没有清洗步骤或移动部件的使用磁珠的结合测定法

摘要

本公开提供了通过结合测定法对生物流体中的靶分析物进行即时分析的装置、系统和方法。本公开包括用于收集流体样品中包含的靶分析物并进行测定的盒。所述盒包括具有第一分离层、第二分离层和检测膜的测定叠层。所述盒还包括多个包含捕获分子和磁珠的第一复合物和多个包含检测分子和检测标记物的第二复合物。此外，所述检测膜包含与所述检测标记物相互作用以在所述靶分析物存在下引发可定量反应的底物。所述可定量反应对应于所述检测膜中存在的检测抗体的量，并且所述存在的检测抗体的量对应于存在的靶分析物的量。

说明书

技术领域

本公开总的来说涉及即时(POC)测试系统。更具体来说，本公开涉及不使用任何清洗步骤、温育步骤或移动部件的用于进行结合测定的系统和方法。

背景技术

即时(POC)测试是指在患者接受治疗的时间和地点进行医学诊断测试。POC测试与将患者样品送往实验室进行进一步分析的传统诊断测试相比具有优势，因为传统诊断测试的结果可能不能在数小时甚至数天或数周内获得，使得护理者在所述过渡期内难以评估适当的治疗过程。

通常，当测量生物流体例如血液中的某些化学分析物时，结合测定法例如免疫测定法是检测此类化学分析物的金标准。然而，结合测定法在POC诊断中很少使用，因为它们按惯例需要几个清洗步骤和几个温育步骤。由于在POC环境中恰当且准确进行结合测定的复杂性，这使得结合测定法难以并入到POC测试系统中。

例如，设计用于家庭使用POC测试系统特别具有挑战性，因为此类系统通常由训练有限或完全没有训练的人员操作。当前的系统通常会要求用户遵循多个分开的部件的多个操作步骤，其中用户引入的错误可以容易地导致不准确或失败的测定。

此外，在大多数用于血液样品的POC测试系统中，在提供测试结果的最终化学反应之前需要进行某些样品制备步骤。取决于测定法，这些样品制备步骤可能包括复杂的制备步骤例如血浆分离、细胞裂解、温育、清洗步骤等。完成此类复杂的制备步骤所需的时间可能与血液经历不希望的凝血所需的时间相当，这在测定结果中进一步引入了误差。尽管已经提出或实施了许多用于解决这个问题的尝试，但这些解决方案通常使用复杂的流体技术或移动部件来产生必要的温育时间和清洗步骤，并且此类机制导致成本、失败率和复杂性的提高。

因此，获得一种可以使用解决了上述问题的结合测定法检测靶分析物的POC系统，将是合乎需要的。

发明内容

本公开的实施方式的各个方面和优点将在下面的描述中部分阐述，或者可以从所述描述中学会，或者可以通过所述实施方式的实践学会。

本公开的一个示例性方面涉及一种用于收集生物流体样品中包含的靶分析物并对所述靶分析物进行测定的盒。所述盒包含具有第一分离层的测定叠层。所述测定叠层还包含多个具有捕获分子和磁珠的第一复合物；多个具有检测分子和检测标记物的第二复合物；第二分离层；和检测膜。所述检测膜包含与所述检测标记物相互作用，以在所述靶分析物存在下引发可定量反应的底物。所述可定量反应对应于所述检测膜中存在的检测分子的量，并且所述检测膜中存在的检测分子的量对应于所述流体样品中存在的靶分析物的量。

本公开的另一方面涉及一种制造盒的方法。所述方法不以特定顺序包括下述步骤：向第一分离层施加多个包含捕获分子和磁珠的第一复合物和多个包含检测分子和检测标记物的第二复合物；允许多个第一复合物和多个第二复合物在所述第一分离层上干燥；向检测膜施加底物；允许所述底物在所述检测膜上干燥；和将第二分离层放置在所述第一分离层与所述检测膜之间。此外，所述底物被配置成与所述检测标记物相互作用，以在引入到所述盒的流体样品中的靶分析物存在下引发可定量反应，所述可定量反应对应于所述检测膜中存在的检测分子的量，并且所述检测膜中存在的检测分子的量对应于所述流体样品中存在的靶分析物的量。

本公开的另一方面涉及一种用于收集流体样品中包含的靶分析物并对所述靶分析物进行测定的系统。所述系统包含：测定叠层，其中所述测定叠层包含第一分离层；多个包含捕获分子和磁珠的第一复合物；多个包含检测分子和检测标记物的第二复合物；第二分离层；和检测膜，其中所述检测膜包含与所述检测标记物相互作用，以在所述靶分析物存在下引发可定量反应的底物，其中所述可定量反应对应于所述检测膜中存在的检测分子的量，并且其中所述检测膜中存在的检测分子的量对应于所述流体样品中存在的靶分析物的量；和电磁体，其用于牵引包含结合到所述第一复合物之一和所述第二复合物之一的靶分析物的第三复合物通过所述第二分离层到达所述检测膜。

本公开的另一方面涉及所提出的盒的体外用途，其用于对分离的流体样品中的靶分析物进行测定。

本公开的另一方面涉及盒的用途，其用于对分离的流体样品中的靶分析物进行测定的诊断方法中。

参考下面的描述和权利要求书，本公开的各种不同实施方式的这些和其他特点、方面和优点将变得更好理解。并入到本说明书中并形成本说明书的一部分的附图说明了本公开的示例性实施方式，并且与所述描述一起用于解释相关的原理。

附图说明

在本说明书中，参考附图针对本领域普通技术人员阐述了实施方式的详细讨论，在所述附图中：

图1提供了根据本公开的一个实施方式的包含盒和测定读取器的系统的示意图；

图2A-2C示出了在所述系统中使用的盒的实施方式；

图3示出了包含在所述盒中的计量叠层的各个不同层；

图4示出了包含在所述盒中的测定叠层的各个不同层；

图5A示出了根据本公开的一个实施方式的测定读取器的纵向剖视图；

图5B示出了根据本公开的一个实施方式的插入有盒的测定读取器的纵向剖视图；

图6A示出了根据本公开的一个实施方式的测定读取器的横向剖视图；

图6B示出了根据本公开的一个实施方式的插入有盒的测定读取器的横向剖视图；

图7示出了根据本公开的示例性实施方案的测定读取器的传感器系统的框图；

图8A-8F示出了在将待分析靶分析物的存在的流体引入到盒后，在免疫测定过程的各个不同阶段中包含计量叠层和测定叠层的盒；

图9示出了流程图，说明了根据本公开的示例性实施方案的测定系统的使用方法；并且

图10示出了流程图，说明了根据本公开的一个示例性实施方案的盒的制造方法。

在多个图中重复出现的指称数字旨在标识各种不同实施方案中的相同特征。

具体实施方式

本说明书中公开的任何排布或实施方式、包括但不限于下文公开的任何盒实施方式和任何测试或测定实施方式的任何特点、组分或详情，可以与本文公开的任何排布或实施方式的任何其他特点、组分或详情可互换地组合，以形成新的排布和实施方式。

总的来说，本公开涉及装置和系统，其通过不需任何清洗步骤且不需任何移动部件的免疫测定法或其他结合类型的测定法，用于生物流体样品中包含的靶分析物的快速POC检测和所述靶分析物的后续分析。在某些实施方式中，所述结合测定法也可以在没有任何温育步骤的情况下进行。本公开还提供了使用所述装置，通过免疫测定法或其他结合类型的测定法分析所述流体样品以定量所述流体样品中存在的靶分析物的水平的方法和系统。

所述装置可以采取包含测定叠层的盒的形式。所述测定叠层包括第一分离层、第二分离层和含有与检测标记物相互作用以引发可定量反应的底物的检测膜。所述第二分离层可以排布在所述第一分离层与检测膜之间。可以将多个各自包含捕获分子和磁珠的第一复合物和多个各自包含检测分子和检测标记物的第二复合物在所述第一分离层上干燥，其中应该理解所述捕获分子和检测分子根据它们与所述靶分析物结合的能力来选择。在流体样品与所述第一分离层接触后，所述流体样品中存在的任何靶分析物会与所述第一复合物和第二复合物偶联，以形成一个或多个第三复合物。在示例性实施方式中，可以激活电磁体以牵引任何第三复合物通过所述第二分离层到达所述检测膜，而任何未结合的第二复合物保留在所述第二分离层中。还应该理解，任何未结合的第一复合物也会被牵引通过所述第二分离层到达所述检测膜。然而，由于此类未结合的第一复合物不与靶分析物、检测分子或检测标记物偶联，因此所述未结合的第一复合物在检测膜中的存在不影响所述结合测定法的准确性。随后，在所述靶分析物存在下，所述底物可以与所述检测标记物相互作用，以引发可定量反应(例如比色、荧光、电化学等)。所述可定量反应可以对应于所述检测膜中存在的检测分子的量，并且所述检测膜中存在的检测分子的量可以对应于所述流体样品中存在的靶分析物的量。应该理解，本领域普通技术人员已知的任何结合测定法可用于本公开的系统和装置，例如但不限于夹心测定法、竞争测定法或标记抗原测定法。此外，尽管在下面的实施方式中描述了免疫测定法，但本公开也设想了抗体之外的其他检测和捕获分子。

