长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1在肽聚糖识别和细菌结合方面的应用

摘要

本发明提供长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1在肽聚糖识别和细菌结合方面的应用。本发明研究显示长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1属于肽聚糖识别蛋白，通过特异性识别肽聚糖，与肽聚糖结合后，抑制肽聚糖生物合成，从而能抑制细菌生长；本发明提供的肽聚糖识别蛋白的重组蛋白能特异结合Lys型肽聚糖，具有显著的结合活性，能用于区分DAP型肽聚糖；能广谱地结合、凝集细菌与真菌，并用于细菌的清除；本发明为区分DAP型和Lys型肽聚糖、检测Lys型肽聚糖的特异性、结合并清除细菌以及用于细菌感染性疾病治疗药物的研发提供了新的选择。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域。更具体地，涉及长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1在肽聚糖识别和细菌结合方面的应用。

背景技术

长牡蛎(Crassostrea gigas)是我国沿海地区的重要经济品种，同时在固碳削减、防止海水富营养化等方面也发挥着巨大的生态价值。然而，病害的爆发经常导致牡蛎的大规模死亡，给贝类产业带来较大的经济损失，因此深入了解牡蛎的免疫防御机制有利于制定新的抗病策略。

肽聚糖(Peptidoglycan，PGN)是几乎所有细菌的细胞壁的主要成分之一，包括L-赖氨酸(Lys型)和二氨基庚二酸(Dap型)两种类型，Lys型PGN主要存在于革兰氏阳性菌中，而Dap型PGN是革兰氏阴性菌的主要组成成分。肽聚糖也是宿主感知病原菌入侵、激活免疫反应的一种重要的病源相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。而肽聚糖识别蛋白是一类能特异性识别肽聚糖及含肽聚糖的细菌，在固有免疫应答中发挥重要作用的模式识别受体蛋白。它们通过结合不同的病原相关分子模式完成对各种病原微生物的识别，在免疫应答中发挥重要作用，通过特异性识别肽聚糖，与肽聚糖结合后，抑制肽聚糖生物合成，从而抑制细菌生长。

ApeC结构域蛋白是Haag等运用差显技术将胚胎发育模式不同的海胆进行对比，发现Apextrin在直接发育模式的红海胆(Heliocidaris erythrogramma)的胚胎中表达丰度明显高于间接发育的结节海胆，胚胎原位杂交显示Apextrin特异表达于紫海胆胚胎的外胚层。免疫组化实验证明Apextrin蛋白以分泌泡的形式储存在卵里面，在卵完成受精以后逐渐开始分泌，当胚胎在囊胚期极化之后Apextrin蛋白就定位于胚胎顶端胞外基质，故称其为顶端胞外基质蛋白(Apical extracellular matrix protein，Apextrin)，其C端的保守结构域定名为ApeC(Apextrin C-terminal)。具有ApeC的蛋白定名为ACP(ApeC-containingprotein)。

目前，现有技术仅研究了在实验条件下缺氧和重点分析特定基因的差异表达模式与缺氧反应相关的基因，其中表明ACP分子类在缺氧条件下表达上调，表明它可能参与抗应激反应(David E,Tanguy A ,Pichavant K,et al.Response of the Pacific oysterCrassostrea gigas to hypoxia exposure under experimental conditions[J].FEBSJournal,2005.)，但并未具体研究与ACP分子相关的基因，也并未研究ACP分子是否与肽聚糖的识别相关。而其他研究仅报道了软体动物中的一些ACP分子，但都仅基于表达模式进行了探索，并未具体分析其功能作用。目前还未有与长牡蛎的ApeC结构域蛋白和基因相关的研究和报道，也鲜有ApeC结构域蛋白与肽聚糖相关的研究。因此，研究和开发出更多的与肽聚糖识别相关的蛋白及基因，对于病原菌入侵、机体的免疫应答提供更多的产品，用于判断阳性细菌感染、细菌清除、细菌感染性疾病、细菌凝集等，具有重大的理论和应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1在肽聚糖识别和细菌结合方面的应用。

本发明的目的是提供长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1的应用。

本发明另一目的是提供一种结合和凝集细菌的方法。

本发明再一目的是提供一种区分DAP型和Lys型肽聚糖的试剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过cDNA文库的构建和克隆从长牡蛎总RNA中分离鉴定得到长牡蛎肽聚糖识别蛋白CgACP1，经测序分析得知长牡蛎CgACP1基因全长660bp，编码219个氨基酸，其基因DNA序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CgACP1蛋白是由N端信号肽和C端ApeC结构域组成的，是一个目前已知最短形式的含有ApeC结构域的蛋白；该蛋白等电点为5.91，分子量为24.386道尔顿。

