lncRNACACF吸附miR-106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用

摘要

本发明公开了lncRNACACF吸附miR‑106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用。本发明采用细胞生物学的方法第一次证实了长链非编码RNA CACF在人脐静脉内皮细胞中竞争性吸附miR‑106a，并通过GFP‑mRFP‑LC3标记法，证实了lncRNA CACF吸附miR‑106a促进人脐静脉内皮细胞自噬进程中的应用。本发明提供了lncRNA CACF作为人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂的新用途，以及miR‑106a作为人脐静脉内皮细胞自噬抑制剂的新用途，有利于进一步开展人脐静脉内皮细胞自噬相关疾病发生、发展及治疗的研究。

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及lncRNA CACF吸附miR-106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用。

背景技术

心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)是一种严重危害人类健康的心血管疾病。促进MI后的血管新生能改善MI后的心脏功能。新生的血管是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而来，主要包括血管内皮细胞的增殖、出芽和迁移。自噬是将细胞内受损的蛋白质及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的过程，是细胞的自我更新，能防止损伤的蛋白质及细胞器的积累，现有研究认为，促进细胞自噬能改善心肌梗死后心功能恢复。

长链非编码RNA(Long Non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200nt的非编码RNA，可作为重要调节因子参与到包括MI在内的各种疾病的发生和/或发展中。研究表明，lncRNA可以通过竞争性吸附miRNA，抑制微小核糖核酸(microRNA，miRNA)对mRNA的降解作用，进而发挥其生理功能。lncRNA CACF(Cardiac autophagy contributory factor，暂命名)测序编号为lncRNA XLOC_083933在心肌梗死后促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖和血管成型。但其对HUVECs细胞自噬的调控尚没有报道。

miRNA是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度约为22个核苷酸，可通过与信使核糖核酸(Messenger Ribonucleic Acid，mRNA)的3’非翻译区(untranslated region，UTR)不同程度的互补配对，诱导靶基因mRNA降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控靶基因的表达。现有研究表明miR-106a在多种癌细胞中通过调控细胞自噬来发挥作用，但目前尚无关于miR-106a对人脐静脉内皮细胞自噬调控的相关报道。

发明内容

为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供lncRNA CACF在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供miR-106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬抑制剂中的应用。

本发明的再一目的在于提供lncRNA CACF吸附miR-106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

lncRNA CACF在制备人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂中的应用，体外环境下，lncRNACACF正调控人脐静脉内皮细胞自噬；通过调节lncRNA CACF的表达水平，可实现人脐静脉内皮细胞自噬调控；所述的lncRNA CACF如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，增加外源性lncRNA CACF，人脐静脉内皮细胞自噬小体增加；抑制lncRNA CACF的表达，人脐静脉内皮细胞自噬小体减少。

进一步地，所述的lncRNA CACF通过竞争性吸附miR-106a，实现人脐静脉内皮细胞自噬调控。

miR-106a在制备人脐静脉内皮细胞自噬抑制剂中的应用，体外环境下，miR-106a负调控人脐静脉内皮细胞自噬；通过调节miR-106a的表达水平，可实现人脐静脉内皮细胞自噬调控。

进一步地，增加外源性miR-106a，人脐静脉内皮细胞自噬小体减少；抑制miR-106a表达，人脐静脉内皮细胞自噬小体增加。

进一步地，上述应用中：

所述的增加外源性lncRNA CACF通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：

(1)提取人脐静脉内皮细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；

(2)将目的片段连接到用限制性内切酶BamH I和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。

步骤(1)中进行PCR扩增所用引物如下所示：

PCR-CACFForward：5′-GGGGTACCCCTCACGGAAAGGGGCGG-3′；

PCR-CACF Reverse：5′-GGAATTCGCCCGGCATGGGGGAC-3′。

所述的抑制lncRNA CACF表达降低通过反义寡核苷酸实现，反义寡核苷酸序列如下：

5′-CGAAUCCACUUUCGCUUCUGAGAUUCACCGGCCUCACACUACCAAAUAGGAG AAAGUAAUCUGUGCAUUUCUUUCGCGUCUGAGAUUCACCGGCCUCCCUGGGCAGAC AUUACCUGATT-3′。

