中枢神经疾病治疗用组合物、中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法以及中枢神经疾病治疗用制剂的制造方法

摘要

本发明的课题在于，提供中枢神经疾病治疗用组合物、中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法以及中枢神经疾病治疗用制剂的制造及保存方法。通过一种中枢神经疾病治疗用组合物来解决上述课题，该治疗用组合物含有在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及中枢神经疾病治疗用组合物、中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法、中枢神经疾病治疗用制剂的制造方法以及中枢神经疾病治疗用制剂的保存方法。

背景技术

作为对脑梗塞、头部外伤、脊髓损伤、脑血管性痴呆、阿尔茨海默病以及帕金森病等、由脑或脊髓这种中枢神经系统的异常或损伤所引起的疾病(下面也称为“中枢神经疾病”)的治疗，进行口服给药或注射给药、或者外科治疗等。但是，这些治疗是对症疗法，针对中枢神经疾病的治疗方法尚未充分确立。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem cell，MSC)不仅能从骨髓、脂肪、滑膜、牙槽骨以及牙周膜等组织中分离，还能从胎盘、脐带血以及脐带等各种组织中分离。另外，间充质干细胞也可以离体培养增殖。进一步地，作为间充质干细胞，由于其具有不仅能分化成间充质细胞(如成骨细胞、脂肪细胞以及软骨细胞)，还能分化成非间充质细胞(如神经前体细胞以及肝细胞)的多分化能力，因此可期待作为再生医疗或细胞治疗所用的细胞的制造原料而使用。

间充质干细胞的培养是使用例如含有胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)等血清的培养基来进行的。该血清被用作促进细胞离体生长或增殖的营养源或激素等生理活性物质的供给源。但是，如果用含血清培养基来培养细胞，则存在培养细胞被混入血清中的未知病原体(病毒、病原性朊病毒等)所污染的危险性。为了避免该问题，可以举出使用不含血清的无血清培养基的方法。例如，专利文献1至3中记载了间充质干细胞的培养所用的无血清培养。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2007/080919号

专利文献2：国际公开第2011/111787号

专利文献3：国际公开第2015/016357号

发明内容

发明所要解决的课题

间充质干细胞所具有的功能多种多样，目前所利用的间充质干细胞的功能是其中一部分。因此，期待开发出针对中枢神经疾病等疾病的、使用间充质干细胞实现的新治疗方法，但关于什么样的间充质干细胞适合治疗中枢神经疾病还不清楚。

根据本发明的一个方面，提供的是适合用于治疗中枢神经疾病的、含有间充质干细胞的中枢神经疾病治疗用组合物等。

用于解决课题的手段

本发明人等关于间充质干细胞对中枢神经疾病所施加的影响进行了认真研究，在该过程中发现：相比于在血清培养基中培养的间充质干细胞，在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞对中枢神经疾病具有明显较高的有效性(如免疫调节作用、抗炎症效果、血管新生效果以及神经保护效果)，从而完成了本发明。

即，本发明的一个实施方式为如下构成。

本发明的中枢神经疾病治疗用组合物的特征在于，含有在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞。

本发明的中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法的特征在于，包括在无血清培养基中培养滑膜衍生的间充质干细胞的工序。

本发明的中枢神经疾病治疗用制剂的制造方法的特征在于，包括：冷冻保存工序，在该工序中，将在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞悬浮在冷冻用保存液中，并将所得到的悬浮液冷冻；以及使悬浮液溶解并对悬浮液进行稀释以使间充质干细胞的浓度适合施用的工序。

此外，关于构成本发明的中枢神经疾病治疗用组合物的间充质干细胞，是通过“在无血清培养基中培养”等制造工序来确定的。本发明人等就如下情况进行了试验：本发明所用的间充质干细胞与以往的间充质干细胞(具体为在血清培养基中培养的间充质干细胞)之间是否存在表达量不同的基因(即基因标志物)。其结果，明确了大量种类的基因的表达量不同，但无法确定这些基因中哪些基因在本发明所用的间充质干细胞与以往的间充质干细胞的区分上是重要的。为了确定哪些基因在本发明所用的间充质干细胞与以往的间充质干细胞的区分上是重要的，还需要大量的时间和劳力。故此，在提交申请时得出结论：无法通过结构或特性直接确定本发明的中枢神经疾病治疗用组合物中的间充质干细胞，或者存在不实际的情况。