所述提出的解决方案允许提供能够进行分离的(生物)流体样品的体外测定的紧凑型POC测试系统，其不需清洗和温育步骤，并因此在POC系统中不需物理清洗或复杂的移动部件。根据所述提议构建的盒具有测定叠层，其包含夹心在第一分离层和检测膜之间的第二分离层，在这种情形中允许高成本效益地并且与常规POC测试系统相比复杂度更低地检测流体样品中的靶分析物。与所提出的测定读取器组合，可以以容易的方式自动进行检测，因为所述流体样品中存在的任何靶分析物可以结合到多个第一复合物和多个第二复合物以产生第三复合物，然后可以在特定时间点，在激活所述测定读取器的电磁体后牵拉所述第三复合物通过所述测定叠层。基于允许在得到的信号(例如颜色变化)的基础上定性或甚至定量确定所述样品流体中的靶分析物的量的检测膜，自动评估所述流体样品中靶分析物的存在也是可能的。

此外应该理解，当所述电磁体未被激活时，所述第一和第二复合物有时间与所述流体样品中的靶分析物相互作用，然后在所述电磁体被激活以牵引任何第三复合物通过以到达检测膜后，通过所述测定叠层移动到所述检测膜。这允许精确控制流体样品温育时间，其中这种精确控制在许多其他测定平台中是不可能的，更不用说具有物理清洗步骤的测定平台。

现在参考附图更详细地讨论本公开的示例性实施方式。首先将讨论盒和测定读取器的组件，然后是用于进行本公开所设想的免疫测定的组件。

图1示出了根据本公开的一个示例性实施方式的POC测试系统。所述POC测试系统包含盒100和测定读取器110。正如本文中描述的，盒100用于收集可能潜在地含有靶分析物的生物样品。所述收集过程还将所述靶分析物分配在盒100内。在将所述靶分析物收集在盒100中之后，用户将盒100插入到测定读取器110中。正如本文中描述的，将盒100插入到测定读取器110中的行动导致盒100的压缩，从而使所述靶分析物分配到多个测定垫。通过这种方式，将盒100插入到测定读取器110中的行动开始了一个或多个测定反应，它们提供关于所述靶分析物的内含物的信息。然而，还应该理解，设想了不需压缩的其他插入方法。此外，还应该理解，尽管可以利用多种测定法来确定靶样品的内含物，但每种测定法通常特异性针对一种特定靶分析物。正如本文中描述的，测定读取器110装备有用于检测在盒100的一个或多个测定垫处发生的一个或多个测定反应的结果的检测系统。所述检测系统没有特别限制，可以是作为测定反应的结果引起可测量的信号变化的检测系统。适合的检测系统的非限制性实例包括本文所描述的比色、荧光、电化学和光学检测系统和本领域普通技术人员会理解的任何其他检测系统。

图2A示出了采取盒200的形式的盒100的实施方式的顶部透视图。在图2A中，盒200包括附连到手柄202的外壳201。通常，盒200被设计成容易被用户操作，并为装在盒200内的微流体分配系统和测定组件提供保护性壳。通常，用于外壳201和手柄202的适合材料包括聚烯烃化合物例如聚乙烯、聚丙烯和医疗装置制造领域中已知的其他聚合树脂或化合物。在样品收集期间，盒200与流体样品(例如血液)中的靶分析物发生接触。所述靶分析物通过毛细作用经通道开口204吸取到通道203中。在某些实施方式中，通道203包含沿着通道203放置的多个接收区室205。在某些实施方式中，每个接收区室位于两个通气孔之间，这有助于将所述通道中的靶分析物划分成多个等分试样，流向所述测定叠层中的测定垫。应该认识到，通道开口204可以起到通气孔的作用，并且相邻接收区室可以在它们之间共享共同的通气孔。所述通气孔与本文中描述的多孔或网状材料相结合，防止当所述靶分析物被吸取到接收区室中时不想要的气泡形成。图2B示出了盒200的实施方式的底视图。在图2B中，外壳201的底部包含与通道开口204对齐的多个测定检测端口206。测定检测端口206允许例如通过本文所描述的光学检测方法质询测定结果。此外，外壳201的底部可以包含多个孔207，它们是可以与以相应的配置排布的测定组件和微流体通道一起使用的另外的测定检测端口。

图2C提供了根据本公开的一个实施方式的盒200的组件的分解图。在图2C中，盒200的外壳包括手柄202、底部外壳部分227和装备有槽228的盖子223。底部外壳部分227可以是具有一个开放侧面的长方体形状的围护结构。底部外壳部分227的围护结构形状保护了内部区室中的组件，并且可以避免系统的意外致动。盖子223可以配合到底部外壳部分227的开放侧面，并具有与底部外壳部分227的开放侧面对应的形状和尺寸。当将外壳的底部外壳部分227和盖子223组装在一起时可以形成内部区室，用于将所述盒的其他组件包封在所述内部区室中。在其他实施方式中，盖子223和底部外壳部分227不形成具有内部区室的围护结构，并且可以是放置在本文中描述的计量叠层顶上和测定叠层底下的刚性结构。

在优选实施方式中，底部外壳部分227和盖子223可以由为盒200提供刚性结构的材料形成。例如，底部外壳部分227和盖子223可以是本文所描述的塑性材料。底部外壳部分227和盖子223相对于彼此可以是可移动或不可移动的。在某些实施方式中，当盒200被插入到测定读取器中时，所述内部区室中的组件被压缩，导致至少一部分所收集的靶分析物被递送到多个测定组件。所述压缩可以例如由用户关闭测定读取器的封盖引起。然而，还应该理解，设想了不需压缩的用于将盒200插入到测定读取器中的其他方法。

在某些实施方式中，所述盒不包括盖子和底部外壳部分。在此类实施方式中，所述盒不包括外壳201(参见例如图2A)，并且所述计量叠层和测定叠层可以在周围没有围护结构的情况下插入到测定读取器中。

如图2C中所示，盒200可以包括计量叠层224、间隔材料225和测定叠层226。计量叠层224可用于收集生物流体(例如血液)的样品，并且测定叠层226包含如本文中详细讨论的用于进行结合测定法(例如免疫测定法)的测定组件。当在本文中使用时，术语“计量”是指收集生物流体的液体样品并将一个或多个预定体积的至少一部分所述流体递送到所述测定组件，用于通过包含在测定叠层中的测定组件进一步分析。当在盒中组装时，计量叠层224、间隔材料225和测定叠层226可以排列成叠层。

间隔材料225是可压缩层，其可以如图2C中所示放置在计量叠层224与测定叠层226之间。在一个实施方式中，间隔材料225可以是柔性材料，其在所述盒被插入到测定读取器中时可以在竖直方向上被压缩，并将计量叠层224移动到与测定叠层226接触或近邻。在某些实施方式中，间隔材料225可以是柔性材料例如泡沫、橡胶、多孔聚合物、金属、棉花或其他弯曲、折叠或移动机构例如夹具或弹簧。在某些实施方式中，所述计量和测定叠层最初被由间隔材料225维持的空气间隙隔开。在某些实施方式中，在将盒的层放置在一起之前，间隔材料225被物理附着到另一个层例如计量叠层224或测定叠层226。通常，所述计量和测定叠层在整个样品收集过程中保持分离。在此类实施方式中，所述计量叠层与测定叠层之间的分离可以防止在所述靶分析物收集步骤期间开始化学反应。当间隔材料225被压缩时，计量叠层224和测定叠层226可以彼此发生接触或邻近。

