茶多酚在制备抑制细菌产生抗生素耐药性的药物中的应用

摘要

本发明提供了茶多酚在制备抑制细菌产生抗生素耐药性的药物中的应用，属于药物技术领域。本发明证明茶多酚能够降低抗生素和非抗生素药物诱导的细菌耐药突变频率，预防多重抗生素耐药菌的产生。本发明首次公开茶多酚在预防多重抗生素耐药菌产生的作用及应用，为耐药细菌的抗感染治疗提供新途径。

说明书

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及茶多酚在制备抑制细菌产生抗生素耐药性的药物中的应用。

背景技术

细菌抗生素耐药性是全球公共卫生问题。在临床环境中，与易感细菌引起的细菌感染相比，抗生素耐药菌感染减少了可选择的有效治疗方案，进而提高了发病率和死亡率。《柳叶刀》在2022年报道，2019年抗生素耐药菌感染直接导致了全球约127万人死亡，而且至2050年每年预计将有1000万人死于抗生素耐药菌。

抗生素滥用和长期服用是抗生素耐药菌大量出现的主要原因。感冒、肠炎、扁桃体炎、感染都被列为抗生素的适应症。此外，越来越多研究报道，除了抗生素能够诱导细菌产生抗生素耐药性，服用非抗生素药物(例如二甲双胍、氟西汀、度洛西汀等)也能够诱导肠道细菌产生抗生素耐药性；2018年，Nature报道了270多种非抗生素药物能够抑制肠道至少一种微生物的生长，并认为这些非抗生素药物可能具有促进细菌产生抗生素耐药性的潜在风险，甚至导致全球公共卫生问题。

细菌耐药性问题严峻，对抗生素疗法提出了巨大的挑战，更对人类健康构成严重威胁。为了有效控制临床抗生素耐药菌的产生和传播，必须开发抗生素耐药菌的防控药物。目前，临床上针对抗生素耐药菌，往往采取治疗手段，包括抗生素联合疗法和新药研发等，由于细菌耐药的发展速度远远快于新药的研发速度，而抗生素联合疗法对超级耐药菌控制效果有限，所以寻找预防或抑制细菌产生抗生素耐药性的有效手段应当成为应对多重耐药细菌感染的重要途径，然而目前，相关技术尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供茶多酚在制备抑制细菌产生抗生素耐药性的药物中的应用。

本发明提供了茶多酚在制备抑制细菌产生抗生素耐药性的药物中的应用。

优选的，所述茶多酚包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类。

优选的，所述茶多酚在药物中的浓度为200～800mg/g。

优选的，所述细菌包括由临床药物导致的产生抗生素耐药性的病原菌；

所述临床药物包括抗生素和非抗生素药物。

优选的，所述抗生素包括以下抗生素中的三种以上：亚胺硫霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、阿奇霉素、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑啉、头孢西丁、环丙沙星、多尼培南、厄他培南、替加环素、多粘菌素B、头孢吡肟、妥布霉素、左氧氟沙星、多西环素、氨曲南、米诺环素、美罗培南和阿米卡星。

优选的，所述非抗生素药物包括以下任意一种或两种以上：二甲双胍、氟西汀和度洛西汀。

优选的，所述病原菌包括埃希氏菌属(Escherichia Castellani and Chalmers)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和假单胞菌属(Pseudomonas)。

优选的，所述埃希氏菌属包括大肠杆菌(Escherichia coli)；

所述埃克雷伯氏菌属包括肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)；

所述假单胞菌属包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；

本发明提供了一种预防抗生素耐药菌产生的药物，包括茶多酚和导致细菌产生抗生素耐药性的成分；

所述茶多酚和导致细菌产生抗生素耐药性的成分的质量比为0.8～1.2:0.8～1.2。

优选的，所述导致细菌产生抗生素耐药性的成分包括抗生素和非抗生素药物；

所述抗生素优选包括以下抗生素中的三种以上：亚胺硫霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、阿奇霉素、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑啉、头孢西丁、环丙沙星、多尼培南、厄他培南、替加环素、多粘菌素B、头孢吡肟、妥布霉素、左氧氟沙星、多西环素、氨曲南、米诺环素、美罗培南和阿米卡星；

