每条虫体存活时间，本试验重复3次，每次检测虫体量40条。所取得的数据进行one-wayANOVA统计学分析和Student'st-tests，取p<0.05为差异显著。

寿命检测结果显示：

与pPD95.77-pRPS-30::GFP转基因虫体及秀丽线虫野生型标准虫株N2相比，pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

寿命检测结果表明：pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

(4)转基因虫体产卵量检测

挑取40条L4期虫体放置在NGM培养基中，1条/皿，20℃培养。待虫体产卵期，每天更换一次新培养基；旧的培养基3天后待虫卵孵化、发育至成虫后，数出虫体数量，即为虫体每天产卵量，直至产卵期停止，最后计算出每条虫体总产卵量，本试验重复3次。所取得的数据进行one-way ANOVA统计学分析和Student'st-tests，取p<0.05定为差异显著。

产卵量检测结果显示：

与pPD95.77-pRPS-30::GFP转基因虫体及秀丽线虫野生型标准虫株N2相比，pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

产卵量检测结果表明：

pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

(5)转基因虫体体长检测

将不同处理虫体挑到玻片上，拍照后，使用java图像处理程序测量。虫体体长从鼻部到尾尖部。所取得的数据进行one-wayANOVA统计学分析和Student'st-tests，取p<0.05定为差异显著。

体长检测结果显示：

与pPD95.77-pRPS-30::GFP转基因虫体及秀丽线虫野生型标准虫株N2相比，pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

体长检测结果表明：

pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

(6)转基因虫体热应激检测

挑取L4挑到新培养基中，40条/皿，在20℃培养18h,然后将温度提升到37℃。在每小时直接从37℃取出3个培养基，放于20℃培养12h。计数后直接弃掉。热应激死亡的检测是通过用铂金针触碰虫体头部，不动视为死亡。所取得的数据进行one-wayANOVA统计学分析和Student'st-tests，取p<0.05定为差异显著。

热应激检测结果显示：

与pPD95.77-pRPS-30::GFP转基因虫体及秀丽线虫野生型标准虫株N2相比，pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

热应激检测结果表明：

pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

(7)转基因虫体氧化应激检测

取24孔培养板，每孔加入200μL含有3mMH

氧化应激检测结果显示：

与pPD95.77-pRPS-30::GFP转基因虫体及秀丽线虫野生型标准虫株N2相比，pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

氧化应激检测结果表明：

pPD95.77-pU6::shRNA(RPS-30

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。