在优选实施方式中，当所述计量叠层完全充满生物流体时，将所述盒插入到测定读取器中。优选地，用于通道230的顶表面的材料足够透明，使得用户可以通过目测检查确定何时通道230充满并且所述盒已准备好插入到测定读取器中。所述测定读取器被配置成接受所述盒，并包含压缩所述间隔材料的机构，从而在将所述盒插入到测定读取器中时将所述计量叠层和测定叠层推在一起。所述间隔材料的压缩导致预定体积的至少一部分收集的流体流向测定叠层中的测定组件。通过这种方式，将所述计量叠层和测定叠层压在一起的行动在某些实施方式中可以提供明确的时间点，标记了通过所述测定叠层中的组件进行的免疫测定法或其他结合类型的测定法的开始。然而，还应该理解，设想了不需要将所述计量叠层和测定叠层压缩在一起的其他插入方法，正如本领域普通技术人员会理解的。

在某些实施方式中，所述含有靶分析物的生物流体是血液，并且所述盒可用于从皮肤点刺收集血液样品并将所述样品递送到所述测定叠层，这与最少的用户干预保持一致。使用常规刺血针的用户可以在适合的身体部位例如指尖、手掌、手、前臂、胃区等中引发出血。在皮肤上出现足够体积的一滴血液后，所述用户可以通过将所述盒的尖头碰触到所述血液滴来收集它。在所述计量叠层被血液完全充满后，用户可以将所述盒插入到测定读取器中，这触发了血液样品向所述测定叠层的递送。在某些实施方式中，这可以由患者、管理者或医疗保健提供者进行。本文描述的血液收集和测试不必由训练有素的医疗保健专业人员进行。

此外，所述盒的设计允许不在所述盒或测定读取器中使用任何移动部件例如泵或阀，即可将不同的预定体积的血液样品分发到多个测定位置。这提高了多重化定量POC分析的准确性和灵活性，同时降低了所述盒和测定读取器的复杂性和成本。

通常，如图2C中所示，计量叠层224包括通道230以包含所述靶分析物(例如血液样品中包含的感兴趣的分析物)。在某些实施方式中，通道230可以容纳体积在约0.5至约100μl、约5μl至约90μl、约10至约80μl、约20μl至约60μl或约30μl至约50μl范围内的含有靶分析物的生物流体。所述靶分析物的体积可以由所述通道的维度，包括本文所描述的通道的形状、宽度、长度和深度来控制。在某些实施方式中，所述通道的深度可以在约5μm至约3mm、约10μm至约2mm或约250μm至约1mm的范围内。在某些实施方式中，所述通道的宽度可以在约100μm至约10mm、约250μm至约5mm、约500μm至约3mm或约750μm至约1mm的范围内。在某些优选实施方式中，所述通道的维度被选择成使得所述靶分析物通过毛细作用吸取到所述通道中。

优选地，计量叠层224被设计成引导所述靶分析物流体流入通道230并进入可能存在的任何接收区室。在某些实施方式中，通道230可以由亲水性材料形成或涂布有亲水性材料，其非限制性实例包括93210亲水性PET(Adhesives Research,Glen Rock PA)或9984诊断微流体无表面活性剂流体运输膜、9960诊断微流体亲水膜或9962诊断微流体亲水膜(3MOakdale,MN)。通道230也可以沿着通道230的至少一些部分具有一种或多种多孔或网状材料，允许从计量叠层224的通道230分发至少一部分含有靶分析物的生物流体，以接触所述测定叠层中的测定组件。在一个非限制性实施方式中，所述计量叠层包括多孔或网状材料，其可以被放置成使得所述多孔或网状材料与所述计量叠层的顶表面上的通道部分和所述计量叠层的底表面上的测定分配端口和测定组件对齐。在某些实施方式中，所述多孔或网状材料被选择成使得此类材料中的孔眼将所述靶分析物分离成将要递送到测定组件的部分和不会递送到测定组件的部分。例如，当所述含有靶分析物的生物流体是血液时，所述多孔或网状材料的孔眼可以具有适合于将红细胞与其他血液组分例如血浆分离开的尺寸。通过这种方式，当将所述盒插入到测定读取器中以进行所述测定时，只有血浆被递送到所述测定组件进行分析。当然，可以使用多孔或网状材料的组合，使得全部生物流体被递送到某些测定组件，而只有一部分所述生物流体可以被递送到其他测定组件。例如，多孔或网状材料的组合可以允许仅仅血浆达到某些测定组件，但允许将所有血液组分递送到其他测定组件。在某些实施方式中，所述通道可以在通道的底部处包含多孔或网状材料。所述在通道底部处的多孔或网状材料可以是亲水性材料或用亲水性涂层涂布或处理的材料。在某些实施方式中，所述多孔或网状材料可以具有约1μm至约500μm的孔眼尺寸。有利情况下，当所述含有靶分析物的生物流体是血液时，所述多孔或网状材料的孔眼可以具有一定尺寸，允许所述多孔或网状材料在血液收集期间将血液样品保持在通道内而不滴落，并在将所述盒插入到测定读取器中之后发生的血液分发步骤期间被所述测定叠层吸收。在某些实施方式中，所述多孔或网状材料也可用于在用所述生物流体填充通道时释放空气和防止气泡形成。

图3示出了根据本公开的一个示例性实施方式的计量叠层304的分解图，其中此类计量叠层304可以用作图2A至2C的实施方式中的计量叠层224。在图3中，计量叠层304由组装的多个层形成。第一层341可以是塑料片，其具有当所述盒位于测定读取器外部时与周围环境连通的第一侧面342和面朝所述测定叠层的第二侧面343。在某些实施方式中，第一层341可以是所述计量叠层的覆盖层或顶层。在优选实施方式中，第一层341可能在第二侧面343上具有亲水性表面或涂层。适合的亲水性表面涂层的非限制性实例包括聚乙烯吡咯烷酮-聚氨酯互聚物、聚(甲基)丙烯酰胺、马来酸酐聚合物、纤维素聚合物、聚氧化乙烯聚合物和水溶性尼龙或其衍生物，仅举几例。第二侧面343上的亲水性表面或涂层的存在有助于将所述靶分析物吸取到通道中，因为如果不是所有也是大多数所述靶分析物是水性混合物例如血液。第一层341可以包括通气孔311，其被放置成与由下面的层定义的通道310对齐。例如在图3中，通气孔311与通道310的接收区室对齐，允许原本在通道装填期间将作为空气泡被捕获在所述接收区室中的空气高效地逃逸到周围环境中。应该指出，如果需要，所述通道开口可以充当排气孔。在某些优选实施方式中，第一层341包含在第二侧面343上具有亲水性涂层的聚对苯二甲酸乙二酯(PET)和通气孔311。

第二层344位于第一层341下方第一层341的第二侧面或面朝测定的侧面上。第二层344本身可以是如图3中所示的一个或多个层的组合。不论所述第二层包含一个层还是超过一个层，所述第二层基本上定义了所述计量叠层中的通道、包括可能作为所述通道的一部分的任何接收区室的形状和尺寸。例如，第二层344可以从一个或多个聚合材料层形成，所述聚合材料层被切割，以定义可以包含所述靶分析物的通道310的体积和形状。形成通道310的其他非限制性方法包括注塑、冲压、机械加工、铸造、层压和3-D打印。此类制造技术的组合也被本公开明确地设想。在图3中示出的实施方式中，第二层344具有面朝第一层341的第一侧面347和面朝所述测定叠层的相反的第二侧面348。此外，第二层344包含胶黏层345和塑料层346。胶黏层345将第一层341紧固到塑料层346。在某些实施方式中，第二层344可以是一个或多个塑料层346和胶黏层345的组合。优选地，胶黏层345或塑料层346或两者由将亲水性表面呈现到通道310的内表面的材料制成，以便于所述靶分析物在通道310中的分布。在某些实施方式中，所述亲水性塑料片可以包括PET材料，在其中切割出通道310。如果需要，通道310可以如图3中所示包括一个或多个接收区室。因此，通道310的厚度和几何形状可以控制待收集的样品的体积。通道310的亲水性内表面允许所述计量叠层通过毛细管力收集血液样品。在某些实施方式中，第一层341和第二层344可以是在计量叠层304中使用的一个整合的层。

在图3中，第三层349可以由疏水性胶黏层形成。用于制造第三层349的适合的材料的非限制性实例包括3M 200MP胶黏剂或3M300MP胶黏剂(3M,Oakdale,MN)。在优选实施方式中，在所述第三层中切割出与通道310相同的通道几何形状，以匹配在所述第二层中切割出的通道310。在某些实施方式中，第三层349可以具有面朝第二层344的第一侧面351和第二侧面352。在某些实施方式中，第三层349可以定义放置在所述第三层的第二侧面352下方或上的第四层350中的亲水区。