所述非抗生素药物优选包括以下任意一种或两种以上：二甲双胍、氟西汀和度洛西汀。

本发明提供了茶多酚在制备抑制细菌产生抗生素耐药性的药物中的应用。本发明实验证明，二甲双胍、氯霉素、头孢他啶和头孢唑啉均能诱导细菌产生多重抗生素耐药性，而茶多酚在体内外均能有效抑制细菌产生抗生素耐药性。本发明实施例结果表明，与对照组(无菌水处理组)细菌的突变频率相比，二甲双胍、氯霉素、头孢他啶和头孢唑啉能够显著升高细菌突变频率，产生多重抗生素耐药菌；而添加茶多酚后各组突变频率与对照组的突变频率相比无显著差异，说明茶多酚能够抑制以二甲双胍为代表的非抗生素和以氯霉素、头孢他啶和头孢唑啉为代表的抗生素诱导的细菌抗生素耐药性的产生。本发明首次公开茶多酚在抑制细菌抗生素耐药性方面的作用及应用，为耐药细菌的抗感染治疗提供新途径。

附图说明

图1为二甲双胍和氯霉素暴露下肠道细菌耐氯霉素突变频率结果；其中*表示p值＜0.05；

图2为肠道细菌耐氯霉素分离株抗生素敏感性结果；

图3为茶多酚暴露下肠道细菌耐氯霉素突变频率结果，*表示p值＜0.05；#表示p值＞0.05；

图4为各药物单独和联合暴露下大肠杆菌耐氯霉素突变频率结果；*表示p值＜0.05；#表示p值＞0.05；

图5为大肠杆菌耐氯霉素突变株抗生素敏感性结果；

图6为各药物单独和联合暴露下铜绿假单胞菌耐氯霉素突变频率结果，*表示p值＜0.05；#表示p值＞0.05；

图7为铜绿假单胞菌耐氯霉素突变株抗生素敏感性结果；

图8为各药物单独和联合暴露下肺炎克雷伯菌耐氯霉素突变频率结果，*表示p值＜0.05；#表示p值＞0.05；

图9为肺炎克雷伯菌耐氯霉素突变株抗生素敏感性结果。

具体实施方式

本发明提供了茶多酚在制备抑制细菌产生抗生素耐药性的药物中的应用。

在本发明中，所述茶多酚优选包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类。所述茶多酚的有效浓度体外优选为5～15mg/L，更优选10mg/L；体内优选为100～300mg/kg体重，更优选200mg/kg体重。所述动物优选为大鼠。在本发明中，所述茶多酚购自上海源叶生物科技有限公司。

在本发明中，导致细菌产生抗生素耐药性的临床药物优选包括由抗生素和/或非抗生素药物导致的细菌产生抗生素耐药性。所述抗生素优选包括以下抗生素中的三种以上：亚胺硫霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、阿奇霉素、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑啉、头孢西丁、环丙沙星、多尼培南、厄他培南、替加环素、多粘菌素B、头孢吡肟、妥布霉素、左氧氟沙星、多西环素、氨曲南、米诺环素、美罗培南和阿米卡星；更优选包括氯霉素、头孢他啶和头孢唑啉。所述氯霉素、头孢他啶和头孢唑啉的有效浓度分别优选为2～8mg/L，更优选分别为4mg/L、2mg/L和4mg/L。所述非抗生素药物优选包括二甲双胍、氟西汀和度洛西汀，更优选包括二甲双胍。所述二甲双胍的体外有效浓度优选为1～100mg/L，更优选为10mg/L；所述二甲双胍的体内有效浓度优选为150～250mg/kg，更优选为200mg/kg体重。所述细菌包括肠道细菌，例如埃希氏菌属、埃克雷伯氏菌属和假单胞菌属。所述埃希氏菌属优选包括大肠杆菌；所述埃克雷伯氏菌属优选包括肺炎克雷伯菌；所述假单胞菌属优选包括铜绿假单胞菌。