发明的效果

能够提供适合用于治疗中枢神经疾病的、含有间充质干细胞的中枢神经疾病治疗用组合物等。

附图说明

图1是表示实施例1所涉及的评价方法的步骤的概要的图。

图2是表示实施例1中神经症状评分的测量结果的图。

图3是表示实施例1中脑梗塞病灶总面积的测量结果的图。

图4是表示实施例2所涉及的评价方法的步骤的概要的图。

图5是表示实施例2的实验例2-1中BBB评分的测量结果的图。

图6是表示实施例2的实验例2-2中BBB评分的测量结果的图。

具体实施方式

下面，将对本发明的一个实施方式进行说明，但本发明并不局限于此。本发明并不局限于下面所说明的各构成，在权利要求所示的范围内可以进行各种变更。另外，通过适当地组合分别在不同的实施方式以及实施例中公开的技术手段而获得的实施方式以及实施例也包括在本发明的技术范围内。此外，本说明书中所记载的学术文献以及专利文献均作为参考文献引用在本说明书中。另外，只要本说明书中没有特别记载，表示数值范围的“A～B”是指“A以上(包括A且比A大)且B以下(包括B且比B小)”。

在本说明书中，“无血清培养基”是指不含血清的培养基，“无血清培养”是指不使用血清进行培养。另外，在本说明书中，“间充质干细胞”是指属于间充质的细胞衍生的干细胞。另外，还包括从间充质干细胞中进一步分离具有特定性质的细胞所得到的细胞、对间充质干细胞给予细胞因子刺激等某种刺激所得到的细胞、对间充质干细胞进行基因导入所得到的细胞。例如，还包括MUSE细胞、MAPC细胞等。间充质干细胞优选为人间充质干细胞，但也可以是来源于大鼠、小鼠等非人哺乳动物的间充质干细胞。另外，滑膜大致分为包覆关节内的大腿骨或关节囊的纤维性滑膜和膝下脂肪体的脂肪性滑膜。在本说明书中，所谓“滑膜衍生的间充质干细胞”，是指纤维性滑膜衍生的间充质干细胞和脂肪性滑膜衍生的间充质干细胞两者。

另外，在本说明书中，“中枢神经疾病治疗用组合物”是指具有促进中枢神经疾病的恢复及再生的效果的药剂。作为中枢神经疾病治疗用组合物，不仅包括以保持原状态而不改变功能的方式使用间充质干细胞所得到的物质，还包括使用在特定条件下进行培养以及增殖从而提高了分泌能力以及分化能力等功能的细胞所得到的物质。

〔1.中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法〕

本发明的一个实施方式所涉及的中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法(下面也称为“本实施方式的制造方法”)，是包括在无血清培养基中培养滑膜衍生的间充质干细胞的工序的方法。

(1-1.无血清培养基)

在本实施方式的制造方法中，关于培养滑膜衍生的间充质干细胞的无血清培养基的组成并无特别限定，可以适当地使用公知的无血清培养基的组成。关于用于构成无血清培养基的基础培养基，只要是公知的哺乳动物细胞用培养基即可，并无特别限定，作为优选的基础培养基，可以举出例如Ham's F12培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基、MCDB培养基等。这些基础培养基可以单独使用，也可以混合多种使用。在一个实施方式中，用于构成无血清培养基的基础培养基优选为将MCDB与DMEM以1:1的比例混合而成的培养基。

在一个实施方式中，也可以使用通过对上述的基础培养基添加例如PDGF(Platelet-derived Growth Factor，血小板衍生生长因子)、EGF(Epidermal GrowthFactor，表皮生长因子)、TGF-β(Transforming Growth Factor-β，转化生长因子-β)、HGF(Hepatocyte GrowthFactor，肝细胞生长因子)、至少一种磷脂以及至少一种脂肪酸等所得到的无血清培养基。

通过将这样的无血清培养基用于间充质干细胞的培养中，可以防止未知病原体(病毒、病原性朊病毒等)混入无血清培养基中所导致的培养细胞污染，并且可以得到与使用含血清培养基时相同或更好的增殖促进效果。

基础培养基中PDGF的含量以终浓度计优选为0.5ng/mL～100ng/mL，更优选为10ng/mL。基础培养基中EGF的含量以终浓度计优选为0.5ng/mL～200ng/mL，更优选为20ng/mL。

在基础培养基含有TGF-β的情况下，基础培养基中TGF-β的含量以终浓度计优选为0.5ng/mL～100ng/mL，更优选为10ng/mL。在基础培养基含有HGF的情况下，基础培养基中HGF的含量以终浓度计优选为0.1ng/mL～50ng/mL，更优选为5ng/mL。