在某些实施方式中，第四层350可以是亲水性网状或多孔材料。在某些实施方式中，基本上所有的第四层350可以如图3中所示包括所述网状或多孔材料。在其他实施方式中，所述亲水性网状或多孔材料可以是第四层350的一部分。在某些实施方式中，例如图3中所示的实例，第四层350可以具有面朝第三层349的第一侧面353和相反的面朝测定叠层的第二侧面354。疏水性第三层349可以位于第四层350上方。疏水性第三层349可以是疏水性胶黏层，以定义第四层350的网状或多孔材料的可润湿区。

用于制造所述计量叠层的方法没有特别限制，只要它与医疗装置的总体制造要求相容即可。在某些实施方式中，首先将构成所述计量叠层的层紧固在一起作为大的多层片或条，然后对其进行冲压或切割过程，以形成包括通道和可能存在的任何接收区室的计量叠层。在某些实施方式中，第一层341和第二层344可以合并在一片塑性材料中，其具有形成通道的亲水性表面。在某些实施方式中，第三层349和第四层350可以合并在通过打印或其他方法制成的一片造型网中，以定义亲水性多孔区域。在某些实施方式中，在所述计量叠层中不使用所述第三层。各种不同的实施方式设想了两个或多个层以及其他层的各种不同的其他组合。

在本公开的结合测定法或POC系统中，测定反应在测定叠层中进行。通常，测定叠层包含一个或多个“测定组件”。当在本文中使用时，术语“测定组件”是指一个或多个有活性组件和无活性支撑元件或掩模，包括但不限于多重化测定垫。特定测定组件中的测定垫数目没有特别限制，并且可缩放以满足所述测定叠层被设计用于的患者病症的诊断所需的测定要求。在优选实施方式中，给定测定组件的测定垫的顶层与上方计量叠层中的通道的适合区域竖直对齐，以确保足以进行与所述感兴趣的特定靶分析物相关的测定的预定体积的生物流体被递送到所述测定垫。所述测定垫可以充当引流芯，吸取样品通过计量叠层的网进入测定叠层，例如通过毛细作用、重力等。因此，一旦所述计量叠层和测定叠层彼此接触或近邻，则所述待分析的生物流体被引导移动到测定垫中，在那里它可能遇到进行与特定测定组件有关的测定所需的一种或多种化学试剂。如果需要，所述测定叠层可以包含另外的层，其含有完成所述测定所需的化学物质。所需的层的数量可以取决于完成所述测定需要进行的化学反应的数量。在各种不同实施方式中，测定叠层的层可以由不同多孔膜材料的各种不同形状和各种不同尺寸的垫制成，所述材料的非限制性实例包括尼龙、聚醚砜(PES)、硝酸纤维素、纤维素滤纸和玻璃纤维。

可以使用本公开的测定系统形成的测定法的类型没有特别限制，并且可以是所需试剂可以稳定地并入到一个或多个测定垫中，并且可以引起可以通过测定读取器检测的变化的任何测定法。在某些实施方式中，所述测定反应引起颜色变化，其可以使用本文描述的比色检测方法来检测。其他测定反应可能引起另一种光学变化、荧光变化、电化学变化或可能在所述测定叠层的检测膜中发生的任何其他可检测的变化。在某些实施方式中，所述测定法可以是基于多孔材料的横向流测定法、垂直流测定法和/或横向和垂直流测定法的组合。通常，所述靶分析物被包含在生物流体中，其非限制性实例包括血液、血浆、血清、唾液、汗液、尿液、淋巴、泪液、滑膜液、乳汁和胆汁或其组分，仅仅举几个例子。在某些优选实施方式中，所述生物流体是血液或其组分(例如血浆)。例如，在一个实施方式中，本公开的测定系统可用于为患者提供关于他们的血液组成中的靶分析物的POC信息。可以在血液中测量的分析物的非限制性实例包括甲状腺标志物(例如T3、游离T4、促甲状腺激素等)、炎性标志物(例如C反应蛋白等)、维生素(通过竞争性测定结构检测)、代谢综合征标志物、葡萄糖、糖化血红蛋白、糖化白蛋白和针对疾病的抗体的血清学水平(通过标记的抗原结构检测)。可以在尿液中测量的分析物的非限制性实例包括总蛋白、白细胞酯酶和肌红蛋白。

图4示出了根据本公开的一个实施方式的示例性测定叠层406，其中此类测定叠层406可以具体用作图2A至2C的实施方式中的测定叠层226。在图4中，测定叠层406由多个层形成，包括一个或多个具有有活性组件和无活性支撑元件或掩模的层。更具体来说，在图4中，测定叠层406包含测定叠层覆盖层410，其特征在于切口部分411与上覆的测定叠层中的通道对齐。通常，测定叠层覆盖层410由在盒制造期间为所述测定叠层提供刚性和操作容易性的聚合材料制成。此外，切口部分411允许如本文中所述当将盒插入到测定读取器中时，生物流体经过测定叠层覆盖层410流向下方测定组件。正如所示，测定叠层406包含第一分离层461(例如血浆分离膜)，其可以是面朝计量叠层的最顶层。第一分离层461可用于分离所述生物流体的组分，以防止不想要的组分到达下方的测定组件。例如，当所述生物流体是血液时，第一分离层461可以是血浆分离膜，其在将盒插入到测定读取器中后防止红细胞到达所述测定组件。这是有利的，因为红细胞中存在的血红蛋白的强光谱吸收可能会压倒在测定法进行后在测定垫处发生的颜色变化。这种血浆分离膜可以由各种不同材料制成，其非限制性实例包括不对称聚砜膜、玻璃纤维或纤维素。在某些实施方式中，所述血浆分离膜的制造可以包括用于改进润湿性和/或其他性能的表面处理。所述血浆分离膜可以是用于所有测定组件的一张连续膜，或者可以是多张不连续的膜材料，其对于图4的测定叠层中的测定组件中的每个测定垫来说可以是相同或不同的(或其某种组合)。当第一分离层461不连续时，可以防止相邻测定之间的串扰。在某些实施方式中，测定组件的某些测定垫具有相应的血浆分离膜，而其他测定垫不具有这种层。在本公开设想的免疫测定系统中使用的其他另外的组件参考图8A-8F更详细讨论。

在图4中，测定叠层406包括测定组件420，其特征在于具有多个切口431的掩模支撑层430，所述切口被配置用于在测定叠层406组装时接收并固定测定垫440(例如疏水膜)。优选地，切口431被横向放置在掩模支撑层430中，使得每个测定垫440(例如包括低分子量截留膜、疏水膜或其组合的分离层)与上方计量叠层的通道和多孔或网状材料两者对齐，以便接收足以进行与给定测定垫相关的测定反应的预定体积的靶分析物。如图4中所示，在某些实施方式中，测定叠层406可以包括位于第一分离层461(例如血浆分离膜)和第一测定组件420下方的第二测定组件462。第二测定组件462包括具有多个切口451的掩模支撑层450，所述切口被配置用于在测定叠层406组装时接收并固定测定垫463。优选地，切口451被放置成将测定垫463与测定垫440(例如疏水膜)对齐，使得含有靶分析物的生物流体会从测定垫440流入测定垫463中。测定垫463(例如检测膜，例如但不限于颜色生成膜)可以包含完成测定反应所必需的化学试剂，所述测定反应在靶分析物流过测定组件420的测定垫440(例如疏水膜)后开始。在某些实施方式中，测定垫463充当检测指示层，提供与进行的测定的结果对应的信息。例如，测定垫463(例如颜色生成膜)可以包括视觉指示例如颜色变化以指示测定结果，尽管应该理解本公开设想的检测膜也设想了荧光和电化学变化或反应。此外，尽管图4中的测定叠层406只含有两个测定组件420和462，但应该理解测定叠层406可以含有另外的测定组件，其具有浸渍有完成特定测定和/或报告其结果所需的化学试剂的测定垫。例如，测定叠层406可以包括进行血液样品分析所必需的任何数量的测定组件。由于某些测定需要比其他测定更多的化学步骤，因此测定组件可以包含更多的非功能性测定垫，它们仅用于将完成的测定法产物吸取到所述测定叠层的底部，在那里可以如本文所述通过测定读取器来检测结果。