所述的增加外源性miR-106a通过miR-106a模拟物实现，采用的miR-106amimic的序列如下：

5′-AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3′。

所述的抑制miR-106a表达降低通过miR-106a核酸抑制物实现，采用的miR-106ainhibitor的序列如下：

5′-UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGA-3′。

本发明通过基因工程技术改变lncRNA CACF在人脐静脉内皮细胞中的表达量，确定其在调控人脐静脉内皮细胞自噬中的作用。

本发明通过比对lncRNA CACF与miRbase数据库中成熟miRNAs的序列，筛选出与lncRNA CACF(SEQ ID NO：1)存在序列匹配的miR-106a(SEQ ID NO：2)，通过RNA pull down实验和双荧光素酶实验分别在细胞外和细胞内验证了两者之间的结合。

本发明通过基因工程技术改变miR-106a在人脐静脉内皮细胞中的表达量，确定其在调控人脐静脉内皮细胞自噬中的应用。

本发明的验证结果如下：

1、本发明通过GFP-mRFP-LC3标记检测人脐静脉内皮细胞的自噬水平，发现超表达lncRNA CACF后，与对照组(pcDNA3.1)相比，人脐静脉内皮细胞的自噬水平显著增加(P<0.05)，沉默lncRNA CACF后，与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞的自噬水平降低(图2)。

2、本发明通过RNA pull-down qRT-PCR和双荧光素酶报告实验检测lncRNA CACF与miR-106a的结合，lncRNA CACF Sense可以与miR-106a结合，而lncRNA CACF Antisense不能(图3)，miR-106a与WT-CACF的结合活性显著降低(P<0.05)，其他三组差异不显著(图4)。

3、本发明通过GFP-mRFP-LC3腺病毒标记检测人脐静脉内皮细胞的自噬水平，发现转染miR-106a mimic后，与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞自噬水平显著降低(P<0.01)，后，转染miR-106a inhibitor与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞的自噬水平显著上升(P<0.01)(图5)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明采用细胞生物学的方法第一次证实了长链非编码RNA CACF在人脐静脉内皮细胞中竞争性吸附miR-106a，并通过GFP-mRFP-LC3腺病毒标记检测人脐静脉内皮细胞的自噬水平，证实了lncRNA CACF吸附miR-106a促进人脐静脉内皮细胞自噬进程的应用。

本发明提供了lncRNA CACF作为人脐静脉内皮细胞自噬诱导剂的新用途，以及miR-106a作为人脐静脉内皮细胞自噬抑制剂的新用途，有利于进一步开展人脐静脉内皮细胞自噬相关疾病发生、发展及治疗的研究。

附图说明

图1是qRT-PCR检测lncRNA CACF转染效率的结果图；

图2是GFP-mRFP-LC3标记法检测超表达和干扰lncRNA CACF后调控人脐静脉内皮细胞自噬水平的结果图；

图3是RNA pull-down qRT-PCR结果图；

图4是miR-106a序列与WT-CACF和MUT-CACF序列之间的对比图(其中显示了miR-106a的mimic和NC与WT-CACF和MUT-CACF之间的结合活性)；

图5是GFP-mRFP-LC3标记法检测miR-106a的mimic和inhibitor调控人脐静脉内皮细胞自噬水平的结果图；

图6是lncRNA CACF与miR-106a的序列比对图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

本发明中应用统计学方法，分析各实施例中3次独立实验的结果，分别计算“平均值±标准差”，使用单因素方差分析进行差异显著性分析(图中“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01)。

实施例1：人脐静脉内皮细胞的培养

(1)将从液氮罐中取出的装有人脐静脉内皮细胞(购自ScienCell公司)的冻存管，置于37℃水浴锅中使其迅速融化；

(2)细胞转移至离心管中，室温下1000rpm离心5min，倒掉上清液；

(3)加入预热的PBS清洗，离心后倒掉PBS；

(4)配置ECM完全培养基：93％(w/w)内皮细胞培养基ECM(购自ScienCell公司)+5％(w/w)FBS(胎牛血清)+1％(w/w)内皮细胞生长添加物ECGS(购自ScienCell公司)+1％(w/w)双抗；