本发明通过将CgACP1克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)，构建表达质粒pET32a(+)-CgACP1，以硫氧还蛋白为融合表达伴体，该系统使表达的CgACP1包涵体在硫氧还蛋白的帮助下通过变复性正确折叠成为可溶的蛋白。该重组蛋白编码219个氨基酸，等电点为5.65，分子量为41，900道尔顿。CgACP1蛋白可以通过表达载体pET32a(+)-CgACP1在大肠杆菌中表达。

本发明研究显示，CgACP1重组蛋白能很好地结合细菌和真菌，具有广谱的结合能力；可以通过对细菌的结合和凝集能力，用于结合和去除细菌。同时，CgACP1重组蛋白能特异性识别肽聚糖，特别是能识别Lys型肽聚糖，对结合能力有显著差异的Lys型肽聚糖与DAP型肽聚糖能很好地进行区分，对金黄色葡萄球菌来源的Lys型PGN有显著的结合活性，不结合DAP型肽聚糖、脂多糖、磷壁酸、酵母聚糖、几丁质、壳聚糖和纤维素其他细胞壁组分；因此，CgACP1重组蛋白能用于区分结合能力差异的DAP型和Lys型肽聚糖。

本发明提供长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1或其重组蛋白在特异性识别肽聚糖和/或在制备特异性识别肽聚糖试剂、在制备区分DAP型和Lys型肽聚糖试剂中、在制备促进细菌结合和/或清除制剂、在制备细菌感染性疾病治疗药物中的应用。

优选地，为特异性识别Lys型肽聚糖。

进一步地，所述细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪场球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鳗弧菌(Vibro anguillarum)、副溶血弧菌(Vibro paraheamolyticus)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter caloacetius)。

本发明提供一种结合和凝集细菌的方法，采用含长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1或其重组蛋白的试剂对细菌进行处理。

本发明提供一种结合和凝集酵母真菌的方法，采用含长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1或其重组蛋白的试剂对酵母真菌进行处理。

本发明还提供一种区分DAP型和Lys型肽聚糖的试剂，含有长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1或其重组蛋白。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1在肽聚糖识别和细菌结合方面的应用。本发明研究显示长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1属于肽聚糖识别蛋白，通过特异性识别肽聚糖的蛋白，与肽聚糖结合后，抑制肽聚糖生物合成，从而能抑制细菌生长；CgACP1重组蛋白能很好地结合多种细菌和真菌，具有广谱的结合活性能力，可以通过对细菌的结合和凝集能力，用于凝集和去除细菌。CgACP1重组蛋白能特异性识别Lys型肽聚糖，对金黄色葡萄球菌来源的Lys型PGN有显著的结合活性，能区分DAP型肽聚糖、脂多糖、磷壁酸、酵母聚糖、几丁质、壳聚糖和纤维素其他细胞壁组分；因此，长牡蛎短型ApeC结构域蛋白CgACP1能用于区分DAP型和Lys型肽聚糖、检测Lys型肽聚糖的特异性、结合并清除细菌以及用于细菌感染性疾病治疗药物的制备均具有巨大的实用性，为其产品和药剂开发提供了新的选择。

附图说明

图1为克隆得到的CgACP1基因全长片段电泳结果图；

图2为长牡蛎CgACP1蛋白结构预测分析结果图；

图3为本发明长牡蛎蛋白和其它无脊椎物种ACP蛋白的比较结果图；

图4为CgACP1的重组表达质粒pET32a(+)-CgACP1构建图；

图5为重组CgACP1蛋白诱导表达、纯化电泳图(第1泳道：蛋白质Marker；第2泳道：未诱导的TRX-CgACP1超声沉淀；第3泳道：诱导的TRX-CgACP1超声沉淀；第4泳道：纯化后的TRX-CgACP1)；

图6为重组蛋白CgACP1的细菌结合试验结果图；

图7为重组蛋白CgACP1的细菌凝集实验结果图；

图8为重组蛋白CgACP1与微生物细胞壁组分的ELISA实验结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明的表达质粒复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecularcloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl

实施例1长牡蛎CgACP1蛋白结构分析和基因序列的测定

本发明采用的长牡蛎采自中国山东青岛，收集长牡蛎组织，采用Trizol试剂法提取总RNA。取1μg提取的总RNA，按照Takara公司的cDNA一链合成试剂盒(PrimcriptTM II1st Strand cDNA Sythesis Kit)将mRNA反转录为cDNA一链。然后利用。

