一种蛋白质多肽在抑制恶性腹水和恶性胸水中的应用

摘要

本发明公开了一种蛋白质多肽在抑制恶性腹水和恶性胸水中的应用，涉及恶性腹水和恶性胸水治疗领域。本发明通过将SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02所示的蛋白质多肽注射到腹水模型中，发现能够达到抑制恶性胸水和恶性腹水的产生，减少恶性胸水和恶性腹水量，延长生存时间的作用。这种蛋白质多肽的应用方法在行业内尚属首次发现，为临床治疗恶性胸水和恶性腹水的药物开发提供理论及实践基础。

说明书

技术领域

本发明涉及恶性腹水和恶性胸水治疗领域，特别涉及抑制恶性腹水和恶性胸水的蛋白质多肽。

背景技术

恶性腹水是多种恶性肿瘤晚期的临床表现，通常情况下，这种情况发生在疾病的晚期，恶性腹水的出现常常伴随着恶性肿瘤的远处转移，此时药物治疗已经变得困难。因此，腹水的形成表明临床上通常缺乏有效的治疗方法。腹水形成在晚期卵巢、胰腺和胃肠道恶性肿瘤患者中尤为突出。现阶段临床治疗主要包括：单纯性腹水抽取、腹腔注射化疗药物和腹腔热灌注疗法等，然而上述手段常常伴随着较大的毒素作用。因此开发出效果疗效显著，副作用较低的药物展现出较为广泛的市场需求和应用前进。

恶性胸腔积液(MPE)是转移性癌症晚期最常见的并发症之一，由胸膜转移引起，特征是存在恶性细胞。肿瘤细胞通过直接浸润，血行转移或淋巴扩散浸润胸膜腔，胸膜腔内积液可能是肿瘤生长阻塞淋巴引流的结果。

MPE可发生于15％的癌症患者，其中最常见于肺癌(LC)，发病率可达60％，其次是乳腺癌(BC)、淋巴瘤、妇科肿瘤和恶性间皮瘤。患者在初始诊断为MPE后的平均生存期(OS)为3-12个月。大多数MPE患者的常见症状包括呼吸困难、咳嗽和胸痛。伴随症状的严重程度取决于积液的量或者体积，以及患者的心肺状态。近年来，随着对MPE发病机制的深入研究，临床治疗手段得到了完善。目前，MPE的临床治疗方法较多，但整体治疗效率较低。其中，胸腔输注化疗药物治疗MPE是应用最广泛的方法，但其疗效不尽如人意，长期毒副作用(例如，骨髓抑制、胃肠道反应、发热、胸痛和胸膜纤维化等)大。

本发明的申请人在先申请且尚未公开的中国发明专利2021111220700提供了一种抑制肿瘤侵袭转移的多肽组合及其应用，其作用原理是通过抑制TGF-β/SMADs信号通路，为临床治疗肿瘤转移性病人提供新的治疗药物。申请人还发表的外文论文《EZH2-triggeredmethylation of SMAD3 promotes its activation and tumor metastasis》(ChangshengHuang,The Journal of Clinical Investigation，doi:10.1172/JCI152394)公开了SMAD3的第53位及第333位赖氨酸的甲基化可以影响其磷酸化激活并且可以影响其肿瘤细胞中上皮简质转化的标志性蛋白表达。然而对于如何抑制恶性腹水和恶性胸水，相关文献报道较少。现有技术中，对于恶性腹水的治疗一般使用中药组合物缓解，例如中国专利申请CN113288999A提供的治疗乙肝、肝硬化及腹水、肿瘤的中药方剂；也有少量使用多肽药物，例如中国专利申请CN106999539A施用作为连续输注的多肽类药物(特利加压素或其盐)，作为腹水患者的治疗方法。文献《肝水解肽治疗肝硬化腹水的疗效观察》(李慧梅，吉林大学硕士学位论文，2007年)公开了使用肝水解肽(PHGF)(乳猪新鲜肝细胞中提取的低分子量多肽类物质)，能够使肝硬化患者的腹水消退率显著升高。文献《肝水解肽治疗乙型肝炎肝硬化腹水的疗效观察》(次仁，《高原医学》，2017年7期)同样公开了使用湖南五洲通药业有限责任公司的肝水解肽注射液，相比于注射还原型谷胱甘肽，血清白蛋白的提高更明显，腹腔积液消退天数均小于对照组。可见，使用蛋白质多肽治疗腹水，在行业内的应用还相对较少。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种蛋白质多肽在抑制恶性腹水和恶性胸水中的应用，将在先专利申请(申请号2021111220700)中提供的蛋白质多肽，应用于恶性胸水和恶性腹水的抑制治疗中，具有制作原料简单易得，药物效率高，副作用低，不容易累计中毒，作用靶点较为特异等优点，应用前景非常高。具体通过以下技术实现。