在本发明实施例中，体内实验，将二甲双胍和氯霉素灌胃大鼠，分离得到耐氯霉素分离株，经药敏实验，表明二甲双胍和氯霉素能够使肠道细菌产生多重抗生素耐药性，其中对四环素类中的四环素、多西环素和米诺环素，氯霉素类中的氯霉素，大环内酯类的阿奇霉素的MIC均超过耐药限值。体外实验，将大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌分别暴露在一定浓度二甲双胍和氯霉素(头孢他啶和头孢唑啉)的LB培养基中，暴露实验结果表明，与未暴露的细菌相比，暴露在二甲双胍和氯霉素(头孢他啶和头孢唑啉)下，细菌突变频率和多种抗生素MIC显著提高。在本发明实施例中，以突变频率和抗生素敏感性为指标说明细菌的抗生素耐药性情况，体内和体外暴露实验结果表明，添加茶多酚后能够明显抑制细菌抗生素耐药性的产生，说明茶多酚能够预防细菌产生抗生素耐药性。

在本发明中，在体内和体外条件下均证实，茶多酚均能有效抑制细菌产生抗生素耐药性。

本发明提供了一种预防抗生素耐药菌产生的药物，包括茶多酚和导致细菌产生抗生素耐药性的成分；所述茶多酚和导致细菌产生抗生素耐药性的成分的质量比为0.8～1.2:0.8～1.2。

在本发明中，所述导致细菌产生抗生素耐药性的成分优选包括抗生素和非抗生素药物。所述抗生素优选包括以下抗生素中的三种以上：亚胺硫霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、阿奇霉素、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑啉、头孢西丁、环丙沙星、多尼培南、厄他培南、替加环素、多粘菌素B、头孢吡肟、妥布霉素、左氧氟沙星、多西环素、氨曲南、米诺环素、美罗培南和阿米卡星，更优选包括氯霉素、头孢他啶和头孢唑啉。所述非抗生素药物优选包括以下任意一种或两种以上：二甲双胍、氟西汀和度洛西汀，更优选包括二甲双胍。所述茶多酚和导致细菌产生抗生素耐药性的成分的质量比优选为1:1。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的临床用药的常规制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的茶多酚在制备抑制细菌产生抗生素耐药性的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

二甲双胍和氯霉素能够诱导肠道细菌产生多重抗生素耐药性

选用13～14周龄ZDF雄性糖尿病模型鼠(ZDF

突变频率＝N

其中N

肠道大肠菌群突变频率如图1所示，结果显示，当连续灌胃糖尿病大鼠8周后，二甲双胍组和氯霉素组突变频率达到最高，分别为5.89×10

对上述分离的二甲双胍组(MET-CHL

参照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI)推荐的Mueller-Hinton(MH)微量肉汤稀释法，利用Thermo FisherScientific公司生产的比浊仪、全自动加样仪AIM、微生物鉴定和药敏分析仪进行抗生素敏感性实验。药敏板(编号分别为CHNM4F和GNX2F)可检测22种抗生素，分别是亚胺硫霉素(Imipenem，IPM)、四环素(Tetracycline，TET)、庆大霉素(Gentamicin，GEN)、氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、阿奇霉素(Azithromycin，AZI)、头孢噻肟(Cefotaxime，FOT)、头孢他啶(Ceftazidime，TAZ)、头孢唑啉(Cefazolin，FAZ)、头孢西丁(Cefoxitin，FOX)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、多尼培南(Donipenem，DOR)、厄他培南(Ertapenem，ETR)、替加环素(Tigecycline，TGC)、多粘菌素B(PolymyxinB，POL)、头孢吡肟(Cefepime，FEP)、妥布霉素(Tobramycin，TOB)、左氧氟沙星(Levofloxacin，LEVO)、多西环素(Doxycycline，DOX)、氨曲南(Aztreonam，AZT)、米诺环素(Minocycline，MIN)、美罗培南(Meropenem，MERO)、阿米卡星(Amikacin，AMI)。