(5)加入ECM完全培养基重悬细胞，接种到培养瓶中；置于37℃，5％ CO

所述的双抗为青霉素和链霉素。

实施例2：人脐静脉内皮细胞的接种和转染

(1)人脐静脉内皮细胞的密度达到90％左右时，倒掉培养基，用预热的PBS清洗细胞2次；

(2)加入0.25％胰蛋白酶消化5min，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量ECM完全培养基终止消化；

(3)用枪头将附壁细胞吹下并吹打均匀，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清液；

(4)加入PBS清洗2遍，1000rpm离心5min；

(5)用ECM完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用ECM完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养；

(6)24h左右，观察细胞状态，待细胞汇合度达75～90％左右时准备转染；

(7)转染方法按Invitrogen公司的

(8)转染后的细胞置于37℃，5％CO

(9)转染24～48h后，观察细胞状态，生长良好即可收集细胞。

实施例3：细胞RNA抽提及反转录

人脐静脉内皮细胞(购自ScienCell公司)的RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体操作步骤如下：

(1)人脐静脉内皮细胞培养至合适密度，弃培养基，PBS清洗细胞两次，再按每10cm

(2)冰上静置10min以充分裂解组织/细胞，4℃12000rpm离心5min，弃沉淀吸上清于新1.5mL RNase-free管中；

(3)加入200μL氯仿(每1mL TRIzol)剧烈震荡15～30s，冰上静置15min，4℃12000rpm离心15min；

(4)吸取上层水相置于新1.5mL RNase-free EP管中；

(5)加入0.5mL异丙醇(每1mL TRIzol)，轻轻地上下颠倒混匀后在冰上静置10min，4℃12000rpm离心10min；

(6)弃上清后置于室温，沿管壁加入1mL 75％(v/v)乙醇-DEPC(每1mL TRIzol)以洗涤RNA，4℃、12000rpm离心5min后弃上清；

(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；

(8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。

cDNA第一链的合成参照Thermo公司的SuperScriptTM First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR kit试剂盒进行。

实施例4：构建LncRNA CACF超表达载体

以人脐静脉内皮细胞cDNA为模板，PCR扩增目的片段，经纯化回收、双酶切、连接pcDNA3.1(-)载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自Magen公司)，命名为pcDNA3.1(-)-CACF。

lncRNA CACF核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：

TCACGGAAAGGGGCGGGGCCGCGTGGCAAAGCCGATCTGATGGGTTGGGGTCCGAATCCACTTTCGCTTCTGCCTTTGGAACATGCCCGTGTTTTTGCCCTAGTTTTCCTTTTCCTGAGGGCATTTAGTTTGGGCTCCCGTTAAAATCTGTGCATTTCTTTCGCACACCGCAAGCACGTGAGAGCTGAGAGGTGGGGCTCCGGCCAGAGACCCGGCTGGTCCTACAGGCTGTGCACCTCGGAACCAAGTGATGCTGCCAGGGCGAGTCTGTCCTGAGGCAGTGTCCCCGAGGAGGCTGGATGGGGCAGCTGGACAGCACAGCCCGACCAGCTGGGTGGCCCCCACACCCCTGACCACACTGCTGGCCCTCGGCCTGTGCCTGGAGGTGTGGGCTTGTCTGAGATTCACCGGCCTCACAAGTCTGTCCCTCCGGCATCTCTGCCGTCCCCTCCTGTGTCTTCCAGAGGCTACCAAATAGGAGAAAGTTTGCCGGGGCTTTTGTAGTTTCCAGCCTGGCACCCCAAGGGGTTGTCTCCACGGGGCCCCGGAAGCTCTGTCTCTCGTGGGGTGACGGTCTGAGCCCTGGACCCCTGGCTCATCTTCCTGCCAGCCACGCTGTCTGCGGGTGTAACCATGTGGTCCTCTGCCCTCTCCCTGGGCCCCTGGGTGGGGCCTCGGGGCCGACTGGGCCTCTTGCAGGGCAGGGCACTGGCAGCCTGCAAGGACGCATCTAGGAGCAGGCAGTCCTCCGTGAACCTGCAGCTGCTGGCACCTCTGTCTTGGATGTCCAGCTTCCCGAACTGCGAGGAGTAAGAGCCTGTGTGAGGGCTGGCCACGTGGCGGTCTGTGACAGTGGCTCGAGCTAAGACAGTTGCCCTCAGAGATGGTCAGCCCAGGAAGGCACAGTGTGGCTGTCTGCCCTCTGTTCCTGGCACCTCTTCCCTGGGATTCTCCAGAAACACACCAGGGTCTGCTCCTGAGCCCCCTTTGTTCTGCTGTAGAGGCAGGCCTGGGTGGCCAAGCTGGAGTGGGTCTGTCCTGAGTGTGTCTGTCCCTCCTGGTCAGGCTGGAGTGGGTCTTAGTCACCCTGGCGTTCAGCGCAGTCACTCATCTTGTGAGATGTGACGGCAGGTGCACAAATGGGCAAGCCCTTCTCGGAAACCTGCCCTGCATACCCCCCTTCTGGGGGCTCCCCCAAACCTGGGCATGCTCTCGTGTGATGGCTCCGTTCCAGACCTCTGCGCTGGCCCTGGGCTAGACCTTGTAGCCTCGGACCAGTGTCAGGCTCGGACCCCCAGTCACCATCAGAGTGCCTGGGCAGACATTACCTGAGCGCTCAGCCCGTCCCCCATGCCGGG。

