一种基于外泌体微小RNA的神经系统疾病诊断方法

摘要

本发明公开了一种基于外泌体微小RNA的神经系统疾病诊断方法，属于疾病诊断技术领域，本方案通过对患者的血浆内的外泌体miRNA进行提取后分成均等份在第一培养液和若干个培养液培养，利用甲基绿－吡罗红染色原理对培养液内的外泌体miRNA进行标记，根据其若干个培养液内的颜色变化范围建立堆叠图模型与第一培养液内的比对模型进行比较，利用恶性细胞外泌体miRNA可以通过调控免疫细胞，抑制其正常功能，促进恶性细胞侵袭和进展，从而使得若干个培养液内恶性细胞外泌体miRNA快速地进行繁殖，通过与初始外泌体miRNA范围进行比较，从而判断患者血浆内是否存在大量恶性细胞，最终通过实时荧光RTFQ‑PCR法对miRNA中miR‑125b进行检测，通过这一标准判断该患者是否患有阿尔茨海默病。

说明书

技术领域

本发明涉及疾病诊断技术领域，更具体地说，涉及一种基于外泌体微小RNA的神经系统疾病诊断方法。

背景技术

外泌体是一种由细胞分泌的、大小30～150nm膜状囊泡，由多泡体与细胞膜融合后释放，外泌体通常表现出杯状或碟状的形态，其外膜与细胞膜相似，含磷脂双分子层，其内含有蛋白质、脂类、mRNA等生物活性物质，并且还带有许多非编码RNA，包括miRNA、长链非编码RNA和环状RNA，外泌体广泛存在于体液和各种细胞中，随着体循环流动，发挥直接或者间接作用，根据细胞的来源，不同的外泌体具有不同的功能，如诱导细胞增殖、免疫抑制、促进细胞分泌和介导细胞间的信号传递等。

在人口老龄化时代的到来，老年群体数量越来越多，对于老年群体更容易患上一些病症，例如阿尔茨海默病，对老年群体进行诊断方式的实施上因老年人的身体素质较差，导致存在着一定的局限性，从而在检测过程中容易延长其诊断的时间，从而延缓了对病情治疗的宝贵时间，导致加剧了病情的蔓延。

因此，针对上述问题提出一种基于外泌体微小RNA的神经系统疾病诊断方法。

发明内容

1.要解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于外泌体微小RNA的神经系统疾病诊断方法，可以实现根据其若干个培养液内的颜色变化范围建立堆叠图模型与第一培养液内的比对模型进行比较，通过与初始外泌体miRNA范围进行比较，从而判断患者血浆内是否存在大量恶性细胞，最终通过实时荧光RTFQ-PCR法对miRNA中miR-125b进行检测，通过这一标准判断该患者是否患有阿尔茨海默病。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种基于外泌体微小RNA的神经系统疾病诊断方法，包括以下步骤：

S1：利用超速离心法提取患者的血浆内的外泌体miRNA，分成均等份并放在比对培养液和若干个对照培养液内同时进行培养；

S2：对第一培养液中的外泌体miRNA进行颜色标记；并对其外显的区域建立比对模型；

S3：在培养一定时间段后依次对若干个对照培养液进行颜色标记，并依次记录其标记时间；

S4：针对若干个对照培养液内的颜色区域建立对照模型，并与依据第一培养液建立的比对模型进行比较；

S5：通过实时荧光RTFQ-PCR法检测第一培养液外泌体miRNA。

进一步的，所述S1培养液的温度设定在4℃，且培养的时间控制在48h内。

进一步的，所述S1中超速离心法利用对外泌体不同的特征进行分离，通过与其他过滤步骤组合或使用蔗糖密度梯度进一步去除其他杂质。

进一步的，所述S1和S3中多个对照培养液在进行培养时需依次对其培养皿进行标号，在记录若干个对照培养液颜色标记时按照标号从小到大的顺序依次记录。

进一步的，所述S2和S3中对外泌体miRNA进行颜色标记时可采用甲基绿－吡罗红染色原理。

进一步的，所述S4中对若干个对照培养液建立对照模型时，可采用堆叠图方法进行建立。

进一步的，所述S4中通过比对模型与对照模型进行比对时，通过比较对照模型不断变化的标记区域一直处于增大且全部大于比对标记区域，则判定患者大概率存在患病的可能。

进一步的，所述S5中通过实时荧光RTFQ-PCR法检测第一培养液中miR-125b。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的优点在于：

(1)本方案通过若干个培养液内的颜色变化范围建立堆叠图模型与第一培养液内的比对模型进行比较，通过与初始外泌体miRNA范围进行比较，从而判断患者血浆内是否存在大量恶性细胞，最终通过实时荧光RTFQ-PCR法对miRNA中miR-125b进行检测，通过这一标准判断该患者是否患有阿尔茨海默病。

附图说明

图1为本发明的外泌体微小RNA的神经系统疾病诊断方法示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体的连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例1：

