耐热性多聚体蛋白支架、耐热性多聚体蛋白支架在疫苗中的应用

摘要

本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及耐热性多聚体蛋白支架、耐热性多聚体蛋白支架在疫苗中的应用。本申请提供了耐热性多聚体蛋白支架，包括：用于偶联的第一标签和耐热性多聚体蛋白；所述第一标签连接在所述耐热性多聚体蛋白的N端；所述耐热性多聚体蛋白具有SeqIDNO.1～SeqIDNO.4所示序列中的一种或多种。本申请提供了耐热性多聚体蛋白支架、耐热性多聚体蛋白支架在疫苗中的应用，通过免疫原性较高的新型耐热性多聚体蛋白，用于制备各种疫苗抗原的耐热性多聚体蛋白支架和佐剂，从而建立一种基于耐热性多聚体蛋白制备疫苗热稳定性支架并增强抗原免疫原性的方法。

说明书

技术领域

本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及耐热性多聚体蛋白支架、耐热性多聚体蛋白支架在疫苗中的应用。

背景技术

传统疫苗主要基于减毒或灭活的活病原体。尽管其通常在宿主体内诱导保护性免疫反应方面非常有效，但该类型疫苗通常存在安全问题。例如，减毒活疫苗可能通过恢复为野生型而重新获得致病性，尤其是在免疫缺陷人群中。此外，此类疫苗通常需要严格的储存条件以保持其免疫活性，意外暴露于环境压力(例如，光照或温度)可能会导致免疫原性丧失。批次间变异性也可能是此类疫苗的一个问题，尤其是在大规模生产培养病原体期间。改良的亚单位疫苗与减毒活疫苗或灭活疫苗相比，具有更高的安全性和更小的批次间差异，但一直存在低免疫原性的缺陷，需要以高剂量和佐剂给药。

为了解决传统疫苗的问题，一种策略是通过将抗原与多聚体蛋白支架组合以赋予抗原高的稳定性或免疫原性。其工作原理主要是多聚体蛋白支架具有明确定义的平行多聚体结构，具有高稳定性，允许引入目标结合抗原和铰链区，并在不破坏目标抗原结合的情况下通过自组装实现所需的多价性。多聚体蛋白支架可在表面呈现多个副本的抗原或抗原表位，产生高局部密度的结构有序表位，并能够与B细胞受体进行高亲和力相互作用，诱发B细胞受体信号传导和强免疫刺激(例如T辅助细胞独立的B细胞活化)；其次，由于多聚体蛋白支架的颗粒性质和相对较大的尺寸，其可被专职抗原递呈细胞(例如树突状细胞和巨噬细胞)有效摄取和处理，进而促进强烈的体液和细胞免疫反应。

但是，现有多聚体蛋白抗原支架种类少，存在候选抗原远多于抗原支架的问题，导致机体先对抗原支架的免疫反应会抑制对抗原-支架组合的免疫反应，急需开发新型疫苗抗原支架。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了耐热性多聚体蛋白支架、耐热性多聚体蛋白支架在疫苗中的应用，将新型耐热性多聚体蛋白作为各种疫苗抗原的耐热性多聚体蛋白支架和佐剂，建立一种基于耐热性多聚体蛋白制备疫苗热稳定性支架并增强抗原免疫原性的方法。

本申请第一方面提供了耐热性多聚体蛋白支架，包括：

用于偶联的第一标签和耐热性多聚体蛋白；

所述第一标签连接在所述耐热性多聚体蛋白的末端；

所述耐热性多聚体蛋白具有Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3和Seq IDNO.4所示序列中的一种或多种。

具体的，所述第一标签连接在所述耐热性多聚体蛋白的N端或C端，优选为N端；保证多聚体蛋白的N端或C端暴露在颗粒蛋白表面。

另一实施例中，所述第一标签选自SpyCatcher、SnoopCatcher、SdCatcher和DogCatcher中的一种或多种。

另一实施例中，所述标签通过连接肽连接在所述耐热性多聚体蛋白的末端，可以为N端或C端；所述连接肽的序列为(GGGGS)

具体的，所述连接肽为柔性连接肽，柔性连接肽是一类以甘氨酸Gly为主要成分的柔软易弯折的连接肽，可根据连接蛋白的不同，长度适当进行调整，本申请所述连接肽选择GGGGSGGGGSGGGGS效果最佳。

本申请第二方面提供了所述的耐热性多聚体蛋白支架在制备疫苗中的应用。

本申请第三方面提供了一种疫苗，包括：所述耐热性多聚体蛋白支架和连接有第二标签的抗原；

所述第二标签可与所述第一标签重组形成异肽键偶联；所述抗原为可递呈病毒或/和细菌的特征性或保护性抗原；所述第二标签为与所述第一标签对应的标签，所述第二标签包括：SpyTag、SnoopTag、SdTag和DogTag中的一种或多种。

具体的，本申请的耐热性多聚体蛋白支架用于递呈各种病毒或细菌的特征性抗原，以制备相应的纳米颗粒的疫苗。

具体的，耐热性多聚体蛋白具有Seq ID NO.1的序列，Seq ID NO.1的序列为：

MAFEFKLPAFEFKLIHEGEIVKWFVKPGDEVNEDDVLCEVQNDKAVVEIPSPVKGKVLEILVPEGTVATVGQTLITLDAPAFEFKLLKDKSKKKRKKRKKRKRCRKRKRLTLSLPMHRQLKRRLARTAASSPCRPCASMRAKKASIFGLSKERAAFEFKLKEDIDAFLAGGAKPAPAAAEEKAAPAAAKPATTEGEFPETREKMSGIRRAIAKAPHVTLMDEADVTKLVAHRKKFKAIAAEKGIKLTFLPYVVKALVSALREYPVLNTSIDDETEEIIQKHYYNIGIAADTDRGLLVPVIKHADRKPIFALAQEINELAEKARDGKLTPGEMKGASCT。