PCR扩增引物如下：

PCR-CACFForward：5′-GGGGTACCCCTCACGGAAAGGGGCGG-3′(SEQ ID NO.2)；

PCR-CACFReverse：5′-GGAATTCGCCCGGCATGGGGGAC-3′(SEQ ID NO.3)。

实施例5：人脐静脉内皮细胞自噬水平检测

本发明使用GFP-mRFP-LC3标记法检测细胞自噬，参照汉恒生物科技有限公司自噬双标腺病毒说明书，具体操作步骤如下：

(1)人脐静脉内皮细胞培养至合适密度，弃培养基，添加1/2新培养基，添加30MOI

(相当于30PFU/细胞)的自噬双标腺病毒进行细胞侵染；

(2)4h后补足培养基，继续培养8h后更换新的完全培养基继续常规培养24h；

(3)使用共聚焦显微镜进行拍照；

(4)手动计数自噬小体数。

实施例6：RNA pull downqRT-PCR实验检测与lncRNA CACF Sense和Antisense结合的miR-106a

(1)探针获取，加T7启动子(斜体部分)序列引物如下：

CACF Sense-F：5′-AAAATAATACGACTCACTATAGGtcacggaaaggggcgg-3′(SEQ IDNO.4)

CACF Sense-R：5′-cccggcatgggggac-3′(SEQ ID NO.5)

CACF Antisense-F：5′-tcacggaaaggggcgg-3′(SEQ ID NO.6)

CACF Antisense-R：5′-AAAATAATACGACTCACTATAGGcaggcccggcatgggggac-3′(SEQIDNO.7)。

(2)以lncRNA CACF全长为模板，PCR扩增，胶回收纯化得到lncRNA CACF Sense和Antisense。

(3)DNA体外转录并标记生物素，将得到的lncRNA CACF Sense和Antisense DNA进行体外转录后，加入1μg Biotin标记的RNA，适量Structure Buffer(10mM Tris pH＝7.0，0.1mM KCl，10mM MgCl

(4)链霉素亲和磁珠与生物素标记的RNA结合，将磁珠与生物素标记并变性的RNA混合，4℃过夜，3000rpm离心1min，去上清。

(5)磁珠复合物与RNA结合，往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液(约含蛋白1mg)，裂解液中加入适量Rnase抑制剂，室温放置1h，低速离心，上清回收(作为系统的阴性对照)，使用Wash BufferII冲洗3次，每次1mL，进行RNA纯化获得与lncRNA CACF Sense和Antisense结合的RNA。

(6)按照广州锐博生物公司miDETECT A TrackTM miRNA qPCR Primer进行RNA反转录和qRT-PCR。

实施例7：荧光素酶报告实验检测CACF与miR-106a的结合活性

按照PromeGa的

(1)5×PLB室温解冻后，使用ddH2O按1:4的比例将其稀释成1×PLB；

(2)移液枪吸出培养基。沿孔壁慢慢地加入200uL PBS，轻轻晃动培养板，吸除PBS，此PBS清洗步骤重复两遍，全程注意动作轻柔，防止将细胞吸走；

(3)每孔加入100uL 1×PLB；摇床上孵育10min，使细胞充分裂解；

(4)将裂解的细胞取75uL转移到96孔酶标板中，每孔加入75uL LARⅡ溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测Firefly luciferase荧光强度；