图4中的测定叠层406还包括测定底层470，其通常由聚合材料制成，以在制造过程中为测定叠层406提供机械强度和操作容易性。此外，测定底层470通常包含多个检测端口471，它们与测定叠层的测定垫对齐，并且其尺寸允许通过测定读取器质询测定结果。

图5A示出了根据本公开的一个非限制性实施方式的测定读取器的纵剖面示意图。在图5A中，测定读取器500包括盒接收区室510，其在盒按照箭头505所示插入时容纳盒。挡片515沿着测定读取器500纵向布置并延伸到盒接收区室510中。挡片515被配置成当将盒插入到测定读取器中时插入到所述盒顶部的槽例如图2C中的槽228中。此外，挡片515的底边与支撑表面520之间的间距525被设置成使得当盒被插入时，挡片515将所述计量叠层和测定叠层压缩在一起，从而使靶分析物从所述计量叠层流入测定叠层中并启动测定反应。在某些实施方式中，所述测定读取器可以包含滑入配合机构，其在盒已被完全插入到测定读取器中后将盒锁定在位。这是有利的，因为它防止用户在测定完成之前意外地将盒从测定读取器取出，这可能不利地影响测定结果的准确性。在某些实施方式中，测定读取器500还包含传感器542a和542b，其检测并计时盒的插入。例如，当盒被插入到盒接收区室510中并开始与挡片515接合时，盒的底表面可能在传感器542a上经过，这被适合的电子元件检测为盒的插入开始。第二传感器542b位于测定读取器500的更内侧，并在盒被完全插入时检测盒的存在以及发生完全插入的时间。然后测定读取器500比较盒插入的总时间，以确定盒的插入是否及时且适当。通过这种方式，测定读取器在(1)盒仅部分插入或(2)盒被部分插入、取出并再次插入的情况下将不进行任何测定读取。任一种情况都可能会给出不准确的测定读数，这是因为计量叠层和测定叠层的压缩不完全，导致所需量的靶分析物向测定叠层中的测定垫的递送不完全。

在图5A中示出的示例性实施方式中，测定读取器500通过检测由测定反应引起的测定垫的颜色变化来检测测定结果。为实现这一点，测定读取器500包含多个光源(在该横向剖视图中未示出)和光检测元件550，所述光检测元件排列在测定读取器500内，使得它们在盒被完全插入时与盒的测定垫对齐。为了使光检测元件550能够检测测定垫的颜色，支撑表面520可以配备有一个或多个光圈或者由允许光穿透的透明材料制成。然而，还应该理解，测定读取器500也可以包括检测测定叠层的检测膜部分中的电化学或荧光变化的组件。不论可以测量检测膜中的何种变化，测定读取器500还包括一个或多个电磁体552，其在被激活时，当复合物(例如免疫复合物)的一部分包括尤其是参考图8A-8F更详细讨论的磁珠时，便于靶分析物通过测定叠层的各个不同层的运输。图5B示出了具有完全插入的盒502的测定读取器500的纵剖面的示意图。可以对应于图1或图2A至2C的盒100或200的盒502包括计量叠层504和测定叠层506，它们被挡片515压缩在一起，使得靶分析物从计量叠层504递送到测定垫530。测定垫530与光检测元件550对齐。然而应该注意，测定读取器500可以包括不具有相应测定垫530的额外的光检测元件550a。额外的光检测元件例如光检测元件550a的存在，允许所述测定读取器与用于不同测定法的不同类型的盒、特别是可以被设计进行更多测定法的盒一起使用，以及允许鉴定所述用于不同测定法的不同类型的盒。

图6A示出了图5中示出的测定读取器的横向剖视图，其采取可用于检测颜色变化的测定读取器600的形式。在图6A中，测定读取器600包括挡片615，其延伸到盒接收区室610中以与盒上的槽接合。然后这种接合将计量叠层和测定叠层压向支撑表面620，启动测定反应。光源660a和660b提供用于检测测定结果的光，并靠近光检测装置650放置。具体来说，如图6A中所示，光源660a和660b提供光用于分析对应于光检测装置650的测定垫。通常，将一个或多个光源专用于每个光检测元件是有利的，以便确保所述光检测元件上的光子通量足以获得准确读数。在某些实施方式中，专用于特定光检测元件的光源具有相同的输出光谱。然而，在其他实施方式中，对应于给定光检测元件的光源产生不同的输出光谱。例如，所述光源可以是产生不同颜色的光的发光二极管(LED)。例如，当靶分析物是血液时，使用可以产生双色对(600nm/570nm)的光源来检测不想要的溶血的存在可能是有用的。通常，包含引导光和/或减少测定读取器中光散射的量的光学元件是有利的。在某些实施方式中，所述光学元件是只允许从与相应的测定垫视线可及的光源发出的光到达所述测定垫的光圈。例如，在图6A中，光源660a受到光圈限定元件670a和671a限制，使得只有来自于光源660a的通过光圈673a的光才能到达所述测定垫并随后被光检测装置650检测。同样地，光源660b受到光圈限定元件670b和671b限制，使得只有来自于光源660b的通过光圈673b的光才能到达所述测定垫并随后被光检测装置650检测。在优选实施方式中，光圈限定元件670a、670b、671a和671b由黑色材质材料制成，以便在光源660a和660b被打开时减少不想要的散射的量。此外，在这个实施方式中，光检测装置650位于包含光圈限定元件671a和671b的外壳中，所述元件只允许通过光圈672的光到达光检测装置650。如果需要，光圈672可以安装有滤光片，以只允许预定波长或波长范围的光被光检测装置650检测。这在例如装备的光源仅为比色分析提供白光时可能是有用的。此外，可以使用光学元件例如透镜、滤光片、快门、光纤、光导等引导或操控来自于光源660a和660b的光和将要用光检测装置650检测的光，这并不背离本公开的精神和范围。测定读取器600还包括一个或多个电磁体652，其在被激活时，当复合物(例如免疫复合物)的一部分包括尤其是参考图8A-8F更详细讨论的磁珠时，便于靶分析物通过测定叠层的各个不同层的运输。

图6B示出了图6A中描述的测定读取器的操作的示意图。在图6B中，将包含计量叠层604和测定叠层606的盒插入到测定读取器600的盒接收区室610中。挡片615将计量叠层604和测定叠层606压向支撑表面620，以使靶分析物从通道612流入测定垫630中。正如前面提到的，测定读取器600可以装配有传感器，以确认盒已被正确且以及时的方式插入。测定读取器600也可以在样品收集之前由用户或在制造过程中预先编程，以根据所使用的盒的类型在适合的时间照射测定垫。通过这种方式，测定读取器600仅在测定完成时从测定垫630收集测定数据。或者，如果需要，测定读取器600可以被配置成在盒已被插入后的整个测定反应期间从测定垫630收集测定数据。如图6B中所示，光源660a提供光束680a，其撞击在测定垫630的底部上以产生反射光束661。同样地，取决于待检测的测定法的要求，光源660b在与光源660a同时或不同时间产生光束680b，其可能撞击在测定垫630的底部上以产生反射光束661。

图7示出了根据本公开的一个示例性实施方式的测定读取器内部的传感器配置的框图700。在图7中，4个测定垫(由指称数字741、742、743和744标识)已完成它们与靶分析物的测定反应，经历了相应的颜色变化，并准备好用于比色分析。值得注意的是，如果需要，这种配置也可用于从所述4个测定垫收集数据，以监测测定反应的进展。来自于第一微控制器串行外围接口总线(MCU SPI总线)的输入信号701进入数模转换装置710，其包含独立地控制电流源721、722、723和724的单独的数模转换器711、712、713和714。这些电流源进而分别为光源731、732、733和734供电。在某些实施方式中，输入信号701可以在盒插入到测定读取器中之后的预定时间由定时电路发送。在此类实施方式中，所述预定时间对应于所述测定垫中的测定反应达到完成的一个或多个已知时间。在某些优选实施方式中，光源731、732、733和734在同一时间被激活，以多重化方式同时测量测定垫741、742、743和744的由测定引起的颜色变化。然而，本公开也设想了根据盒中的测定法的时间要求，分开地或顺序地或某些同时且某些分开地操作所有光源。