具体步骤如下：(1)挑取待检测菌株3株，以野生大肠杆菌K12为对照(3株)，同时加入不含抗生素的无菌LB液体培养基中，37℃，150r/min过夜培养；

(2)将过夜培养的突变株划线至不含抗生素的LB琼脂培养基中，37℃倒置培养24h；

(3)配制菌悬液：用接种环挑取平板上过夜培养的突变株至5mL蒸馏水中，振荡混匀；

(4)插上比浊仪电源，轻柔颠倒混匀标准管3～5次，将标准管插入检测孔进行校准，此时为0.5麦氏(McFarland，MCF)标准浊度；

(5)将制备好的菌悬液试管放入检测孔进行校准；

(6)吸取10μL校准后的菌悬液(0.5MCF)至含有11mL的MH肉汤培养基的试管中，此时得到接种密度为5×10

(7)Sensititre

(8)将药敏板装载到AIM装载架上，药敏板的条形码朝向自己；

(9)根据仪器指示选择50μL加样体积；

(10)加样完成后，及时用贴上封膜，37℃培养24h后上机检测；

(11)培养完成后将药敏板放置在药敏检测仪的待检区域，根据SWIN软件操作说明进行抗生素敏感性检测。

结果如图2所示，针对检测的22种抗生素，二甲双胍组和氯霉素组的耐氯霉素分离株对亚胺硫霉素、四环素、氯霉素、阿奇霉素、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑啉、环丙沙星、替加环素、头孢吡肟、多西环素和米诺环素的最小抑菌浓度(Minimal InhibitoryConcentration，MIC)与大肠杆菌野生株的MIC相比，均有不同程度的提高(2～32倍)且其对四环素类中的四环素、多西环素和米诺环素，氯霉素类中的氯霉素，大环内酯类的阿奇霉素的MIC均超过耐药限值，其中，多西环素的MIC提高最多，达到了32倍，以上结果说明二甲双胍和氯霉素诱导的肠道耐氯霉素分离株对四环素类、氯霉素类和大环内酯类抗生素耐药，为多重抗生素抗性菌。

实施例2

茶多酚能够抑制肠道细菌产生多重抗生素耐药性

选用13～14周龄ZDF雄性糖尿病模型鼠(ZDF

肠道大肠菌群突变频率如图3所示，结果显示，与对照组的突变频率(＜2.35×10

实施例3

茶多酚能够抑制大肠杆菌产生抗生素耐药性

大肠杆菌K12MG1665(菌株编号为ATCC700926)接种到LB培养基中，在150rpm、37℃的摇床上孵育12h，使菌液浓度达到10

实验共分为18组，分别是对照组(无菌水处理)、二甲双胍组(10mg/L)、氯霉素组(4mg/L)、茶多酚组(10mg/L)、蓝莓提取物组(10mg/L)、葡萄籽提取物组(10mg/L)、花青素组(10mg/L)、虾青素组(10mg/L)、二甲双胍+茶多酚(10mg/L)组、二甲双胍+蓝莓提取物(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+葡萄籽提取物(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+花青素(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+虾青素(10mg/L)组、氯霉素(4mg/L)+茶多酚(10mg/L)组、氯霉素(4mg/L)+蓝莓提取物(10mg/L)组、氯霉素(4mg/L)+葡萄籽提取物(10mg/L)组、和氯霉素(4mg/L)+花青素(10mg/L)组和氯霉素(4mg/L)+虾青素(10mg/L)组。在37℃下以150rpm在摇床上孵育24h后，吸取100μL药物暴露的大肠杆菌培养物接种到含有16mg/L氯霉素的远藤琼脂(BD，USA)平板上，观察有无抗生素耐药菌产生，并进行抗生素敏感性实验。