一种蛋白质多肽在制备抑制恶性腹水和恶性胸水的药物中的应用，所述蛋白质多肽包括两条多肽，第一条多肽包含穿膜肽Ⅰ、靶向肽P1，第二条多肽包含穿膜肽Ⅱ、靶向肽P2；所述靶向肽P1的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，所述靶向肽P2的氨基酸序列如SEQID NO.02所示。

本发明所涉及到的治疗性多肽通过局部用药，可以在局部产生轻微的炎症反应，达到胸腹膜粘连闭合，激活机体局部的免疫能力，进而达到抑制恶性胸水和恶性腹水的发展。需要说明的是，穿膜肽Ⅰ和穿膜肽Ⅱ可以采用现有技术中存在任意一种氨基酸序列，只要都能够实现穿膜肽固有的功能，就能应用在本发明中。本发明中的穿膜肽Ⅰ和穿膜肽Ⅱ的氨基酸序列，可以相同，也可以不同。

对肿瘤侵袭转移的抑制治疗的作用机理，与胸水和腹水的治疗存在本质的不同。针对恶性胸水和恶性腹水的治疗方面，本发明所涉及到的治疗性多肽通过局部用药，除了通过TGF-β/SMADs信号轴的异常激活，可以抑制机体免疫功能以外，更重要的是可以在局部产生轻微的炎症反应，达到胸腹膜粘连闭合。因此，此种多肽可以激活机体局部的免疫能力，进而达到抑制肿瘤进一步发生发展。此外，此种多肽可以抑制肿瘤细胞在胸膜腔及腹膜腔中的局部播散。因此，如何抑制肿瘤侵袭转移，与如何缓解恶性腹水，没有直接相关性。

优选地，所述穿膜肽Ⅰ和穿膜肽Ⅱ的氨基酸序列均如SEQ ID NO.03所示。

优选地，两条多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.04、SEQ ID NO.05所示。

优选地，所述药物为含有所述蛋白质多肽的静脉注射剂。

更优选地，所述药物中，所述蛋白质多肽的浓度为2.5-3.5mg/mL。一般而言，药物的规格为100μL。

恶性胸腹水的产生多由肿瘤细胞通过直接浸润或者远处肿瘤细胞转移定植到胸膜腔或者腹膜腔，因为肿瘤细胞侵袭和阻塞局部毛细血管和淋巴管所致，故恶性胸腹水常常含有大量蛋白质和血液的成分。而其他普通胸腹水(例如渗出性胸腹水，漏出性胸腹水以及结核性胸腹水等)的产生，不是由肿瘤细胞的局部侵犯或者远处定植转移所引起的。申请人通过对蛋白质多肽的深入研究，先构建恶性腹水和恶性胸水小鼠模型，再在腹腔注射蛋白质多肽，发现注射上述这种蛋白质多肽能够抑制腹水和恶性胸水的产生，减少恶性腹水和胸水量。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种可以治疗恶性腹水和恶性胸水的治疗性药物，即本发明提供的蛋白质多肽。将该蛋白质多肽用于治疗恶性腹水和恶性胸水的用途，在行业内尚属首次发现，可为临床治疗恶性腹水和恶性胸水的药物开发提供理论及实践基础。