具体的，耐热性多聚体蛋白具有Seq ID NO.1的序列，其核苷酸序列为：

ATGGCTTTTGAATTTAAGCTGCCGGCTTTTGAATTTAAGCTGATCCACGAAGGTGAAATTGTCAAATGGTTTGTGAAACCGGGCGATGAAGTGAACGAAGACGATGTATTGTGCGAAGTGCAAAATGACAAGGCGGTTGTCGAAATTCCCTCCCCGGTCAAAGGGAAAGTGCTTGAAATCCTCGTCCCGGAGGGAACAGTGGCAACGGTCGGGCAAACGCTCATCACGCTCGATGCGCCGGCTTTTGAATTTAAGCTGTTAAAGGACAAGAGCAAGAAGAAGCGAAAAAAGAGGAAAAAACGGAAACGGTGTCGAAAGAGGAAAAGGTTGACGCTGTCGCTCCCAATGCACCGGCAGCTGAAGCGGAGGCTGGCCCGAACCGCCGCGTCATCGCCATGCCGTCCGTGCGCAAGTATGCGCGCGAAAAAGGCGTCGATATTCGGCTTGTCCAAGGAACGGGCAGCTTTTGAATTTAAGCTGAAAGAAGATATTGACGCTTTCCTTGCCGGCGGCGCAAAACCGGCACCGGCCGCAGCGGAGGAAAAAGCGGCGCCGGCCGCAGCGAAACCGGCGACGACAGAAGGCGAATTCCCGGAAACGCGCGAGAAAATGAGCGGCATCCGTCGGGCGATTGCCAAAGCTCCGCACGTGACGCTGATGGACGAAGCCGATGTGACGAAGCTTGTTGCTCACCGAAAAAAATTCAAGGCTATTGCCGCGGAAAAAGGCATCAAGCTGACGTTTTTGCCGTACGTCGTCAAAGCGCTCGTTTCCGCGCTGCGTGAATACCCAGTGTTGAATACGTCCATTGATGATGAGACGGAAGAAATCATCCAGAAGCATTATTACAATATCGGCATCGCCGCTGATACGGACCGCGGCTTGCTTGTGCCGGTCATTAAACATGCCGATCGCAAGCCGATTTTCGCCTTGGCGCAAGAAATCAATGAGCTCGCCGAGAAAGCGCGCGACGGCAAACTGACGCCGGGAGAAATGAAAGGCGCTTCATGCACG。

另一实施例中，所述抗原为病原的保护性抗原，包括但不局限于口蹄疫病毒的衣壳蛋白VP1、SARS-CoV-2S刺突蛋白的受体结合域RBD、布鲁氏菌保护性抗原、非洲猪瘟保护性抗原、禽流感病毒的基质蛋白2胞外功能区M2e、埃博拉病毒的GP糖蛋白、狂犬病病毒的RVGP糖蛋白、日本脑炎病毒的前膜蛋白和包膜蛋白、登革病毒的包膜糖蛋白和膜蛋白、拉沙病毒的糖蛋白前体和西尼罗病毒的包膜蛋白中的一种或多种。

具体的，所述耐热性多聚体蛋白支架与所述连接有第二标签的抗原共价偶联。标签偶联能够有效避免基因融合中的复杂抗原错误折叠和化学结合中的耦合位点异质性等问题，实现抗原在自组装多聚体蛋白支架上的高效、定向组装。

另一实施例中，所述抗原为口蹄疫病毒的衣壳蛋白VP1。

所述口蹄疫病毒的衣壳蛋白VP1为O型口蹄疫病毒的衣壳蛋白VP1，GenBank:MZ634456.1，其蛋白序列为：

MTTSTGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQINVLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEAALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGNCKYGEGAVTNVRGDLQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPEQARHKQKIVAPVKQLL。

其核酸序列：

ATGACCACCTCCACAGGTGAGTCCGCTGATCCCGTGACCACCACCGTTGAGAATTACGGTGGAGAAACACAGGTCCAGAGACGTCAGCACACCGACGTTTCTTTCATTTTGGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATCAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCTCACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGCACCGCCACTTACTACTTCGCAGATTTAGAAGTGGCAGTGAAGCACGAAGGCAACCTCACCTGGGTCCCAAACGGGGCGCCCGAGGCGGCGCTGGATAACACCACCAACCCGACGGCCTACCACAAGGCACCGCTCACCCGTCTTGCTTTGCCTTACACAGCACCACACCGTGTTCTGGCTACCGTCTACAACGGGAACTGCAAGTACGGCGAGGGCGCCGTGACCAACGTGAGGGGTGACCTGCAAGTCTTGGCCCAGAAAGCAGCAAGAACGCTGCCCACCTCCTTCAACTACGGTGCCATTAAGGCTACCCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCTCGGCCCCTGCTGGCCATTCACCCGGAACAAGCCAGACACAAGCAGAAGATTGTGGCACCTGTCAAACAGTTGTTG。

具体的，所述布鲁氏菌的外膜蛋白BP26的氨基酸序列：

MNTRASNFLAASFSTIMLVGAFSLPAFAQENQMTTQPARIAVTGEGMMTASPDMAILNLSVLRQAKTAREAMTANNEAMTKVLDAMKKAGIEDRDLQTGGINIQPIYVYPDDKNNLKEPTITGYSVSTSLTVRVRELANVGKILDESVTLGVNQGGDLNLVNDNPSAVINEARKRAVANAIAKAKTLADAAGVGLGRVVEISELSRPPMPMPIARGQFRTMLAAAPDNSVPIAAGENSYNVSVNVVFEIK。