在这个非限制性实例中，每个光源731、732、733和734包括单独的三个发光二极管(LED)，它们取决于测定法和可能存在于测定读取器中的任何光学元件的要求，可以具有相同或不同的颜色。例如，在某些实施方式中，特定光源(例如731)中的三个LED可以是红色、绿色和蓝色(RGB LED)，使得当所有三个LED被激活时撞击到测定垫上的光是白光。当然，所述光源不限于任何特定数目或类型的LED或其他发光器件。更通常地，在本公开的测定读取器中有用的光源没有特别限制，只要它们为光检测元件提供适合波长和亮度的光以对从测定垫反射的有色光做出准确读取即可。在某些非限制性实施方式中，所述光源是发光二极管(LED)、有机发光二极管(OLED)、有源矩阵有机发光二极管(AMOLED)或激光器。例如，所述光源可以是仅仅一个LED，其具有足够的亮度和适合的波长以允许给定测定垫中的测定反应的比色分析。在某些实施方式中，所述光源可以产生特定波长的光。作为一个非限制性实例。当含有靶分析物的生物流体是血液(其中红细胞被移除)时，可以使用在570nm和600nm处产生光的双色光源来检测非功能性(即不含测定试剂的)测定垫上血红素的存在，其指示了患者中不想要的溶血。或者，所述光源可以是宽带光源，其与一个或多个窄带通滤光片配对，以选择某些所需波长的光。通常，所述光源产生电磁波谱的可见区(即400–700nm之间的波长)中的光，尽管本公开还设想了产生在电磁波谱的红外(700nm至10

在图7中，元件740是可以任选地存在于光源731、732、733和734与测定垫741、742、743和744之间的光路中的光学元件的示意图。在需要时，可以将一个或多个光学元件放置在所述光源与其相应的测定垫之间，以引导光、聚焦光、减少不想要的散射、选择一个或多个波长用于测定检测或其某些组合。此类光学元件的非限制性实例包括光圈、透镜、光导、带通滤光片、光纤、快门等。同样地，元件745代表了可以任选地存在于测定垫741、742、743和744与相应的光检测装置751、752、753和754之间的光路中的光学元件。这些光学元件可用于以与为元件740所述相似的方式操控光检测装置上游的光。应该理解，光源、测定垫和光检测装置的每种组合可以使用不同类型和数目的光学元件。光检测装置751、752、753和754检测来自于测定垫741、742、743和744的光。在这个非限制性实例中，所述光检测装置是光电二极管。更通常地，光检测装置的类型没有特别限制，只要它能够检测从测定垫反射的用于测定结果的比色测量的光即可。适合的光检测元件的其他实例包括光电二极管阵列、CCD芯片和CMOS芯片。来自于光检测装置(例如光电二极管)751、752、753和754的输出被送往跨阻抗放大器/低通滤光器元件761、762、763和764，所述元件将来自于光电二极管的电流信号转变成电压输出，同时过滤掉不想要的信号分量。所述来自于跨阻抗放大器/低通滤光器元件761、762、763和764的输出被送往模数转换装置770，其包含多重化转换器装置771、增益器772和模数转换器773。模数转换装置770的输出可以被送往组件780，其可以是第二MCU SPI总线、发射器或处理器。在某些实施方式中，所述发射器允许与个人计算机、移动设备或计算机网络硬接线或无线连接(例如蓝牙或Wi-Fi)。在一个特别有用的实施方式中，将所述测定结果传输到用户的移动设备或个人计算机，在那里它们被显示在图形用户界面(GUI)中。如果需要，除了当前结果之外，所述GUI还可以显示以前的测定结果，以便为用户提供关于测定结果的总体趋势的信息。例如，如果用户是糖尿病患者，则所述GUI可以将通过测定读取器测量的葡萄糖水平作为时间的函数作图，以允许用户确定血糖水平是否被适合地控制。此外，所述测定结果可以从用户的移动设备或计算机传输到计算机网络，例如属于所述用户的医生的计算机网络。通过这种方式，本公开的测定系统可以通过提供来自于由测定读取器获得的测定结果的最新医疗信息，允许用户的医生密切监测患者。

应该注意的是，上文中描述的光学检测系统对应于所述系统的某些示例性实施方式，但本公开也明确地设想了其他类型的检测系统。通常，对应于由测定反应引起的信号变化的任何检测系统均可与本公开的测定读取器相结合使用。因此，例如，在某些实施方式中，所述检测系统是基于化学发光的光学检测系统。在此类实施方式中，不需要光源例如LED和OLED来检测由测定垫中的测定反应引起的颜色变化。相反，信号变化可以由氧化酶例如萤光素酶与底物的反应引起，该反应导致通过生物发光反应产生的光。在另一个示例性实施方式中，所述由测定反应引起的信号变化可以通过电化学反应检测。

图8A-8F示出了在待分析靶分析物816的存在的流体样品814已被引入到盒800后进行免疫测定的各个不同阶段中，采取包括计量叠层802和测定叠层804的盒800的形式的盒100、200或502的另一个实施方式。计量叠层802被配置成接收靶分析物816并将其沿着通道分布，其中所述通道如上文中详细描述的具有包含多孔或网状材料的底部和与所述通道连通的一个或多个通气孔。也如上文所述，将间隔材料配置在所述计量叠层与测定叠层之间，其中所述间隔材料在所述计量叠层与测定叠层之间提供间隙，防止当盒处于未压缩状态时所述靶分析物从计量叠层流入测定叠层。此外，所述多孔或网状材料在盒800压缩后允许靶分析物816从计量叠层802流向测定叠层804。

在引入计量叠层802后，含有靶分析物816的流体样品814通往第一分离层806，并且最终靶分析物816经下文中更详细讨论的第二分离层808(例如疏水膜、低分子量截留膜或其组合)达到检测膜812(例如颜色生成膜)。当流体样品814是血液时，第一分离层806可以被称为血浆分离膜。此外，当流体样品814是血液时，第一分离层806可以包括孔眼840，其具有大得足以允许靶分析物816被牵引通过盒800的其他层的孔眼尺寸，但是也具有小得足以防止任何红细胞通过盒800的其他层(这会影响测定结果的准确性)的孔眼尺寸(例如小于约2微米)。这是因为红细胞中存在的血红蛋白具有强光谱吸收，其可能例如压倒在测定进行后发生的颜色变化。

此外，正如图8A中所示，第一分离层806还可以包括各自包含偶联的捕获分子818(例如在免疫测定法的情况下的捕获抗体)和磁珠820的多个第一复合物822和各自包含偶联的检测分子824(例如在免疫测定法的情况下的检测抗体)和检测标记物826的多个第二复合物828。最终，如图8B中所示，流体样品814中存在的任何靶分析物816可以结合到多个第一复合物822和多个第二复合物828以产生第三复合物834(例如在免疫测定法的情况下的免疫复合物)，其可以在激活电磁体852使电磁体852发出电磁力或信号853(参见图8C和8D)后被牵拉通过测定叠层804，其中第一分离层806的特定结构和组分基本上替换了在标准的测定法中通常使用的清洗和温育步骤，尽管应该理解在某些实施方式中，除了第一分离层806之外所述复合物也可以位于不同层上，其中清洗和温育步骤仍然被消除。在任何情况下，不论第一复合物822和第二复合物828最初被配置在测定叠层804上的何处，在本公开设想的测定系统中都消除了对使用流体物理清洗或复杂的移动部件的需求。正如前面结合图1和5A至7所讨论的，电磁体852可以是测定读取器的一部分。

捕获分子818可以是与靶分析物816特异性结合的捕获分子(例如在免疫测定法的情况下的捕获抗体)。用于靶分析物816的捕获分子818是本领域普通技术人员公知的，并且可以通过常规技术生产或可以容易地商购。此外，与捕获分子818偶联的磁珠820可以是铁磁性粒子，其可以被容易地偶联到生物分子例如捕获分子818。磁珠820可以具有约10纳米至约10微米、例如约20纳米至约7.5微米、例如约30纳米至约5微米范围内的直径。适合的磁珠被本领域普通技术人员公知，并且可以从商业化供应商获得。磁珠820可以包括氧化铁粒子例如磁铁矿(Fe