附图说明

图1为实验例1的各组恶性腹水小鼠中腹围的变化情况；

图2为实验例1的各组恶性腹水小鼠的成像图；

图3为实验例1的各组恶性腹水小鼠恶性腹水的含量；

图4为实验例1的各组恶性腹水小鼠的生存曲线；

图5为实验例2的各组恶性胸水小鼠的成像图；

图6为实验例2的各组小鼠恶性胸水的含量；

图7为实验例2的各组恶性胸水小鼠的生存曲线；

图8为实验例1和2所使用的蛋白质多肽的氨基酸残基序列示意图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实验例中，所采用的蛋白质多肽的两条多肽的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.04、SEQ ID NO.05所示，氨基酸序列的缩写图示见附图8所示；通过委托武汉华美生物工程有限公司分别合成。使用PBS缓冲液将两条多肽制成1μg/mL的静脉注射液。

第一条多肽的氨基酸序列为：Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg ArgAla Leu Asp Glu Leu Glu Lys Ala Ile Thr Thr Gln；

第二条多肽的氨基酸序列为：Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg ArgAla Pro Ala Thr Val Cys Lys IIe Pro Pro Gly Cys；

上述两条多肽序列中，穿膜肽的氨基酸序列为：Tyr Gly Arg Lys Lys Arg ArgGln Arg Arg Arg Ala。

实验例1：多肽药物对恶性腹水的发生发展的影响

1、恶性腹水模型的构建

将1×10

2、腹腔注射多肽药物对恶性腹水的影响

通过武汉华美生物工程有限公司分别制备本实验例所需的蛋白质多肽药物。恶性腹水造模一天后，A组小鼠每两天向腹腔内注射PBS溶液100μL；B组小鼠每两天向腹腔注射5-fu化疗药(25mg/kg；100μL)；C组小鼠每两天向腹腔注射蛋白质多肽药物(1mg/ml；100μL)；用药后，第二天开始每隔五天，量取小鼠腹围，结果见附图1。从图1可以看到，使用5-fu化疗药以及多肽药物的小鼠腹围明显小于使用PBS组的小鼠。

用药后第十六天时，通过小动物活体成像，观察小鼠腹腔类肿瘤的生长情况，见附图2。从图2可以看到，使用5-fu化疗药以及多肽药物的小鼠腹腔细胞数明显少于使用PBS组的小鼠。

用药后第十六天时，处死每组中任意10只小鼠，收集其腹水含量，并作统计学student t检验，结果见附图3。从图3可以看到，使用5-fu化疗药以及多肽药物的小鼠腹水量明显小于使用PBS组的小鼠。

恶性腹水造模后，随着时间的延长，观察小鼠生存时间的变化，并绘制小鼠生存曲线，结果见附图4。从图4可以看到，使用5-fu化疗药以及多肽药物的小鼠生存时间明显长于使用PBS组的小鼠。

从上述实验可以发现，采用本发明的蛋白质多肽，能够有效的抑制恶性腹水的发展。

实验例2：多肽药物对恶性胸水的发生发展的影响

1、恶性胸水模型的构建

将1×10

2、胸腔注射多肽药物对恶性胸水的影响

通过武汉华美生物工程有限公司分别制备本实验例所需的蛋白质多肽药物。恶性腹水造模一天后，D组小鼠每两天向右侧胸腔内注射PBS溶液100μL；E组小鼠每两天向腹腔注射顺铂化疗药(1mg/kg；100μL)；F组小鼠每两天向腹腔注射蛋白质多肽药物(1mg/ml；100μL)；用药后第十六天时，通过小动物活体成像，观察小鼠腹腔类肿瘤的生长情况，见附图5。从图5可以看到，使用顺铂化疗药以及多肽药物的小鼠腹腔细胞数明显少于使用PBS组的小鼠。

用药后第十六天，处死每组中10只小鼠，收集其胸水含量，并作统计学student t检验，结果见附图6。从图6可以看到使用顺铂化疗药以及多肽药物的小鼠胸水量明显小于使用PBS组的小鼠。

恶性胸水造模后，随着时间的延长，观察小鼠生存时间的变化，并绘制小鼠生存曲线，结果见附图7。从图7可以看到使用顺铂化疗药以及多肽药物的小鼠生存时间明显长于使用PBS组的小鼠。

从上述实验可以发现，采用本发明的蛋白质多肽，能够有效的抑制恶性胸水的发展。

以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。