另一实施例中，所述第一标签为SpyCatcher；所述第二标签为SpyTag。

具体的，所述SpyCatcher的Gene bank号为：MN433887.1。

所述SpyCatcher的氨基酸序列：

MVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHT。

所述SpyTag的Gene bank号为：MT945421.1。

所述SpyTag的氨基酸序列：RGVPHIVMVDAYKRYK。

另一实施例中，所述耐热性多聚体蛋白支架的C端连接有His组氨酸标签，所述His组氨酸标签用于后期蛋白纯化。

具体的，通过GS氨基酸序列将His组氨酸标签连接在所述耐热性多聚体蛋白支架的C端。

另一实施例中，所述连接有第二标签的抗原的C端连接有His组氨酸标签，所述His组氨酸标签用于后期蛋白纯化。

具体的，通过GS氨基酸序列将His组氨酸标签连接在所述连接有第二标签的抗原的C端。

具体的，连接His组氨酸标签的SpyCatcher-E2(SC-E2)的氨基酸序列为：

MVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHTGGGGSGGGGSGGGGSMAFEFKLPAFEFKLIHEGEIVKWFVKPGDEVNEDDVLCEVQNDKAVVEIPSPVKGKVLEILVPEGTVATVGQTLITLDAPAFEFKLLKDKSKKKRKKRKKRKRCRKRKRLTLSLPMHRQLKRRLARTAASSPCRPCASMRAKKASIFGLSKERAAFEFKLKEDIDAFLAGGAKPAPAAAEEKAAPAAAKPATTEGEFPETREKMSGIRRAIAKAPHVTLMDEADVTKLVAHRKKFKAIAAEKGIKLTFLPYVVKALVSALREYPVLNTSIDDETEEIIQKHYYNIGIAADTDRGLLVPVIKHADRKPIFALAQEINELAEKARDGKLTPGEMKGASCTGSHHHHHH。

具体的，连接His组氨酸标签的SpyCatcher-E2(SC-E2)的核苷酸序列为：

ATGGTAACCACCTTATCAGGTTTATCAGGTGAGCAAGGTCCGTCCGGTGATATGACAACTGAAGAAGATAGTGCTACCCATATTAAATTCTCAAAACGTGATGAGGACGGCCGTGAGTTAGCTGGTGCAACTATGGAGTTGCGTGATTCATCTGGTAAAACTATTAGTACATGGATTTCAGATGGACATGTGAAGGATTTCTACCTGTATCCAGGAAAATATACATTTGTCGAAACCGCAGCACCAGACGGTTATGAGGTAGCAACTCCAATTGAATTTACAGTTAATGAGGACGGTCAGGTTACTGTAGATGGTGAAGCAACTGAAGGTGACGCTCATACTGGGGGCGGAGGGTCAGGGGGAGGCGGGTCTGGCGGCGGAGGGTCTGGCGGTGGGGGATCAATGGCTTTTGAATTTAAGCTGCCGGCTTTTGAATTTAAGCTGATCCACGAAGGTGAAATTGTCAAATGGTTTGTGAAACCGGGCGATGAAGTGAACGAAGACGATGTATTGTGCGAAGTGCAAAATGACAAGGCGGTTGTCGAAATTCCCTCCCCGGTCAAAGGGAAAGTGCTTGAAATCCTCGTCCCGGAGGGAACAGTGGCAACGGTCGGGCAAACGCTCATCACGCTCGATGCGCCGGCTTTTGAATTTAAGCTGTTAAAGGACAAGAGCAAGAAGAAGCGAAAAAAGAGGAAAAAACGGAAACGGTGTCGAAAGAGGAAAAGGTTGACGCTGTCGCTCCCAATGCACCGGCAGCTGAAGCGGAGGCTGGCCCGAACCGCCGCGTCATCGCCATGCCGTCCGTGCGCAAGTATGCGCGCGAAAAAGGCGTCGATATTCGGCTTGTCCAAGGAACGGGCAGCTTTTGAATTTAAGCTGAAAGAAGATATTGACGCTTTCCTTGCCGGCGGCGCAAAACCGGCACCGGCCGCAGCGGAGGAAAAAGCGGCGCCGGCCGCAGCGAAACCGGCGACGACAGAAGGCGAATTCCCGGAAACGCGCGAGAAAATGAGCGGCATCCGTCGGGCGATTGCCAAAGCTCCGCACGTGACGCTGATGGACGAAGCCGATGTGACGAAGCTTGTTGCTCACCGAAAAAAATTCAAGGCTATTGCCGCGGAAAAAGGCATCAAGCTGACGTTTTTGCCGTACGTCGTCAAAGCGCTCGTTTCCGCGCTGCGTGAATACCCAGTGTTGAATACGTCCATTGATGATGAGACGGAAGAAATCATCCAGAAGCATTATTACAATATCGGCATCGCCGCTGATACGGACCGCGGCTTGCTTGTGCCGGTCATTAAACATGCCGATCGCAAGCCGATTTTCGCCTTGGCGCAAGAAATCAATGAGCTCGCCGAGAAAGCGCGCGACGGCAAACTGACGCCGGGAGAAATGAAAGGCGCTTCATGCACGGGATCCCATCACCATCACCATCAC。

具体的，连接His组氨酸标签的SpyTag-VP1(ST-VP1)的氨基酸序列为：MRGVPHIVMVDAYKRYKGGGGSGGGGSGGGGSMTTSTGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQINVLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEAALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGNCKYGEGAVTNVRGDLQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPEQARHKQKIVAPVKQLLGSHHHHHH。

具体的，连接His组氨酸标签的SpyTag-VP1(ST-VP1)的核苷酸序列为：ATGCGTGGCGTGCCTCATATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCGTTACAAGGGGGGCGGAGGGTCAGGGGGAGGCGGGTCTGGCGGCGGAGGGTCTGGCGGTGGGGGATCAATGACCACCTCCACAGGTGAGTCCGCTGATCCCGTGACCACCACCGTTGAGAATTACGGTGGAGAAACACAGGTCCAGAGACGTCAGCACACCGACGTTTCTTTCATTTTGGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATCAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCTCACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGCACCGCCACTTACTACTTCGCAGATTTAGAAGTGGCAGTGAAGCACGAAGGCAACCTCACCTGGGTCCCAAACGGGGCGCCCGAGGCGGCGCTGGATAACACCACCAACCCGACGGCCTACCACAAGGCACCGCTCACCCGTCTTGCTTTGCCTTACACAGCACCACACCGTGTTCTGGCTACCGTCTACAACGGGAACTGCAAGTACGGCGAGGGCGCCGTGACCAACGTGAGGGGTGACCTGCAAGTCTTGGCCCAGAAAGCAGCAAGAACGCTGCCCACCTCCTTCAACTACGGTGCCATTAAGGCTACCCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCTCGGCCCCTGCTGGCCATTCACCCGGAACAAGCCAGACACAAGCAGAAGATTGTGGCACCTGTCAAACAGTTGTTGGGATCCCATCACCATCACCATCAC。