基础培养基中磷脂的总含量以终浓度计优选为0.1μg/mL～30μg/mL，更优选为10μg/mL。基础培养基中脂肪酸的总含量优选为基础培养基的重量的1/1000～1/10，更优选为1/100。

关于添加到基础培养基中的磷脂，并无特别限定，可以举出例如磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱以及磷脂酰甘油等，这些磷脂可以单独使用，也可以组合使用(如组合磷脂酸和磷脂酰胆碱)。这些磷脂可以来源于动物，也可以来源于植物。

作为添加到基础培养基中的脂肪酸，并无特别限定，可以举出例如亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕榈油酸、棕榈酸以及硬脂酸等，这些脂肪酸可以单独使用，也可以组合使用。另外，作为本实施方式所涉及的无血清培养基，除了上述的脂肪酸以外，还可以含有胆固醇。

在本说明书中，PDGF是指选自血小板衍生生长因子(PDGF)家族的生长因子，优选为PDGF-BB或PDGF-AB。另外，在本说明书中，EGF是指选自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子。

另外，无血清培养基还可以含有结缔组织生长因子(Connective Tissue GrowthFactor，CTGF)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor，VEGF)以及抗坏血酸化合物中的任一种。

在本说明书中，抗坏血酸化合物是指抗坏血酸(维生素C)或抗坏血酸2磷酸、或者与它们类似的化合物。

另外，无血清培养基也可以含有脂质抗氧化剂，作为脂质抗氧化剂，可以举出DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E)等。进一步地，无血清培养基还可以含有表面活性剂，作为表面活性剂，可以举出普兰尼克(Pluronic，注册商标)F-68或吐温(Tween，注册商标)80等。

无血清培养基还可以含有胰岛素、转铁蛋白、地塞米松、血清白蛋白以及硒酸盐。在本说明书中，胰岛素可以是胰岛素样生长因子，可以来源于天然细胞，也可以通过基因重组来制造。此外，只要无血清培养基含有地塞米松、胰岛素和血清白蛋白中的至少任一种，就起到了延长间充质干细胞的生存期间和促进间充质干细胞的增殖的效果。

另外，作为本实施方式的制造方法中的无血清培养基，也可以使用公知的无血清培养基。作为公知的无血清培养基，可以列举例如STK(注册商标)1(智再如股份有限公司制造)、STK(注册商标)2(智再如股份有限公司制造)、人间充质干细胞专用完全合成培养基试剂盒(MSCGM-CD BulletKit)(龙沙)、间充质干细胞生长培养基DXF：Mesenchymal StemCell GrowthMedium DXF(即用型)(PromoCell股份有限公司)、Stem Pro MSC SFM XenoFree(赛默飞世尔科技公司)以及MesenCult-ACF Medium Kit(STEMCELL Technologies公司)等。

(1-2.培养条件)

根据本实施方式的制造方法，在上述的无血清培养基中接种利用以往公知的方法从人等动物组织或细胞中分离出的滑膜衍生的间充质干细胞，并进行培养。作为培养条件，优选为例如相对于1mL培养基接种从1mg～500mg组织片(含间充质干细胞)分离出的滑膜衍生的间充质干细胞，培养温度优选为37℃±1℃，且5％CO

关于培养时间并无特别限定，只要是滑膜衍生的间充质干细胞达到目标浓度的培养时间即可。例如，培养时间可以为1小时～5小时、1小时～10小时、1小时～20小时、1小时～1天、1小时～10天、1小时～30天、1小时～50天、30小时～70小时、40小时～70小时、50小时～70小时。通过这样进行培养，可以高效且大量地得到免疫抑制能力得以维持或提高的滑膜衍生的间充质干细胞。

关于本实施方式的制造方法中所用的滑膜衍生的间充质干细胞，并无特别限制，但优选为原代间充质干细胞，即从人等动物组织中采取后一次也没有经过传代培养的细胞。

关于培养所用的培养容器，并无特别限定，只要是滑膜衍生的间充质干细胞可增殖的容器即可。例如，可适当地使用Falcon制造的75cm

作为适于增殖的培养容器的选择方法，可以举出例如由增殖对象细胞来选择最佳培养容器的方法。具体而言，准备多种培养容器，除了培养容器的种类不同之外，在相同的培养条件下使增殖对象细胞增殖，采用公知的方法测量培养开始2周后的细胞数，可以从细胞数较多的容器开始，按顺序判断为适于增殖对象细胞的增殖的培养容器。另外，当增殖对象细胞的增殖速度较快时，即使在培养开始经过2周之前，也可以从细胞数达到汇合状态的80％～90％的时间较短的容器开始，按顺序判断为适于增殖对象细胞的增殖的培养容器。