(5)再加入75uLStop&Glo溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测Ranilla luciferase荧光强度；

(6)Firefly luciferase与Ranilla luciferase的比值即为萤火虫荧光素酶相对活性。(每个组3个重复)。

结果分析

1、合成lncRNA CACF超表达载体(pcDNA3.1(+)-lncRNA CACF)和lncRNA功能抑制的沉默试剂(lncRNA CACF Silencer)，检测转染效率。与阴性对照组(Silencer NC组)相比，转染lncRNA CACF Silencer的人脐静脉内皮细胞(Silencer组)中的CACF表达量显著下调；与阴性对照组(pcDNA3.1(+)组)相比，转染pcDNA3.1(+)-lncRNA CACF的人脐静脉内皮细胞中的CACF表达量显著上调，结果如图1所示。上述lncRNA CACF Silencer由广州市锐博生物科技有限公司合成；对照组NC来自广州市锐博生物科技有限公司。

lncRNA CACF Silencer：

5′-CGAAUCCACUUUCGCUUCUGAGAUUCACCGGCCUCACACUACCAAAUAGGAG AAAGUAAUCUGUGCAUUUCUUUCGCGUCUGAGAUUCACCGGCCUCCCUGGGCAGAC AUUACCUGATT-3′(SEQ ID NO.8)。

2、将lncRNA CACF超表达载体(pcDNA3.1(+)-lncRNA CACF)和lncRNA功能抑制的沉默试剂(lncRNA CACF Silencer)，转染至人脐静脉内皮细胞内，24h后明通过GFP-mRFP-LC3腺病毒标记法检测人脐静脉内皮细胞的自噬水平。结果显示，超表达lncRNA CACF后，与对照组(pcDNA3.1)相比，人脐静脉内皮细胞的自噬水平显著上升(P<0.05)，，沉默lncRNACACF后，与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞的自噬水平降低(图2)。

3、合成lncRNA CACF Sense和Antisense探针，通过RNA pull down实验分别拉取lncRNA CACF Sense和Antisense探针结合的RNA，使用qRT-PCR检测拉取的RNA中miR-106a的表达，结果显示，lncRNA CACF Sense拉取的RNA中有miR-106a表达，lncRNA CACFAntisense拉取的RNA中没有miR-106a表达(图3)。

4、比对lncRNA CACF与miRbase数据库中成熟miRNAs的序列，筛选出与lncRNACACF存在序列匹配的miR-106a(Gene ID:723829)，将CACF野生型和与miR-106a匹配序列位点突变序列连接到真核表达载体pmirGLO中，通过双荧光素酶活性检测，发现野生型CACF(WT-CACF)上游报告基因受到miR-106a调控，而突变型CACF(MUT-CACF)不受miR-106a调控(图4)。

5、合成hsa-miR-106a模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)检测转染效率。与阴性对照组(inhibitor NC组)相比，转染miR-106a inhibitor的人脐静脉内皮细胞(inhibitor组)中的miR-106a表达量显著下调；于阴性对照组(mimics NC组)相比，转染miR-106amimics的人脐静脉内皮细胞(mimics组)中的miR-106a表达量显著上调，结果如图1所示。上述miRNA产品由广州市锐博生物科技有限公司合成。

hsa-miR-106a mimic：5′-AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3′(SEQ ID NO.9)

hsa-miR-106a inhibitor：5′-UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGA-3′(SEQ ID NO.10)。

6、将hsa-miR-106a模拟物(miR-106a)和抑制剂(inhibitor)转染至人脐静脉内皮细胞内，24h后明通过GFP-mRFP-LC3腺病毒标记法检测人脐静脉内皮细胞的自噬水平，结果显示，转染miR-106a mimic后，与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞自噬水平显著降低(P<0.01)，转染miR-106a inhibitor与对照组(NC)相比，人脐静脉内皮细胞的自噬水平显著上升(P<0.01)(图5)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。