本申请第四方面提供了所述疫苗的制备方法，包括以下步骤：将所述耐热性多聚体蛋白支架、连接有第二标签的抗原于缓冲液中混合，纯化后得到疫苗。

另一实施例中，所述缓冲液为三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS缓冲液)。

具体的，所述耐热性多聚体蛋白支架和连接有第二标签的抗原在缓冲液混合，所述耐热性多聚体蛋白支架和所述连接有第二标签的抗原形成酰胺键共价结合，经纯化后得到疫苗。

与现有技术相比，本申请的有益效果是：

本申请提供一种基于耐热性多聚体蛋白制备疫苗耐热性多聚体蛋白支架并充当疫苗佐剂的方法，显著提高了疫苗抗原的稳定性和免疫原性。1、本申请通过构建耐热性多聚体蛋白支架，用于递送疫苗抗原，显著提升了疫苗抗原的稳定性，减少了疫苗存储和运输过程中的抗原损失；2、本申请构建的耐热性多聚体蛋白支架具有较高的免疫原性，可作为佐剂进一步提升疫苗抗原的免疫效果；3、本申请选择的耐热性多聚体蛋白大多数来源于嗜热菌等古细菌，使机体产生自身抗体反应的几率极低，而有关耐热性多聚体蛋白作为抗原支架的研究和应用较少，其作为新型抗原支架能够在一定程度上避免常用支架反复使用导致机体产生中和抗体进而影响疫苗免疫效果的问题。

1、本申请的耐热性多聚体蛋白本身具有耐热性，作为支架能够赋予疫苗抗原稳定性；2、本申请的耐热性多聚体蛋白本身为多聚体性质，作为支架能够赋予抗原多价性；3、本申请的耐热性多聚体蛋白本身具有免疫原性，可作为佐剂进一步提升疫苗抗原的免疫原性。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本实施例的SC-E2和ST-VP1的构建示意图；

图2为本实施例的耐热性多聚体蛋白支架与抗原的标签偶联示意图；

图3为本实施例的SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色对ST-VP1、SC-E2和VP1-E2纯度鉴定；

图4为本实施例的SC-E2和VP1-E2的60聚体形态的电镜结果；

图5为本实施例的SC-E2和VP1-E2随温度变化的溶解度结果；

图6为本实施例的冻干前后SC-E2和VP1-E2溶解度测定；

图7为本实施例的MTT检测SC-E2和VP1-E2的细胞毒性结果；

图8为本实施例的BALB/c小鼠的初免-加强免疫程序示意图；

图9为本实施例的不同方法处理小鼠的血清中针对VP1的抗体滴度的时间变化曲线；

图10为本实施例的不同方法处理小鼠的血清中针对E2的抗体滴度结果；

图11为本实施例的不同方法处理小鼠的FRNT50的抗体滴度测定结果；

图12为本实施例的不同方法处理小鼠的不同类型T细胞百分比图；

图13为本实施例的RFP标记的含有E2和VP1-E2的DCs的百分比图；

图14为本实施例的耐热性多聚体蛋白支架E2脉冲BMDC的RNA-Seq分析图。

具体实施方式

本申请提供了耐热性多聚体蛋白支架、耐热性多聚体蛋白支架在疫苗中的应用，将免疫原性较高的多聚体蛋白用于制备各种抗原的耐热性多聚体蛋白支架和佐剂。

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

其中，以下实施例所用原料或试剂均为市售或自制。

实施例1

本申请实施例提供了耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2表达与纯化，包括：

一、耐热性多聚体蛋白支架和抗原的表达：

1)将构建好的蛋白序列进行基因合成，DNA序列亚克隆到pET28a表达质粒中，分别构建pET28a-SpyCatcher-E2和pET28a-SpyTag-VP1；其中，E2为耐热性多聚体蛋白E2(E2具有Seq ID NO.1的序列)，VP1为口蹄疫病毒的衣壳蛋白VP1(GenBank:MZ634456.1)，SpyCatcher(标记SC)的Gene bank号为：MN433887.1，SpyTag(标记ST)的Gene bank号为：MT945421.1。

2)将SpyCatcher-E2和SpyTag-VP1的pET28a表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)-RIPL(安捷伦)中，细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB-琼脂平板上于37℃生长16h。

3)将单个菌落挑入5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB起始培养物中，并于37℃以220rpm振荡孵育16h。

4)将5mL培养物稀释到含有50μg/mL卡那霉素的500mL LB中，并于37℃下以220rpm振荡孵育。当A

二、耐热性多聚体蛋白支架和抗原的纯化：

1)将500mL的细胞培养物沉淀采用20mLPBS重悬，加入0.1mg/mL溶菌酶和1mM蛋白酶抑制剂(PMSF)，冰上裂解15min。

2)将裂解物于冰上超声5min，超声裂解液15000rpm/min离心15min，收集上清液。

3)参阅图1，将上清液与Ni-NTA琼脂糖树脂(GE Healthcare)一起温育以富集带有His标签的SpyCatcher-E2和SpyTag-VP1，得到两个蛋白，分别为：SC-E2-HIS和ST-VP1-HIS。然后用含咪唑的Tris缓冲液洗脱目标蛋白，得到耐热性多聚体蛋白支架SpyCatcher-E2与SpyTag-VP1的纯化蛋白。