此外，对间充质干细胞的增殖来说，细胞粘附于培养容器是必须条件，因此，在增殖对象细胞对培养容器的粘附较弱的情况下，优选在进行无血清培养之际，使无血清培养基进一步含有细胞粘附分子。作为“细胞粘附分子”，可以举出例如纤连蛋白、骨胶原、明胶等。这些细胞粘附分子可以单独使用一种，也可以多种组合使用。

无血清培养基中细胞粘附分子的含量以终浓度计优选为1μg/mL～50μg/mL，进一步优选为5μg/mL。在一个实施方式中，当使用纤连蛋白作为细胞粘附分子时，通过添加以使无血清培养基中纤连蛋白的终浓度成为5μg/mL，能够提高增殖对象细胞对培养容器的粘附效率。

另外，在无血清培养中，可以使间充质干细胞至少传代1次。由于间充质干细胞是贴附性增殖，因此在间充质干细胞局部性不均匀增殖等情况下，通过在间充质干细胞增殖中途使间充质干细胞传代，可以改善培养条件。

关于间充质干细胞的传代方法并无特别限定，可使用以往公知的间充质干细胞的传代方法进行传代。关于在进行传代时使用不含哺乳类以及微生物来源成分的细胞剥离剂来剥离间充质干细胞，因传代后的间充质干细胞的状态良好而优选。作为“不含哺乳类以及微生物来源成分的细胞剥离剂”，可以举出例如TrypLE Select(生命技术公司)或ACCUTASE(Innovative Cell Technologies公司)。

〔2.中枢神经疾病治疗用组合物〕

本发明的一个实施方式所涉及的中枢神经疾病治疗用组合物(下面称为“本实施方式的治疗用组合物”)，含有在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞。

本实施方式的治疗用组合物所含的滑膜衍生的间充质干细胞，是在〔1.中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法〕一栏中所说明的、在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞。即，本实施方式的治疗用组合物所含的间充质干细胞，是在上述的中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法中所增殖的滑膜衍生的间充质干细胞。

本实施方式的治疗用组合物具有促进中枢神经疾病的恢复及再生的效果。已知间充质干细胞根据骨髓、脂肪以及脐带等来源组织的不同，分化能力以及分泌因子的表达也不同。本发明人等发现：相比于在含血清培养基中培养的间充质干细胞，在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞具有较好的免疫调节作用、抗炎症效果、血管新生效果以及神经保护效果。因此，可以认为针对中枢神经疾病起到了使用在含血清培养基中培养的间充质干细胞时无法实现的、明显较好(换言之，在临床现场可利用的程度较高)的治疗效果。关于目的在于使用间充质干细胞治疗中枢神经疾病的研究，已经进行了很多，但在这样的研究中，通常多使用中枢神经系统的间充质干细胞(如骨髓等)。但是，本发明人等的新见解如下：通过在无血清培养基中培养被认为与中枢神经系统关系较小的、衍生自运动器官的结构体、即滑膜的间充质干细胞，起到了显著的促进中枢神经疾病的恢复及再生的效果。

另外，作为本实施方式的治疗用组合物，由于含有无血清培养的滑膜衍生的间充质干细胞，因此不存在将混入血清中的未知病原体(病毒、病原性朊病毒等)施用于患者体内的危险性。另外，血清非常昂贵，而且由于是天然产品，所以每批次的成分都会产生差异，细胞增殖效果容易产生偏差，但本发明未使用血清，所以不会产生这样的问题。进一步地，由于无需为了从培养结束后的间充质干细胞除去血清来源蛋白质等而进行纯化，因此可谋求作业的效率化。

关于本实施方式的治疗用组合物可发挥功效的中枢神经疾病，并无特别限定。作为这样的中枢神经疾病，可以举出例如脑梗塞、脑出血、头部外伤、脊髓损伤、阿尔茨海默病、脑血管性痴呆、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症以及肌萎缩性侧索硬化症等。

作为本实施方式的治疗用组合物，可以是由在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞制成的药剂，也可以含有除了在无血清培养基中培养的间充质干细胞以外的药学上可接受的添加剂(如缓冲剂、抗氧化剂、增稠剂以及赋形剂)。