请参阅图1，一种基于外泌体微小RNA的神经系统疾病诊断方法，包括以下步骤：

S1：利用超速离心法提取患者的血浆内的外泌体miRNA，分成均等份并放在比对培养液和若干个对照培养液内同时进行培养；

S2：对第一培养液中的外泌体miRNA进行颜色标记；并对其外显的区域建立比对模型；

S3：在培养一定时间段后依次对若干个对照培养液进行颜色标记，并依次记录其标记时间；

S4：针对若干个对照培养液内的颜色区域建立对照模型，并与依据第一培养液建立的比对模型进行比较；

S5：通过实时荧光RTFQ-PCR法检测第一培养液外泌体miRNA。

本方案通过对患者的血浆内的外泌体miRNA进行提取后分成均等份在第一培养液和若干个培养液进行培养，通过利用甲基绿－吡罗红染色原理对培养液内的外泌体miRNA进行标记，并且在对若干个培养液进行标记时按照其若干个培养皿中的标号依次进行标记，并相邻若干个培养液标记间隔的时间相同，并根据其若干个培养液内的颜色变化范围建立堆叠图模型与第一培养液内的比对模型进行比较，通过利用恶性细胞外泌体miRNA可以通过调控免疫细胞，抑制其正常功能，促进恶性细胞侵袭和进展，从而使得若干个培养液内恶性细胞外泌体miRNA快速地进行繁殖，且繁殖的速度远远大于正常细胞的繁殖速度，通过与初始外泌体miRNA范围进行比较，从而判断患者血浆内是否存在恶性细胞，最终通过实时荧光RTFQ-PCR法对miRNA中miR-125b进行检测，因患者体内存在的miR-125b的表达远多于正常人体水平，通过这一标准判断该患者是否患有阿尔茨海默病。

S1培养液的温度设定在4℃，且培养的时间控制在48h内。

本方案通过设定S1中的培养液的温度设定为4℃，使得提取在培养液的外泌体miRNA能够正常稳定保存48h，从而需要将检测对比的时间控制在48h内，预防在进行对照试验时外泌体miRNA受其他因素影响造成对照试验的偶然性，从而导致诊断的结果出现偏差。

S1中超速离心法利用对外泌体不同的特征进行分离，通过与其他过滤步骤组合或使用蔗糖密度梯度进一步去除其他杂质。

本方案通过在提取外泌体miRNA采用超速离心法，通过外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，将细胞、细胞碎片以及其他细胞器等分离出去，从而得到纯净的外泌体，由于外泌体的密度范围是1.13g/ml-1.21g/ml，可以使用梯度介质去除非襄泡颗粒，相比于普通的超速离心法，它可以通过使用蔗糖等介质更好地去除样品中大的蛋白质集体等杂质，从而得到更加纯净的外泌体。

S1和S3中多个对照培养液在进行培养时需依次对其培养皿进行标号，在记录若干个对照培养液颜色标记时按照标号从小到大的顺序依次记录。

本方案通过在对若干个对照培养液进行培养标记时，通过依次对若干个培养皿进行标号后，在对若干个培养皿内的培养液进行记录时可以依据标记号从小到大的顺序进行记录，并且相邻两个之间记录的时间保持一致，从而使得在记录建立模型时更加的便捷的同时，也控制其唯一的变量，也就是间隔的时间处于一个定值，从而最大程度上消除其他因素对检测比对的影响。

S2和S3中对外泌体miRNA进行颜色标记时可采用甲基绿－吡罗红染色原理。

本方案通过利用甲基绿－吡罗红染色原理对外泌体miRNA进行颜色标记，通过甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色，而吡罗红则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，即RNA对吡罗红亲和力大被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大被染成绿色，从而通过观测绿色区域的范围大小即可记录外泌体miRNA的繁殖情况。

S4中对若干个对照培养液建立对照模型时，可采用堆叠图方法进行建立。

本方案通过采用堆叠图方法对模型进行建立，从而可以通过图形的变化区域以及记录的时间清楚地看到对照模型所呈现的变化范围，从而方便更好地进行比对，同时也能够很清晰地将变化范围的大小反映出。

S4中通过比对模型与对照模型进行比对时，通过比较对照模型不断变化的标记区域一直处于增大且全部大于比对标记区域，则判定患者大概率存在患病的可能。

本方案通过利用恶性细胞外泌体miRNA可以通过调控免疫细胞，抑制其正常功能，促进恶性细胞侵袭和进展，从而使得若干个培养液内恶性细胞外泌体miRNA快速地进行繁殖，且繁殖的速度远远大于正常细胞的繁殖速度，通过与初始外泌体miRNA范围进行比较，从而判断患者血浆内是能够存在恶性细胞，

S5中通过实时荧光RTFQ-PCR法检测第一培养液中miR-125b。

本方案通过实时荧光RTFQ-PCR法对miR-125b进行检测，通过探针5’端标记有报告基团R可发出荧光信号，3’端标记有荧光淬灭基团Q可吸收荧光信号，实际上探针的本质就是一寡核苷酸链，在PCR的反应过程中加入一寡核苷酸链(DNA/RNA)，当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，从而不被检测出来，当PCR扩增至探针所在位置时，TaqDNA聚合酶具有的核酸外切酶活性会将探针5’端的报告基团切断，使其远离探针本身，这时产生的荧光信号就不能被淬灭基团吸收，而被仪器检测出来。每扩增一条DNA链就会有一个荧光分子产生，通过荧光信号的积累量实时监测整个PCR反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光阈值的默认设置值是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，从而完成对miR-125b的监测，有益于帮助我们判断患者是否患上阿尔茨海默病。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。