此外，像捕获分子818那样，检测分子824(例如在免疫测定法的情况下的检测抗体)也是与靶分析物特异性结合的分子。用于靶分析物816的检测分子824是本领域普通技术人员公知的，并且可以通过常规技术生产或者可以容易地商购。检测分子824被连接到检测标记物826。如下文更详细讨论的，检测标记物826可以开始与位于检测膜812(例如颜色生成膜、荧光生成膜、电化学信号生成膜等)中的试剂或底物830的化学反应，以产生可检测信号。例如，检测标记物826可以催化底物830的氧化。然后所述底物830的氧化形式可以提供采取颜色变化、荧光变化或电化学变化的形式的可检测信号。适合的检测标记物826在本领域中是公知的，并且可以包括过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酶。在一个特定实施方式中，检测标记物826可以是过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRP)，或者在另一个实施方式中，检测标记物826可以是β-半乳糖苷酶。检测分子824可以被直接地或通过连接物分子间接地偶联到检测标记物826，所述连接物分子可以被共价或非共价地结合到检测分子824和检测标记物826。在任何情况下，用于形成含有检测分子824(例如检测抗体)和检测标记物826的第二复合物828的适合的方法是本领域普通技术人员公知的。此外应该理解，当所述测定法是夹心测定法时，捕获分子818和检测分子824可以被选择成特异性针对靶分析物816并且配对以确保靶向靶分析物816的不同表位，使得两种分子都可以与靶分析物816结合，以产生包括捕获分子818、检测分子824和靶分析物816(以及磁珠820和检测标记物826)的复合物834。此外还应该理解，其他测定体系结构也落于本公开的范围之内，例如但不限于竞争和标记抗原体系结构。

测定叠层804还包括与第一分离层806相邻放置的第二分离层808(例如疏水膜、低分子量截留膜或其组合)。第二分离层808可以包括孔眼842，所述孔眼的尺寸大得足以允许包含结合到第一复合物822之一和第二复合物828之一的靶分析物816的第三复合物834在激活的电磁体852存在下通过，以到达检测膜812。第二分离层808也可以包括孔眼842，所述孔眼的尺寸小得足以阻止任何未结合的第二复合物836在激活的电磁体852存在下通过，以到达检测膜812(参见图8B-8F)，其中此类未结合的第二复合物836的通过会降低测定的准确性，因为这会允许未与靶分析物816偶联作为第三复合物834的一部分的过量检测标记物826通过以到达检测膜812并潜在地与底物830相互作用，会导致所述测定指示在流体样品814中存在比实际存在的更高浓度的靶分析物816。此外应该理解，未结合的第一复合物838在激活的电磁体852存在下通过以到达检测膜812是可接受的，因为未结合的第一复合物838不包含检测标记物826。

在某些实施方式中，孔眼842可以具有截留分子量为约150,000道尔顿或更小、例如约125,000道尔顿或更小、例如约100,000道尔顿或更小的孔眼尺寸，以防止含有检测分子824和检测标记物826的未结合的第二复合物836通过孔眼842，因为所述分子(例如抗体)可以具有约150,000道尔顿或更大的分子量。此外应该理解，尽管第一复合物822也包含可能具有高于约150,000道尔顿或更大的分子量的分子(例如抗体)(例如捕获分子818)，但第一复合物822中磁珠820的存在在激活电磁体852后提供了足够的力，以允许第二复合物828通过第二分离层808到达检测膜812。

除了第二分离层808的孔眼尺寸之外，第二分离层808还可以包括亲水处理810(例如涂层)，施加所述亲水处理是为了根据在第二复合物828中使用的特定检测分子824调制第二分离层808，使得它具有所需截留分子量。在一个实施方式中，亲水处理810可以包括一种或多种表面活性剂。本领域普通技术人员已知的任何适合的表面活性剂可用于形成亲水处理810，包括但不限于非离子型表面活性剂(例如具有亲水性聚氧化乙烯链和芳烃亲脂基团的表面活性剂如Triton X-100，包含含有寡聚(乙二醇)链的亲水性头部基团和脂肪酸酯组成部分的疏水尾部的聚山梨酸酯分子的表面活性剂例如吐温20、吐温40和吐温80等)、阴离子型表面活性剂(例如月桂醇聚醚硫酸钠、十二烷基硫酸钠等)和阳离子型表面活性剂(例如甲基三乙醇铵)。在任何情况下，应该理解，本领域普通技术人员可以根据电磁体852的电磁体信号853的磁场强度、磁珠820的尺寸、所使用的材料的截留分子量来优化低分子量截留膜材料、疏水膜材料、亲水处理或涂层等的组合，以形成第二分离层808。

在任何形成的第三复合物834(其含有存在并夹心在第一复合物822与第二复合物828之间的任何靶分析物816)以及任何未结合的第一复合物838(其含有捕获分子818和磁珠820)对由一个或多个电磁体852发出的磁力或信号853做出响应穿过第二分离层808中的孔眼842后，每个第三复合物834中的检测标记物826可以与检测膜812中存在的底物830反应。参见图8D-8F。在靶分析物816存在下，底物830与存在的任何检测标记物826之间的反应可以引发可定量反应844(例如比色反应、荧光反应、电化学反应等)，其中可定量反应844对应于检测膜812中存在的检测分子824的量，如图8E和8F中所示。此外，检测膜812中存在的检测分子824的量对应于流体样品814中存在的靶分析物816的量。在一个实施方式中，底物830可以包括一种或多种用于检测标记物826的试剂。例如，在一个实施方式中，底物830可以包括可以被附连到检测分子824的检测标记物826催化以在检测膜812内提供可检测信号的一种或多种试剂。例如，底物830可以包括第一试剂和/或第二试剂，其中所述第二试剂可以是用于所述第一试剂的氧化剂或其前体。此外，所述第一试剂与氧化剂之间的反应可以由检测标记物826催化，以在检测膜812中提供可检测信号。

第一和第二试剂的选择可以取决于作为第二复合物828的一部分的检测标记物826。所述第一试剂可能可以在检测标记物826存在下与所述第二试剂反应。适合的第一试剂可以包括四甲基联苯胺(TMB)、α-愈创木酯酸、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑烷-6-磺酸)、对苯二酚、苯二胺、邻联茴香胺、邻联甲苯胺(二甲基联苯胺)、6-甲氧基喹啉和3,3'-二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑或其组合。所述第二试剂可以是氧化剂或其前体，并且可以在检测标记物826存在下与所述第一试剂反应。适合用于检测包括过氧化物酶的检测标记物826的第二试剂可以包括过氧化氢或其前体。例如，所述第二试剂可以包括过氧化脲或过硼酸钠。因此，所述第一试剂可以是在过氧化物酶检测标记物826存在下与过氧化氢反应的化合物。此外，适合用于检测葡萄糖氧化酶检测标记物826的第二试剂可以包括葡萄糖或其前体。在某些优选实施方式中，用于检测过氧化物酶检测标记物826的底物830可以包括四甲基联苯胺(TMB)和过硼酸盐(PER)。在某些实施方式中，底物830可以包括单一试剂(即仅仅第一试剂)。所述试剂与检测标记物826之间的反应不需第二试剂即可提供可检测信号。这在例如碱性磷酸酶检测标记物826的检测中可能是有用的。适合用于检测碱性磷酸酶的试剂包括1-萘基-磷酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、对苯二酚二磷酸酯、酚酞磷酸酯、4-氨基苯基磷酸酯、3-吲哚酚磷酸酯和苯基磷酸酯。然而应该理解，基于所使用的特定检测标记物826，底物830可以包括本领域普通技术人员已知的其他试剂。

在任何情况下，检测膜812中的可定量反应844(例如比色反应、荧光反应、电化学反应等)可以通过一种或多种检测装置检测，其例如当所述可定量反应是颜色变化时，可以包括图8F中所示的光检测装置854。同时，一个或多个光源831提供了用于检测检测膜812(例如颜色生成膜)中的可定量反应844(例如颜色变化)的光，并且可以放置在光检测装置864附近。在比色反应的情况下，对应于光检测装置854的一个或多个光源831提供光，用于分析检测膜812(例如颜色生成膜)中的可定量反应844(例如颜色变化)。如上所述，将一个或多个光源专用于每个光检测元件是有利的，以便确保所述光检测元件上的光子通量足以获得准确的读数。在某些实施方式中，专用于特定光检测装置854的光源831具有相同的输出光谱。然而，在其他实施方式中，对应于给定光检测装置854的光源831产生不同的输出光谱。例如，所述光源可以是产生不同颜色的光的发光二极管(LED)。通常，在测定读取器中包含引导光和/或减少光散射的量的光学元件是有利的。如果需要，光检测装置854可以装配有滤光片，以只允许预定波长或波长范围的光被光检测装置854检测。这在例如光源831被装备成只提供白光用于比色分析时可能是有用的。此外，可以使用光学元件例如透镜、滤光片、快门、光纤、光导等引导或操控来自于光源831的光和将要用光检测装置854检测的光，这并不背离本公开的精神和范围。更通常来说，可用于本公开的测定读取器中的光源831没有特别限制，只要它们为光检测装置854提供适合波长和亮度的光以对从检测膜812反射的有色光做出准确读取即可。