上述添加剂的量并无特别限定，例如可以是本实施方式的治疗用组合物的0.01重量％～50重量％、0.01重量％～40重量％、0.01重量％～30重量％、0.01重量％～20重量％、0.01重量％～10重量％或0.01重量％～1重量％。

本实施方式的治疗用组合物所含的间充质干细胞的数量并无特别限定，可根据施用对象的体重适当地设定。例如，可以是1次施用1×10

作为上述治疗用组合物的施用方法，可以举出例如静脉注射、动脉注射以及局部(脊髓(如脊髓腔)、肌肉、关节、脑室等)注射。这些施用方法中，只要是使用导管对局部附近的动脉施用的方法，都起到了能减少施用所需的细胞数的有利效果。

本实施方式的治疗用组合物的施用对象并无特别限定。例如，当本实施方式的治疗用组合物含有人滑膜衍生的间充质干细胞时，上述施用对象可以是人，也可以是人以外的哺乳动物(牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、小鼠、大鼠等)。另外，当本实施方式的治疗用组合物含有人以外的哺乳动物滑膜衍生的间充质干细胞时，上述施用对象可以是该哺乳动物，也可以是人等除了该哺乳动物以外的物种。也就是说，本实施方式的治疗用组合物的间充质干细胞可以移植到异种动物，也可以移植到同种动物。向同种动物的移植可以是自体移植，也可以是异体移植。

本实施方式的治疗用组合物的施用量并无特别限定，可以是针对施用对象的每1kg体重所施用的间充质干细胞的数量成为1×10

〔3.中枢神经疾病治疗用制剂的制造方法〕

本发明的一个实施方式所涉及的中枢神经疾病治疗用制剂的制造方法(本实施方式的治疗用制剂的制造方法)，包括：冷冻保存工序，在该工序中，将在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞悬浮在冷冻用保存液中，并将所得到的悬浮液冷冻；以及使所述悬浮液溶解并对所述悬浮液进行稀释以使所述间充质干细胞的浓度适合施用的工序。

这里，所谓“中枢神经疾病治疗用制剂”，是指对具有促进中枢神经疾病的恢复及再生的效果的药剂进行制剂化以达到适合施用的状态所得到的制剂。作为中枢神经疾病治疗用制剂，不仅包括以保持原状态而不改变功能的方式对间充质干细胞进行制剂化所得到的制剂，还包括对在特定条件下进行培养以及增殖从而提高了分化能力等功能的细胞进行制剂化所得到的制剂。

本实施方式的治疗用制剂的制造方法中的滑膜衍生的间充质干细胞，是在〔1.中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法〕一栏中所说明的、在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞。即，本实施方式的治疗用制剂的制造方法中的滑膜衍生的间充质干细胞，是在上述的中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法中所增殖的滑膜衍生的间充质干细胞。

本实施方式的治疗用制剂的制造方法包括冷冻保存工序，在该工序中，将在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞悬浮在冷冻用保存液中，并将所得到的悬浮液冷冻。

在本实施方式的治疗用制剂的制造方法中，对上述的用于冻结滑膜衍生的间充质干细胞的保存液的组成并无特别限定，可适当地使用公知的保存液的组成。例如，保存液可以含有注射液、冷冻保护剂、白蛋白等。

作为注射液，可以列举碳酸氢钠林格液为例，但并不局限于此。作为碳酸氢钠林格液，可使用商业上可获得的物质，例如可适当地使用Bicarbon(ビカーボン，注册商标)注射液(エイワイファーマ株式会社)。注射液可以单独使用一种，也可以组合多种使用。

作为在冷冻及解冻过程中抑制冰晶在细胞内生长的冷冻保护剂，可以举出DMSO(二甲基亚砜)等，但并不局限于此。本发明的一个实施方式所涉及的保存液的冷冻保护剂的量相对于保存液总量更优选为0.5％～50％(v/v)。

另外，为了在冷冻及解冻过程中更好地保护细胞，本发明的一个实施方式所涉及的保存液也可以含有白蛋白。添加白蛋白时的浓度相对于保存液总量更优选为0.25％～25％(v/v)。

在冷冻保存工序中，将滑膜衍生的间充质干细胞悬浮在上述的保存液中。作为悬浮方法，例如，优选为在可冷冻保存的容器中放入保存液，并将间充质干细胞悬浮在该保存液中。

关于悬浮时的保存液与间充质干细胞之间的量的比例，只要是可冷冻保存的量即可，并无特别限定，例如为50万个细胞/mL～1000万个细胞/mL左右。只要是这样的量，就可以使间充质干细胞充分地悬浮在保存液中。