4)将上述的纯化的蛋白质进行超滤浓缩，并用常规Tris缓冲液替换含咪唑的Tris缓冲液。

5)目的蛋白采用尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化。

6)用TritonX-114从样品中去除内毒素，BCA法测定去除内毒素的颗粒蛋白浓度。

7)采用SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色和SEC进行纯度鉴定。

三、耐热性多聚体蛋白支架SpyCatcher-E2与SpyTag-VP1的偶联与纯化：

参阅图2，纯化的SpyCatcher-E2与纯化的SpyTag-VP1在TBS缓冲液中能够形成酰胺键共价结合。

1)纯化的SpyCatcher-E2与1.5倍摩尔过量(VP1相对于E2的单体数量)的纯化SpyTag-VP1在室温下于TBS缓冲液中孵育过夜；

2)采用PBS平衡的Superose 610/300(GE Healthcare)柱，通过SEC将缀合的VP1-E2与游离的VP1分离，然后通过超滤装置进行浓缩，收集VP1偶联的E2纳米颗粒支架。

3)目标蛋白进行SDS-PAGE分离分析，验证其纯度。

4)使用BCA法测定目标蛋白浓度，用于后续分析。

四、ST-VP1、耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2的一般表征：

1)SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色进行纯度鉴定，结果如图3所示，从图3可知，本实施例成功制备疫苗VP1-E2纳米颗粒支架；

2)透射电镜(TEM)观察耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2的60聚体形态，结果如图4所示，图4左图为SC-E2支架的透射电镜图，图4右图为VP1-E2疫苗的透射电镜图，图4左图可知SC-E2支架的直径约为23nm，图4右图可知VP1-E2疫苗的直径约为26nm。上述结果显示，ST-VP1、耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2纯度较高，支架和疫苗在电镜下显示均匀一致的60聚体形态，粒径测量数据显示偶联ST-VP1后E2粒径增加，但未对其60聚体形态产生影响。

实施例2

本申请实施例提供了耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2的稳定性分析，具体包括：

1)耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2的热稳定性分析：

将纯化的耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2在中性缓冲液中于25～95℃的温度范围内孵育1h。通过离心去除聚集体，测量随温度变化的可溶部分中蛋白质的比例。

结果如图5所示。可溶性蛋白测定结果显示，当温度为80℃时，SC-E2和VP1-E2可溶性蛋白的比例未发生明显变化，表明SC-E2和VP1-E2具有较高的热稳定性(图5)。

2)耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2的冻干稳定性分析：

将纯化的耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2冻干，并在同一缓冲液中进行重构，检测冻干前后的颗粒溶解度。

结果如图6所示。经过冻干前后，SC-E2和VP1-E2均保持较高的溶解性，表明SC-E2和VP1-E2具有较高的冻干稳定性(图6)。

实施例3

本申请实施例提供了耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2的安全性评估，包括：

将上述的耐热型多聚体蛋白支架SC-E2和构建的疫苗VP1-E2采用体外细胞毒性实验作安全性评估。具体方案为分别采用不同浓度(0、0.05、0.1、0.15、1、2、5μM)的耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2处理中国仓鼠卵巢细胞(CHO)48h，MTT试剂盒检测细胞活性以评估支架和疫苗的毒性。

结果如图7所示。MTT毒性结果显示，采用不同浓度的耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2处理CHO细胞48h，细胞的增殖能力未发生明显变化，表明SC-E2和VP1-E2毒性低，安全性良好，可用于后续的动物体内免疫学评估。

实施例4

本申请实施例提供了疫苗VP1-E2接种在小鼠体内诱导体液免疫反应，包括：

1、设置动物实验，进行耐热性多聚体蛋白支架和疫苗的免疫原性评估：

具体分为4组：分别为空白组、SC-E2组、ST-VP1组、VP1-E2组，每组6只BALB/c小鼠。VP1-E2组为采用5μg剂量的VP1-E2疫苗进行皮下免疫，ST-VP1组为采用与VP1-E2组等摩尔的VP1进行免疫，SC-E2组为采用与VP1-E2组等摩尔的E2进行免疫，空白组不作任何处理。请参阅图8，所有小鼠均以初免-加强方式接种上述疫苗，即在第0周(W0)和第4周(W4)接种。每两周收集一次血清，第10周(W10)对小鼠实施安乐死。ELISA检测血清中针对VP1和E2的抗体变化水平。

各组小鼠的血清中随时间变化的VP1抗体水平如图9所示。ELISA结果表明，与ST-VP1单体组相比，疫苗VP1-E2可快速诱发小鼠产生较高的抗体水平，该水平可持续更长时间；与空白组相比，耐热性多聚体蛋白支架SC-E2后期也可诱发小鼠产生一定的抗体水平，但持续时间较短，表明耐热型多聚体蛋白支架SC-E2本身具有一定的免疫原性，但不足以诱导较高和持久的免疫反应。

各组小鼠的血清中针对耐热性多聚体蛋白支架E2的抗体滴度水平如图10所示。ELISA结果表明，耐热性多聚体蛋白支架SC-E2和疫苗VP1-E2组中均检出了高滴度的耐热性多聚体蛋白支架E2抗体，但未对VP1的抗体水平造成影响，证明了耐热性多聚体蛋白E2支架具有良好的安全性。

2、空斑减少中和试验(FRNT)，包括：

本实施例评估耐热性多聚体蛋白E2支架构建的VP1-E2疫苗在动物体内诱发的中和抗体的有效性，采用空斑减少中和试验(FRNT)检测其是否能抑制真正的口蹄疫病毒感染。由于实验条件限制，本实施例采用假型口蹄疫病毒进行Vero细胞感染。

试验分为4组：分别为空白组、SC-E2组、ST-VP1组、VP1-E2组，每组6只BALB/c小鼠。进行空斑减少中和试验，结果如图11，VP1-E2疫苗诱导的中和抗体能够强烈抑制假型口蹄疫病毒感染。VP1-E2疫苗接种小鼠的50％空斑减少中和试验(FRNT50)滴度超过3.2×10