突变频率和抗生素敏感性的结果如图4和图5所示，结果表明，二甲双胍、氯霉素能够诱导大肠杆菌产生抗生素耐药性(*p＜0.05)；而添加茶多酚之后能够抑制大肠杆菌产生抗生素耐药性，说明茶多酚能够预防大肠杆菌产生抗生素耐药性。

实施例4

茶多酚能够抑制铜绿假单胞菌产生抗生素耐药性

铜绿假单胞菌(菌株编号为ATCC27853)接种到LB培养基中，在150rpm、37℃的摇床上孵育12h，使菌液浓度达到10

共分为18组，分别是对照组(无菌水处理)、二甲双胍组(10mg/L)、头孢他啶组(2mg/L)、茶多酚组(10mg/L)、蓝莓提取物组(10mg/L)、葡萄籽提取物组(10mg/L)、花青素组(10mg/L)、虾青素组(10mg/L)、二甲双胍(10mg/L)+茶多酚(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+蓝莓提取物(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+葡萄籽提取物(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+花青素(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+虾青素(10mg/L)组、头孢他啶(2mg/L)+茶多酚(10mg/L)组、头孢他啶(2mg/L)+蓝莓提取物(10mg/L)组、头孢他啶(2mg/L)+葡萄籽提取物(10mg/L)组、头孢他啶(2mg/L)+花青素(10mg/L)组和头孢他啶(2mg/L)+虾青素(10mg/L)组。在37℃下以150rpm在摇床上孵育24h后，吸取100μL药物暴露的铜绿假单胞菌培养物接种到含有8mg/L头孢他啶的假单胞菌琼脂基础培养基(BD，USA)，观察有无抗生素耐药菌产生，并进行抗生素敏感性实验。

突变频率和抗生素敏感性的结果如图6和图7所示，结果表明，二甲双胍、头孢他啶能够诱导铜绿假单胞菌产生多重抗生素耐药性(*p＜0.05)；而添加茶多酚之后能够抑制铜绿假单胞菌产生抗生素耐药性，说明茶多酚能够预防铜绿假单胞菌产生抗生素耐药性。

实施例5

茶多酚能够抑制肺炎克雷伯菌产生抗生素耐药性

肺炎克雷伯菌(菌株编号为ATCC700603)接种到LB液体培养基中，在150rpm、37℃的摇床上孵育12h，使菌液浓度达到10

共分为18组，分别是对照组、二甲双胍组(10mg/L)、头孢唑啉组(4mg/L)、茶多酚组(10mg/L)、蓝莓提取物组(10mg/L)、葡萄籽提取物组(10mg/L)、花青素组(10mg/L)、虾青素组(10mg/L)、二甲双胍(10mg/L)+茶多酚组、二甲双胍(10mg/L)+蓝莓提取物(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+葡萄籽提取物(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+花青素(10mg/L)组、二甲双胍(10mg/L)+虾青素(10mg/L)组、头孢唑啉(4mg/L)+茶多酚(10mg/L)组、头孢唑啉(4mg/L)+蓝莓提取物(10mg/L)组、头孢唑啉(4mg/L)+葡萄籽提取物(10mg/L)组、头孢唑啉(4mg/L)+花青素(10mg/L)组和头孢唑啉(4mg/L)+虾青素(10mg/L)组。在37℃下以150rpm在摇床上孵育24h后，吸取100μL药物暴露的肺炎克雷伯菌培养物接种到含有16mg/L头孢唑啉的远藤琼脂(BD，USA)平板上，观察有无抗生素耐药菌产生，并进行抗生素敏感性实验。

突变频率和抗生素敏感性的结果如图8和图9所示，结果表明，二甲双胍、头孢唑啉能够诱导肺炎克雷伯菌产生多重抗生素耐药性(*p＜0.05)；而添加茶多酚之后能够抑制肺炎克雷伯菌产生抗生素耐药性，说明茶多酚能够预防肺炎克雷伯菌产生抗生素耐药性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。