对将滑膜衍生的间充质干细胞悬浮在保存液中所得到的悬浮液进行冷冻。冷冻温度只要适当地设定为将间充质干细胞冷冻的温度即可，可以举出例如-80℃以下或-196℃以下。在-80℃以下进行冷冻时，例如可使用以往公知的实例等，在-196℃以下进行冷冻时，可使用液氮。

另外，本实施方式的治疗用制剂的制造方法包括使上述的悬浮液溶解并对该悬浮液进行稀释以使间充质干细胞的浓度适合施用的工序。

在本实施方式的治疗用制剂的制造方法中，作为溶解方法，只要在细胞不损伤的温度下溶解即可，优选为10℃以上且45℃以下，更优选为20℃以上且40℃以下，进一步优选35℃以上且40℃以下。例如，更优选使用35℃～38℃的热水浴进行溶解。因其迅速且细胞的回收率、存活率更高。

另外，用生理盐水或林格液等稀释液对溶解后的悬浮液进行稀释。作为稀释液，并无特别限定，只要能维持滑膜衍生的间充质干细胞的功能即可。稀释浓度适当地调制为间充质干细胞的浓度适合施用即可，例如，可调制为间充质干细胞的数量为50万个细胞/mL～300万个细胞/mL左右。

本发明的一个实施方式可以为如下构成。

〔1〕一种中枢神经疾病治疗用组合物，其含有在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞。

〔2〕根据〔1〕所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其中，所述中枢神经疾病为脑梗塞、脑出血、头部外伤以及脊髓损伤中的至少任一种。

〔3〕根据〔1〕所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其中，所述中枢神经疾病为阿尔茨海默病、脑血管性痴呆、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症以及肌萎缩性侧索硬化症中的至少任一种。

〔4〕一种中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法，其包括在无血清培养基中培养滑膜衍生的间充质干细胞的工序。

〔5〕一种中枢神经疾病治疗用制剂的制造方法，其包括：冷冻保存工序，在该工序中，将在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞悬浮在冷冻用保存液中，并将所得到的悬浮液冷冻；以及使所述悬浮液溶解并对所述悬浮液进行稀释以使所述间充质干细胞的浓度适合施用的工序。

实施例

〔实施例1〕

(滑膜衍生的间充质干细胞对脑梗塞的有效性评价)

关于通过在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞的移植来改善脑梗塞的后遗症进行了研究。

图1表示本实施例所涉及的评价方法的步骤的概要。如图1所示，在本实施例中，制成脑梗塞模型大鼠，当脑缺血再灌注后立即施用间充质干细胞(MSC)，经过1天后，进行行为学评价以及组织学评价。

采用公知的方法(如移植法或胶原酶法)，在无血清培养基STK(注册商标)1(智再如股份有限公司)或含10％牛血清的DMEM培养基(Sigma-Aldorich公司)中从人滑膜或骨髓组织中分离出间充质干细胞并进行培养。将在无血清培养基STK(注册商标)1中分离出的滑膜的间充质干细胞接种到无血清培养基STK(注册商标)2(智再如股份有限公司)中，将在含10％牛血清的DMEM培养基中分离出的滑膜或骨髓的间充质干细胞接种到相同的培养基中，并分别在37℃、5％CO

接着，作为中枢神经疾病的一例，制成脑梗塞模型大鼠(SPHPR-710-2大鼠脑梗塞模型(小泉模型))。向大鼠的内颈动脉插入栓子，通过闭塞左中大脑动脉进行脑缺血处理。脑缺血120分钟后拔除栓子，使血流再流通，从而制成脑梗塞模型大鼠。