3、VP1-E2疫苗接种在小鼠体内诱导有效的细胞免疫反应，包括：

本实施例验证VP1-E2疫苗接种可增强动物体内T细胞的激活，小鼠接种疫苗10d后，处死收集脾脏，通过流式细胞术评估不同类型淋巴细胞的百分比，包括CD4

试验分为4组：分别为空白组、SC-E2组、ST-VP1组、VP1-E2组，每组6只BALB/c小鼠。进行细胞免疫反应试验，结果如图12，流式检测结果表明，与单体接种ST-VP1组相比，VP1-E2疫苗接种能够在小鼠体内激活更多数量的不同类型的T细胞，表明细胞免疫反应显著增强；与空白组相比，单独的SC-E2耐热性多聚体蛋白支架接种也能激活少量的T细胞，尽管差异无统计学意义。

4、VP1-E2疫苗接种在小鼠体内诱导有效的抗原递呈效应，包括：

本实施例的自组装多聚体蛋白由于其较大的颗粒粒径，能够优先被专职抗原递呈细胞(如树突状细胞，DC)摄取和处理，加工后进一步递呈给T细胞增强免疫反应。本实施例阐明自组装的多聚体蛋白如何被宿主免疫系统识别和加工，进行了DC细胞抗原递呈实验。构建RFP标记的VP1、RFP标记的E2和RFP标记的VP1-E2，进行抗原追踪。

试验分为3组：分别为SC-E2组、ST-VP1组、VP1-E2组，每组6只BALB/c小鼠。将等摩尔的3种抗原皮下注射到6只BALB/c小鼠体内。4h后，分离腹股沟淋巴结，收获DC(B220-CD11c

结果如图13，流式结果显示，RFP标记的含有E2支架和VP1-E2的DCs的百分比显著高于RFP标记的含有VP1单体的细胞，这表明DC优先捕获多聚体蛋白颗粒。

5、耐热性多聚体蛋白支架E2脉冲BMDCs转录组谱分析：

使用全基因组转录方法来识别E2耐热性多聚体蛋白支架在抗原递呈细胞中诱导的基因表达特征，阐明E2支架引发免疫反应的分子机制。具体方案是对E2支架处理的小鼠未成熟BMDC进行RNA测序分析，分析E2支架对BMDC转录谱的影响，具体方法包括：

分组：随机将小鼠分为E2耐热性多聚体蛋白支架脉冲组和未脉冲组。

对小鼠的处理：

1、收集小鼠的骨髓源性树突状细胞(BMDC)，采用完全培养基(90％RPMI 1640和10％FBS)培养；

2、将细胞接种在添加有200U/mL重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的完全培养基中，培养7d。

3、收获未成熟细胞并与50μg/mL的E2耐热性多聚体蛋白支架共孵育1d，最终浓度为2.5×10

4、根据制造商方案，使用Tri Reagent从未处理的或E2处理的BMDCs中提取总RNA。

5、使用TruSeq RNA样品制备试剂盒制备的双末端文库(100×2bp)在IlluminaHiSeq2000平台上进行测序。

6、Cuffdiff和CummeRBund用于使用归一化表达值(FPKM：每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)来识别差异表达基因。

7、在至少一种条件下使用0.05FDR(错误发现率)和1FPKM的任意阈值来过滤出差异表达的基因。

8、使用DAVID(用于注释、可视化和集成发现的数据库)进行基因本体和通路分析。结果如图14。

比较未脉冲BMDC的转录组与E2处理细胞的转录组，E2支架处理后基因表达的显著失调(超过5300个基因，FDR<0.05)；在E2支架刺激下测量到2984个基因的显著上调，其中包括与免疫反应相关的基因上调，例如“趋化因子信号”和“Jak-STAT信号”通路。

此外，在E2支架脉冲的BMDCs中，Il12b、Il6和其他编码先天免疫系统受体的基因，例如Nlrp3(NOD样受体家族，pyrin结构域3、Tlr2，toll样受体2)和IL7r(白介素7受体)基因被上调。当用E2支架刺激BMDC时，编码共刺激分子CD40和Notch2信号成分(Notch2、Rbpj和Mib1)的基因表达水平增加，其中Notch2-RBPJ信号受体已被描述为控制DC功能分化并启动T细胞激活所需的独特信号分子。

以上结果表明，E2支架可通过先天免疫受体(PRR，模式识别受体)或相关免疫信号分子通路激活DC，并进一步激活T细胞，诱发强烈的细胞免疫反应。

实施例5

本申请实施例提供了耐热性多聚体蛋白的抗原性表征，具体包括：

利用软件VaxiJen v 2.0Server对上述Seq ID NO.2～Seq ID NO.4序列进行抗原性分析，TARGET ORGANISM选择细菌，测定Seq ID NO.2～Seq ID NO.4的抗原性评分。结果为：Seq ID NO.2(抗原性评分：0.6461)；Seq ID NO.3(抗原性评分：0.6953)；Seq ID NO.4(抗原性评分：0.6197)。

将上述免疫原性高的耐热性多聚体蛋白用于构建支架和疫苗，抗原选择布鲁氏菌外膜蛋白BP26，评估支架赋予疫苗抗原的稳定性和免疫原性，具体方案同实施例2～实施例5的E2-VP1疫苗：

(1)耐热性多聚体蛋白支架和疫苗表达构建和纯化；(2)耐热性多聚体蛋白支架和疫苗稳定性评估；(3)耐热性多聚体蛋白支架和疫苗安全性评估；(4)耐热性多聚体蛋白支架和疫苗免疫原性评估；(5)确定免疫原性较高的耐热性多聚体蛋白用于制备疫苗热稳定性支架和佐剂。

结果可知，上述3种耐热性多聚体蛋白支架(Seq ID NO.2～Seq ID NO.4)均可赋予疫苗抗原高的稳定性(热、冻融和冻干等)和免疫原性，其可作为新型支架并充当佐剂用于疫苗抗原递送。