然后，根据CgACP1基因全长序列设计PCR引物5’-TTTAACGGTCTAAAG GTCCTG-3’和5’-AAGAGATTACACATTTGCCT-3’，采用Takara的LA Taq聚合酶从cDNA一链中扩增CgACP1的全基因，结果如图1所示，扩增得到的709bp片段的电泳图谱。

对扩增产物进行测序分析得到长牡蛎CgACP1的全基因显示，编码序列全长660bp，其编码核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码219个氨基酸。SMART预测结果如图2显示，这个基因编码的蛋白质是由N端信号肽和C端ApeC结构域组成的，是一个目前已知最短形式的含有ApeC结构域的蛋白。

将扩增得到的目的片段连接到pClone007 Simple Vector后转化大肠杆菌DH5α，挑选重组克隆测序。进行测序分析后，获得了CgACP1基因全长序列。用MEGA分析软件，对已知的不同无脊椎物种的ACP蛋白同源序列进行比较，结果如图3所示。ACP蛋白C端的200氨基酸在不同的物种中是较为保守的，其中的八个半胱氨酸非常保守。

实施例2重组pET32a-CgACP1表达质粒的构建

根据实施例1中分析的CgACP1基因的两端序列合成一对引物，上游及下游引物含BamHI切割位点，引物具体序列如下所示：

上游引物(P1)：5’-GCTGATATC

下游引物(P2)：5’-CGAATTC

以含有CgACP1基因的pClone007 Simple质粒为模板(由实施例1构建的得到)，采用P1、P2为引物以退火温度60℃进行标准三步法PCR扩增，PCR扩增后得到特异扩增的单一条带，产物大小在780bp左右。

将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pET32a(+)(Novagen公司)上，此表达载体pET32a(+)-CgACP1以硫氧还蛋白为融合表达伴体，该系统使表达的CgACP1包涵体在硫氧还蛋白的帮助下通过变复性正确折叠成为可溶的蛋白。得到重组表达载体pET32a(+)-CgACP1，其构建过程如图4所示。构建得到的表达载体pET32a(+)-CgACP1中的外源基因序列经测序鉴定正确。

实施例3长牡蛎CgACP1融合蛋白的表达和纯化

将实施例2构建的pET32a(+)-CgACP1质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经过基因工程菌超声裂解沉淀经SDS-PAGE电泳分析，结果如图5如所示，表明菌株经诱导后在超声裂解沉淀中有明显的特异表达产物带，分子量与预测的理论值42kD相符。

经过对培养时间、诱导浓度、温度等条件的优化，得到基因工程菌的最佳培养条件为：接单菌落于50mL氨苄抗性2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物5mL接种于500mL的氨苄抗性2×YT培养基中，37℃，250rpm培养至OD

超声前使用液氮反复冻融样品2次，然后用超声破碎仪以200W的功率，超声2s，停4s，冰浴超声30min破碎细菌，每10mL超声30min；4℃，12000rpm，离心30min，收集沉淀；用包涵体洗涤液清洗沉淀：按照1g菌：5mL洗涤液的比例，加入包涵体洗涤液配方。移液枪吹打重悬，12000rpm，离心5min，收集沉淀；按照1g沉淀：10mL的比例加入包涵体组氨酸标签蛋白纯化的Binding Buffer，使用移液枪重悬吹散沉淀。

冰浴超声10min(功率200W，超声2s，停4s)，再置于摇床冰上孵育20min；4℃，12000rpm，离心30min，收集上清用于后续蛋白纯化。组氨酸标签蛋白纯化使用PuriMag Si-NTA-Ni磁珠。充分混匀磁珠，取4mL的磁珠悬浮液，(磁珠沉降体积1mL)置于分离器上磁分离，待溶液澄清，吸弃清液，加入ddH

按照磁珠体积/Wash Buffer体积比1/5的比例加入Wash Buffer，反复吹打10次，磁分离，待溶液澄清，吸取上清液，保留以备检测，重复3次；按照磁珠体积/Elution Buffer体积比1/2.5的比例，将Elution Buffer加入到离心管中，重悬磁珠混匀10次，磁分离，待溶液澄清，吸取上清液，即为目的蛋白组分。重复3次，分别收集洗脱组分以备检测。