在脑缺血再灌注后，作为实施例(A)，立即以0.8mL/min的速度，用时1分钟，通过脑梗塞模型大鼠的尾静脉施用使用无血清培养基培养的滑膜衍生的间充质干细胞，由此制成组(A-G2)。另外，作为比较例(B)，立即以0.8mL/min的速度，用时1分钟，通过脑梗塞模型大鼠的尾静脉分别施用使用含10％牛血清的DMEM培养基培养的滑膜衍生或骨髓衍生间充质干细胞，由此制成组(B-G2或B-G3)。此时，关于实施例(A)以及比较例(B)，作为阴性对照(NC)，将不含间充质干细胞的Solulact(ソルラクト，注册商标)注射液(泰尔茂株式会社)以与上述同样的方式施用至脑梗塞模型大鼠的尾静脉，由此制成组(A-G1或B-G1)。另外，关于实施例(A)以及比较例(B)，作为阳性对照(PC)，将0.5mg/kg显示出使脑梗塞病灶缩小的FK-506(他克莫司，安斯泰来制药有限公司)施用至脑梗塞模型大鼠的尾静脉，由此制成组(A-G3或B-G4)。在施用间充质干细胞1天后，分别对实施例(A)以及比较例(B)的脑梗塞模型大鼠组进行行为学评价以及组织学评价。

(行为学评价)

对于实施例(A)以及比较例(B)的脑梗塞模型大鼠组，观察神经症状，并进行行为学评价。关于(1)前肢麻痹、(2)后肢麻痹、(3)旋转运动、(4)体侧面抵抗性以及(5)一般状态这5个项目，按照个体以0～12(病情：数值越高越差)进行评分，并将5个项目的合计作为神经症状评分进行评价。

具体而言，(1)关于前肢麻痹，观察抓着大鼠的尾巴从地板抬起10cm左右时其右前肢的弯曲程度，将不存在弯曲左右差的情况计为0分，将存在轻度弯曲的情况计为1分，将存在90度左右弯曲的情况计为2分，将不能运动的情况计为3分。同样地，(2)关于后肢麻痹，观察安静时拉扯大鼠后肢时其后肢复原的力，将左右后肢不存在肌力差的情况计为0分，将左右后肢存在肌力差的情况计为1分，将成为不自然的状态但因刺激而复原的情况计为2分，将成为不自然的状态且对刺激无反应的情况计为3分。(3)关于旋转运动，观察抓着大鼠的尾巴使其前肢贴地的状态下的旋转运动，将向前方移动的情况计为0分，将主要向前方移动但向右旋转的情况计为1分，将主要向右转旋转但也向前方移动的情况计为2分，将仅向右旋转的情况计为3分。(4)关于体侧面抵抗性，观察在安静时分别从左右单侧推大鼠的体侧面时的抵抗性，将不存在左右差的情况计为0分，将身体姿势未变形但对来自左侧的刺激较弱的情况计为1分，将因来自左侧的刺激而后肢难以维持的情况计为2分，将因来自左侧的刺激而倒下的情况计为3分。(5)关于一般状态，观察安静状态下大鼠的身体姿势，将与正常动物之间不存在差别的情况计为0分，将左肢伸出体外的情况计为1分，将向右侧倾斜的情况计为2分，将向右侧倾斜相当严重的情况计为3分。

图2表示神经症状评分的测量结果。此外，神经症状评分的统计分析是使用Steeltest进行的，在任何分析中都将阴性对照作为对照组，显著性水平设为双侧5％。在图2的测量结果中，关于统计学方面的显著性差异，表示为“＊：P＜0.05”和“＊＊：P＜0.01”。

根据图2的测量结果，对大鼠的神经症状进行了统计分析后，可以确认：在阳性对照(A-G3以及B-G4)中，相对于阴性对照(A-G1以及B-G1)，神经症状评分在统计学方面得到了显著性改善(P＜0.05)。因此，表明神经症状评分的条件可在行为学方面对脑梗塞的恢复进行评价。可以确认：在施用了在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞的A-G2中，相对于阴性对照，神经症状评分在统计学方面得到了显著性改善(P＜0.01)。另一方面，可以确认：在施用了在含血清培养基中培养的滑膜衍生或骨髓衍生的间充质干细胞的B-G2或B-G3中，相对于阴性对照，在统计学方面未出现显著性差异。因此，通过行为学评价表明：相比于使用在含血清培养基中培养的间充质干细胞的情况，在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞改善了脑梗塞的症状。

(组织学评价)

接着，对于实施例(A)以及比较例(B)的脑梗塞模型大鼠组，测量脑梗塞病灶的体积，并进行组织学评价。观察神经症状后，取出全脑，使用大鼠用脑模具(Brain Matrices)制成切片。将各切片在含有2％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride，TTC)的生理盐水中染色，并用扫描仪获取脑梗塞病灶体积定量用图像。针对该图像，通过OsiriX version 8.0.2(Pixmeo SARL)将TTC非染色部分标记为脑梗塞病灶，并测量出面积。对大脑皮层以及基底核进行面积测量。由各截面的脑梗塞病灶的面积与截面厚度(2mm)的积算出大脑皮层以及基底核的总脑梗塞病灶(mm