综上所述，本申请实施例选择基于Seq ID NO.1的耐热性多聚体蛋白E2作为抗原支架，选择口蹄疫病毒的衣壳蛋白VP1(GenBank:MZ634456.1)作为疫苗抗原。该免疫原性较高的抗原支架制备新型热稳定性支架和佐剂，用于递送各种抗原，进而构建通用型疫苗抗原支架。通过耐热性多聚体蛋白E2支架构建的VP1-E2疫苗具有良好的稳定性，并能诱导强烈的体液和细胞免疫，其可能是基于(1)E2支架特殊的自组装和多聚体结构易被抗原递呈细胞摄取，并在其表面呈现多个抗原副本，增加了抗原与B、T细胞受体的亲和力；(2)E2支架本身存在较高的免疫原性，可作为佐剂进一步增强疫苗抗原的免疫效果。

以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

序列表

<110> 中山大学

<120> 耐热性多聚体蛋白支架、耐热性多聚体蛋白支架在疫苗中的应用

<130> MP21038682

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Phe Glu Phe Lys Leu Pro Ala Phe Glu Phe Lys Leu Ile His

1               5                   10                  15

Glu Gly Glu Ile Val Lys Trp Phe Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Asn

            20                  25                  30

Glu Asp Asp Val Leu Cys Glu Val Gln Asn Asp Lys Ala Val Val Glu

        35                  40                  45

Ile Pro Ser Pro Val Lys Gly Lys Val Leu Glu Ile Leu Val Pro Glu

    50                  55                  60

Gly Thr Val Ala Thr Val Gly Gln Thr Leu Ile Thr Leu Asp Ala Pro

65                  70                  75                  80

Ala Phe Glu Phe Lys Leu Leu Lys Asp Lys Ser Lys Lys Lys Arg Lys

                85                  90                  95

Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Cys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Thr Leu

            100                 105                 110

Ser Leu Pro Met His Arg Gln Leu Lys Arg Arg Leu Ala Arg Thr Ala

        115                 120                 125

Ala Ser Ser Pro Cys Arg Pro Cys Ala Ser Met Arg Ala Lys Lys Ala

    130                 135                 140

Ser Ile Phe Gly Leu Ser Lys Glu Arg Ala Ala Phe Glu Phe Lys Leu

145                 150                 155                 160

Lys Glu Asp Ile Asp Ala Phe Leu Ala Gly Gly Ala Lys Pro Ala Pro

                165                 170                 175

Ala Ala Ala Glu Glu Lys Ala Ala Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr

            180                 185                 190

Thr Glu Gly Glu Phe Pro Glu Thr Arg Glu Lys Met Ser Gly Ile Arg

        195                 200                 205

Arg Ala Ile Ala Lys Ala Pro His Val Thr Leu Met Asp Glu Ala Asp

    210                 215                 220

Val Thr Lys Leu Val Ala His Arg Lys Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ala

225                 230                 235                 240

Glu Lys Gly Ile Lys Leu Thr Phe Leu Pro Tyr Val Val Lys Ala Leu

                245                 250                 255

Val Ser Ala Leu Arg Glu Tyr Pro Val Leu Asn Thr Ser Ile Asp Asp

            260                 265                 270

Glu Thr Glu Glu Ile Ile Gln Lys His Tyr Tyr Asn Ile Gly Ile Ala

        275                 280                 285

Ala Asp Thr Asp Arg Gly Leu Leu Val Pro Val Ile Lys His Ala Asp

    290                 295                 300

Arg Lys Pro Ile Phe Ala Leu Ala Gln Glu Ile Asn Glu Leu Ala Glu

305                 310                 315                 320

Lys Ala Arg Asp Gly Lys Leu Thr Pro Gly Glu Met Lys Gly Ala Ser

                325                 330                 335

Cys Thr

<210> 2

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Phe Glu Phe Lys Leu Pro Ala Phe Glu Phe Lys Leu Ile His

1               5                   10                  15

Glu Gly Glu Ile Val Lys Trp Phe Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Asn

            20                  25                  30

Glu Asp Asp Val Leu Cys Glu Phe Lys Leu Pro Ala Phe Val Val Glu

        35                  40                  45

Ile Pro Ser Pro Val Lys Gly Lys Val Leu Glu Ile Leu Val Pro Glu

    50                  55                  60

Gly Thr Val Ala Thr Val Gly Gln Thr Leu Ile Thr Leu Phe Lys Leu

65                  70                  75                  80

Pro Ala Phe Phe Lys Leu Leu Lys Asp Lys Ser Lys Lys Lys Arg Lys

                85                  90                  95

Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Cys Arg Lys Arg Lys Arg Phe Lys Leu

            100                 105                 110

Pro Ala Phe Met His Arg Gln Leu Lys Arg Arg Leu Ala Arg Thr Ala

        115                 120                 125

Ala Ser Ser Pro Cys Arg Pro Cys Ala Ser Met Arg Ala Lys Lys Ala

    130                 135                 140

Ser Ile Phe Gly Leu Ser Lys Glu Arg Ala Ala Phe Glu Phe Lys Leu

145                 150                 155                 160

Lys Glu Asp Ile Asp Ala Phe Leu Ala Gly Gly Ala Lys Pro Ala Pro

                165                 170                 175

Ala Ala Phe Lys Leu Pro Ala Phe Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr

            180                 185                 190

Thr Glu Gly Glu Phe Pro Glu Thr Arg Glu Lys Met Ser Gly Ile Arg

        195                 200                 205

Arg Ala Ile Ala Lys Ala Pro His Val Thr Leu Met Asp Glu Ala Asp

    210                 215                 220

Val Thr Lys Leu Val Ala His Arg Lys Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ala

225                 230                 235                 240

Glu Lys Gly Ile Lys Leu Thr Phe Leu Pro Phe Lys Leu Pro Ala Phe

                245                 250                 255

Val Ser Ala Leu Arg Glu Tyr Pro Val Leu Asn Thr Ser Ile Asp Asp

            260                 265                 270

Glu Thr Glu Glu Ile Ile Gln Phe Lys Leu Pro Ala Phe Gly Ile Ala

        275                 280                 285

Ala Asp Thr Asp Arg Gly Leu Leu Val Pro Val Ile Lys His Ala Asp

    290                 295                 300

Arg Lys Pro Ile Phe Ala Leu Ala Gln Glu Ile Asn Glu Leu Ala Glu

305                 310                 315                 320

Lys Ala Arg Asp Gly Lys Leu Thr Pro Phe Lys Leu Pro Ala Phe Ser

                325                 330                 335

Cys Thr

<210> 3

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Phe Glu Phe Lys Leu Pro Ala Phe Glu Phe Lys Leu Ile His