还应该理解，如图8A-8F中所示，检测膜812可以包括一种或多种稳定剂832。此类稳定剂832可以包括新丝蛋白保护剂、甘露糖醇、海藻糖或其他糖、聚丙二醇-聚乙二醇嵌段共聚物或其他亲水-疏水嵌段共聚物或其组合。

图9示出的流程图说明了使用根据本公开的一个实施方式的测定系统进行多个测定的方法900。方法900包括步骤910，其涉及将可能含有靶分析物或感兴趣的分析物的流体样品接收在盒中的通道中。步骤920涉及将所述盒插入到测定读取器中，从而压缩所述盒以将储存在通道中的靶分析物暴露到所述盒中的测定叠层，以启动一个或多个测定反应。步骤930涉及检测与所述多个测定反应相关的一种或多种信号变化。方法900可以包括本领域普通技术人员将会理解的任何其他步骤，以通过上文详细描述的计量叠层和测定叠层的各种不同组件检测所述一种或多种信号变化。

图10示出的流程图说明了根据本公开的一个实施方式的盒的制造方法1000。所述方法包括下述步骤：获得第一分离层，向血浆分离膜施加多个包含捕获分子和磁珠的第一复合物和多个包含检测分子和检测标记物的第二复合物，并允许多个第一复合物和多个第二复合物干燥(步骤1010)；和获得第二分离层(步骤1020)。方法1000还包括下述步骤：获得检测膜，向所述检测膜施加底物，并允许所述底物干燥(步骤1030)。此外，方法1000还包括将所述第二分离层放置在所述第一分离层与检测膜之间的步骤。在这种方法中，在引入到所述盒的流体样品中存在靶分析物的情况下，所述底物与检测标记物相互作用以引发可定量反应。此外，所述可定量反应对应于所述检测膜中存在的检测分子的量，并且所述颜色检测膜中存在的检测分子的量对应于所述流体样品中存在的靶分析物的量。

尽管上文已描述了本公开的各种不同实施方式，但应该理解，它们的提出仅仅是作为实例而不是限制。同样地，各个不同图可能描绘了本公开的示例性结构体系或其他配置，这样做是为了帮助理解可以包含在本公开中的特点和功能。本公开不限于示出的示例性结构体系或配置，而是可以使用各种不同的可选结构体系或配置来实施。此外，尽管本公开在上文根据各种不同的示例性实施方式和实施方案进行了描述，但应该理解，在一个或多个单独的实施方式中描述的各种不同特点和功能的适用性不限于描述它们的具体实施方式。相反，它们可以单独地或以某种组合的形式适用于本公开的一个或多个其他实施方式，不论此类实施方式是否被描述，并且不论此类特点是否被呈现为所描述的实施方式的一部分。因此，本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施方式的限制。

除非另有定义，否则所有术语(包括技术和科学术语)均应将它们的普通和惯用含义提供给本领域普通技术人员，并且不应被限制到特殊或定制含义，除非在本文中明确地如此定义。应该注意，在描述本公开的某些特点或方面时特定术语的使用不应被当作暗示所述术语在本文中被重新定义，以限于包括与该术语相关的本公开的特点或方面的任何特定特征。除非另有明确陈述，否则在本申请、特别是在随附的权利要求书中使用的术语和短语及其变化形式应该被解释为开放性而非限制性的。作为上述情况的实例，术语“包括”应该被理解为意味着“包括但不限于”等；当在本文中使用时，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征为”同义，并且是包含性或开放性的，不排除其他未叙述的要素或方法步骤；术语“具有”应该被解释为“至少具有”；术语“包括”应该被解释为“包括但不限于”；术语“实例”被用于提供所讨论的条目的示例性情况，不是其穷举性或限制性名单；形容词例如“已知的”、“正常的”、“标准的”和类似含义的术语不应被解释为将所描述的条目限于给定时间段或对于给定时间来说可用的条目，而是应该被理解为涵盖了可能在现在或将来的任何时间可用或已知的已知、正常或标准技术；并且诸如“优选地”、“优选的”、“所需的”或“理想的”的术语和类似含义的词语的使用不应被理解为暗示某些特点对于本公开的结构或功能是关键的、必要的或甚至重要的，而是仅仅旨在强调可以在或可以不在本公开的特定实施方式中使用的可选或附加特点。同样地，用连接词“和”相连的一组条目不应被理解为要求这些条目中的每一者均出现在该组中，而是应该被理解为“和/或”，除非明确陈述不是如此。同样地，用连接词“或”相连的一组条目不应被理解为要求该组内相互排他，而是应该被理解为“和/或”，除非明确陈述不是如此。

在提供值的范围的情况下，应该理解所述范围的上限和下限以及所述上限与下限之间的每个居间值均被涵盖在所述实施方式内。

对于本文中实质上任何复数和/或单数术语的使用来说，本领域技术人员在上下文和/或应用适合的情况下可以将复数转变成单数和/或将单数转变成复数。为清晰起见，在本文中可以明确地阐述各种不同的单数/复数排列。不定冠词不排除复数。单个处理器或其他单元可以实现权利要求中叙述的几个条目的功能。某些措施仅在相互不同的从属性权利要求项中叙述这一事实，并不表明这些措施的组合不能发挥优势。权利要求项中的任何参考符号不应被解释为限制其范围。

本领域技术人员将会进一步理解，如果打算引入特定数量的权利要求陈述项，则这种意图将在权利要求中明确地陈述，并且在没有这种陈述的情况下不存在这种意图。例如，为了帮助理解，权利要求书可能包含使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”来引入权利要求陈述项。然而，此类短语的使用不应被解释为暗示由不定冠词引入的权利要求陈述项将含有此类引入的权利要求陈述项的任何特定权利要求限制到只含有一个此类陈述项的实施方式，即使在同一个权利要求包括所述介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词时(例如所述不定冠词通常应该被解释为意味着“至少一个”或“一个或多个”)；这同样适用于使用定冠词来引入权利要求陈述项的情况。此外，即使明确陈述了引入的权利要求陈述项的特定数量，本领域技术人员也将会认识到这种陈述通常应该被解释为意味着至少所述陈述的数量(例如没有其他修饰语的无修饰陈述“两个陈述项”，通常意味着至少两个陈述项或两个或更多个陈述项)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一者”的惯用语的情况下，一般来说这种结构意图在本领域技术人员将会理解所述惯用语的意义上使用(例如，“具有A、B和C中的至少一者的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一者”的惯用语的情况下，一般来说这种结构意图在本领域技术人员将会理解所述惯用语的意义上使用(例如，“具有A、B或C中的至少一者的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将会进一步理解，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个可选项的事实上任何反意连接词和/或短语均应被理解为设想了包含所述项之一、所述项中的任一者或两项的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

本说明书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应该被理解为在所有情况下均用术语“约”修饰。因此，除非指明与此相反，否则本文中阐述的数值参数是近似值，其可以根据试图获得的所需性质而变。至少，并且不试图将等同原则的应用限制到要求本申请的优先权的任何申请中的任何权利要求项的范围，每个数值参数应该根据有效数字的数目和普通的舍入方法来解释。

本申请(包括任何伴随的展示、权利要求书、摘要和附图)中公开的所有特点和/或所公开的任何方法或过程的所有步骤均可能以任何组合形式组合，除了其中至少某些此类特点和/或步骤相互排他的组合形式之外。本公开不限于任何前述实施方式的细节。本公开扩展到本说明书(包括任何权利要求书、摘要和附图)中公开的特点的任何新颖特点或任何新颖组合，或扩展到所公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖步骤或任何新颖组合。

尽管本公开的主题内容已根据其各种不同的具体示例性实施方式进行了详细描述，但每个实例是为了解释而不是限制本公开而提供。本领域技术人员在理解上述内容后，可以容易地做出此类实施方式的修改、改变和等同物。因此，本主题公开不排除包含本领域普通技术人员显而易见的对本公开主题内容的此类修改、改变和/或添加。例如，作为一个实施方式的一部分说明或描述的特点可以与另一个实施方式一起使用，以产生又一个实施方式。因此，本公开打算涵盖此类修改、改变和等同物。