按照说明处理透析袋(Thermo SnakeskinTM)，使用前用ddH

最后得到纯化后的长牡蛎CgACP1重组蛋白，该蛋白的表达量较高，绝大部分以不可溶包涵体形式存在。

实施例4长牡蛎CgACP1重组蛋白的细菌结合活性分析

本实施例使用的细菌包括：革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪场球菌(Enterococcus faecium)；革兰氏阴性细菌大肠杆菌(Escherichiacoli)、鳗弧菌(Vibro anguillarum)、副溶血弧菌(Vibro paraheamolyticus)和醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter caloacetius)；真菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

分别取上述约2×10

结果如图6所示，显示CgACP1重组蛋白可以与不同的细菌进行结合，表明CgACP1重组蛋白与微生物的结合具有广谱性。

实施例5长牡蛎CgACP1重组蛋白的细菌凝集活性分析

取实施例4中的金黄色葡萄球菌菌(S.aureus)、粪场球菌(E.faecium)、大肠杆菌(E.coli)、鳗弧菌(V.anguillarum)、真菌酿酒酵母(S.cerevisiae)的保种菌2μL接种到5mL液体培养基培养过夜；次日收集1.5mL菌体(OD

结果如图7所示，CgACP1重组蛋白可以有效凝集多种细菌，具有广谱细菌凝集活性。

实施例6长牡蛎CgACP1重组蛋白的细菌细胞壁纯组分结合活性分析

本实施例通过ELISA试验来检测重组蛋白对不同细菌细胞壁纯组分的结合活性。分别选用Lys型PGN和Dap型PGN，其主要组成成分使用的六种细菌细胞壁纯组分分别为：来源于金黄色葡萄球菌的肽聚糖(PGN(S.a)，Lys型肽聚糖)、来源于枯草芽胞杆菌的肽聚糖(PGN(B.s)，DAP型肽聚糖)、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)、磷壁酸(Lipoteichoicacid，LTA)、酵母聚糖(Zymosan A)、几丁质(Chitin)、壳聚糖(Chitosan)和纤维素(Cellulose)。由于PGN、Mannan和Zymosan均为为不溶物，实验前将这3种组分重悬在碳酸缓冲液中后用超声波助溶，离心取上清后再进行下面的实验。

(1)调整不同的组分终浓度为1mg/mL，在聚苯乙烯微量滴定板(

(2)洗涤：弃去孔内溶液，用200μL PBST(0.1％Tween-20，v/v)洗3次，每次3min；

(3)封闭：每孔加入200μL 5％脱脂奶粉-PBST封闭液4℃封闭过夜，次日洗涤，第一次用250μL洗涤液，随后用200μL洗涤液清洗两次；

(4)加样：每孔中加入不同浓度的纯化的TRX融合蛋白100μL(同时做空白孔和阴性对照TRX蛋白)，37℃于湿盒中孵育2h，洗涤同(2)；

(5)加一抗：每孔加入100μL新鲜的用1％的脱脂奶粉稀释的小鼠His单克隆抗体(1:10000)，置于湿盒中于37℃下孵育1h，洗涤同(2)；

(6)加酶标二抗：每孔加入100μL新鲜的用1％的脱脂奶粉稀释的羊抗小鼠HRP标记的IgG二抗(1:5000)，置于湿盒中于37℃孵育1h，洗涤同(2)；

(7)加底物显色：每孔加入100μL TMB Substrate Solution(Thermo)在室温下避光孵育15min；

(8)终止反应：从加入第一孔开始计时，按照加入显影底物的顺序每孔加入50μL2M硫酸终止反应；

(9)读取数据：立即在酶标仪450nm处以空白对照孔调零后读取OD值。

结果如图8所示，显示重组蛋白CgACP1对金黄色葡萄球菌来源的Lys型肽聚糖(PGN)有显著的浓度依赖的结合活性，具有很高的结合活性，能显著区分结合能力差异的不同细胞壁组分：DAP型肽聚糖、脂多糖(LPS)、磷壁酸(LTA)、酵母聚糖(Zymosan A)、几丁质(Chitin)、壳聚糖(Chitosan)和纤维素(Cellulose)在内的其它细胞壁组分。这说明CgACP1重组蛋白能够特异性结合肽聚糖，而且只能够特性地结合Lys型肽聚糖，能显著区分DAP型肽聚糖与其他细胞壁组分。因此，在实际应用中，CgACP不但用于可以高效结合或者识别样品中的Lys型肽聚糖，还能够用于高效区分样品中Lys型和DAP两种肽聚糖。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。