1               5                   10                  15

Glu Gly Glu Ile Val Lys Trp Phe Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Asn

            20                  25                  30

Glu Asp Asp Val Leu Cys Glu Phe Lys Leu Pro Ala Phe Val Val Glu

        35                  40                  45

Ile Pro Ser Pro Val Lys Gly Lys Val Leu Glu Ile Leu Val Pro Glu

    50                  55                  60

Gly Thr Val Ala Thr Val Gly Gln Thr Leu Ile Thr Leu Phe Lys Leu

65                  70                  75                  80

Pro Ala Phe Phe Lys Leu Leu Lys Asp Lys Glu Phe Lys Leu Pro Ala

                85                  90                  95

Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Cys Arg Lys Arg Lys Arg Phe Lys Leu

            100                 105                 110

Glu Phe Lys Leu Pro Ala Gln Leu Lys Arg Arg Leu Ala Arg Thr Ala

        115                 120                 125

Ala Ser Ser Pro Cys Arg Pro Cys Ala Ser Met Arg Ala Lys Lys Ala

    130                 135                 140

Ser Ile Phe Gly Leu Ser Lys Glu Arg Ala Ala Phe Glu Phe Lys Leu

145                 150                 155                 160

Lys Glu Asp Ile Asp Ala Phe Leu Ala Gly Gly Ala Lys Pro Ala Pro

                165                 170                 175

Ala Ala Phe Lys Leu Glu Phe Lys Leu Pro Ala Ala Lys Pro Ala Thr

            180                 185                 190

Thr Glu Gly Glu Phe Pro Glu Thr Arg Glu Lys Met Ser Gly Ile Arg

        195                 200                 205

Arg Ala Ile Ala Lys Ala Pro His Val Thr Leu Met Asp Glu Ala Asp

    210                 215                 220

Val Thr Lys Leu Val Ala His Arg Lys Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ala

225                 230                 235                 240

Glu Lys Gly Ile Lys Leu Thr Phe Glu Phe Lys Leu Pro Ala Ala Phe

                245                 250                 255

Val Ser Ala Leu Arg Glu Tyr Pro Val Leu Asn Thr Ser Ile Asp Asp

            260                 265                 270

Glu Thr Glu Glu Ile Ile Gln Phe Lys Leu Pro Ala Phe Gly Ile Ala

        275                 280                 285

Ala Asp Thr Asp Arg Gly Leu Leu Val Pro Val Ile Lys Glu Phe Lys

    290                 295                 300

Leu Pro Ala Ile Phe Ala Leu Ala Gln Glu Phe Lys Leu Pro Ala Glu

305                 310                 315                 320

Lys Ala Arg Asp Gly Lys Leu Thr Pro Phe Lys Leu Pro Ala Phe Ser

                325                 330                 335

Cys Thr

<210> 4

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Phe Glu Phe Lys Leu Pro Ala Phe Glu Phe Lys Leu Ile His

1               5                   10                  15

Glu Gly Glu Ile Val Lys Trp Phe Val Lys Pro Gly Asp Glu Val Asn

            20                  25                  30

Glu Asp Asp Val Leu Cys Glu Phe Lys Leu Pro Ala Phe Val Val Glu

        35                  40                  45

Ile Pro Ser His Glu Gly Glu Ile Val Leu Glu Ile Leu Val Pro Glu

    50                  55                  60

Gly Thr Val Ala Thr Val Gly Gln Thr Leu Ile Thr Leu Phe Lys Leu

65                  70                  75                  80

Pro His Glu Gly Glu Ile Val Lys Asp Lys Glu Phe Lys Leu Pro Ala

                85                  90                  95

Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Cys Arg Lys Arg Lys Arg Phe Lys Leu

            100                 105                 110

Glu Phe Lys Leu His Glu Gly Glu Ile Val Arg Leu Ala Arg Thr Ala

        115                 120                 125

Ala Ser Ser Pro Cys Arg Pro Cys Ala Ser Met Arg Ala Lys Lys Ala

    130                 135                 140

Ser Ile Phe Gly Leu His Glu Gly Glu Ile Val Phe Glu Phe Lys Leu

145                 150                 155                 160

Lys Glu Asp Ile Asp Ala Phe Leu Ala Gly Gly Ala Lys Pro Ala Pro

                165                 170                 175

Ala Ala Phe Lys Leu Glu Phe Lys Leu Pro Ala Ala Lys Pro Ala Thr

            180                 185                 190

Thr Glu Gly Glu Phe Pro Glu Thr Arg Glu Lys Met Ser Gly Ile Arg

        195                 200                 205

Arg Ala Ile Ala Lys Ala Pro His Val Thr Leu Met Asp Glu Ala Asp

    210                 215                 220

His Glu Gly Glu Ile Val His Arg Lys Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ala

225                 230                 235                 240

Glu Lys Gly Ile Lys Leu His Glu Gly Glu Ile Val Pro Ala Ala Phe

                245                 250                 255

Val Ser Ala Leu Arg Glu Tyr Pro Val Leu Asn His Glu Gly Glu Ile

            260                 265                 270

Val Thr Glu Glu Ile Ile Gln Phe Lys Leu Pro Ala Phe Gly Ile His

        275                 280                 285

Glu Gly Glu Ile Val Gly Leu Leu Val Pro Val Ile Lys Glu Phe Lys

    290                 295                 300

Leu Pro Ala Ile Phe Ala Leu Ala Gln Glu Phe Lys Leu Pro Ala Glu

305                 310                 315                 320

Lys Ala Arg Asp Gly His Glu Gly Glu Ile Val Leu Pro Ala Phe Ser

                325                 330                 335

Cys Thr