图3表示总脑梗塞病灶面积的测量结果。此外，总脑梗塞病灶的统计分析是使用Dunnett’s test进行的，在任何分析中都将阴性对照作为对照组，显著性水平设为双侧5％。在图3的测量结果中，关于统计学方面的显著性差异，表示为“＊：P＜0.05”和“＊＊＊：P＜0.001”。

根据图3的测量结果，对大鼠的总脑梗塞病灶进行统计分析后，可以确认：在施用了在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞的A-G2中，相对于阴性对照，神经症状评分在统计学方面得到了显著性改善(P＜0.001)。还表明与阳性对照相比，总脑梗塞病灶也变小了。另一方面，可以确认：在施用了在含血清培养基中培养的滑膜衍生或骨髓衍生的间充质干细胞的B-G2或B-G3中，相对于阴性对照，在统计学方面未出现显著性差异。因此，通过组织学评价也表明：相比于使用在含血清培养基中培养的间充质干细胞的情况，在使用在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞的情况下，脑梗塞病灶的大小减少了。

行为学评价以及组织学评价的结果表明：在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞针对中枢神经疾病起到了使用在含血清培养基中培养的间充质干细胞时无法实现的、明显较好(换言之，在临床现场可利用的程度较高)的效果。

〔实施例2〕

(滑膜衍生的间充质干细胞对脊髓损伤的有效性评价)

关于通过在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞的移植来改善脊髓损伤的后遗症进行了研究。

图4表示本实施例所涉及的评价方法的步骤的概要。如图4所示，在本实施例中，制成脊髓损伤模型大鼠，脊髓损伤后第2天施用间充质干细胞(MSC)，脊髓损伤后第4周(第28天)之前，对后肢运动功能进行评价。

(实验例2-1)

以与〔实施例1〕相同的方式培养滑膜衍生的间充质干细胞。接着，作为中枢神经疾病的一例，使用MASCIS Impactor并通过50mm重锤坠落法制成脊髓损伤模型大鼠。

作为实验例2-1，在脊髓损伤的第2天(24小时后)，用时30秒以上通过脊髓损伤模型大鼠的尾静脉缓慢施用1mL使用无血清培养基培养的滑膜衍生的间充质干细胞，由此制成组(细胞组，样本数(n＝3))。此时，作为阴性对照(NC)，将不含间充质干细胞的Solulact(ソルラクト，注册商标)注射液以与上述相同的方式施用至脊髓损伤模型大鼠的尾静脉，由此制成组(溶剂组，样本数(n＝3))。在脊髓损伤的第2天、7天后、21天后以及28天后，分别使用BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)标准(参照Basso et al.,"A sensitive andreliablelocomotorrating scale for open field testing in rats."J.Neurotrauma 1995；12:1-21.)对脊髓损伤模型大鼠组进行后肢运动功能评价。

(后肢运动功能评价)

图5表示后肢运动功能评价的测量结果。此外，BBB评分的统计分析是使用克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)检验法进行分析的，就统计学方面的显著性进行了研究，将危险率不足5％设为存在显著性差异。

根据图5的测量结果，可以确认：在施用了在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞的细胞组中，相对于溶剂组，BBB评分倾向于改善。因此，在后肢运动功能评价中，给出了在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞改善了脊髓损伤的症状的启示。

(实验例2-2)

以与〔实施例1〕相同的方式培养滑膜衍生的间充质干细胞。接着，作为中枢神经疾病的一例，使用不同于实验例2-1的大鼠，使用MASCIS Impactor并通过50mm重锤坠落法制成脊髓损伤模型大鼠。

作为实验例2-2，在脊髓损伤的第2天(24小时后)，用时30秒以上通过脊髓损伤模型大鼠的尾静脉缓慢施用1mL使用无血清培养基培养的滑膜衍生的间充质干细胞，由此制成组(细胞组，样本数(n＝6))。此时，作为阴性对照，将不含间充质干细胞的Solulact(ソルラクト，注册商标)注射液以与上述相同的方式施用至脊髓损伤模型大鼠的尾静脉，由此制成组(溶剂组，样本数(n＝6))。在脊髓损伤的第2天、14天后以及28天后，分别使用BBB标准对脊髓损伤模型大鼠组(细胞组以及溶剂组)进行后肢运动功能评价。

(后肢运动功能评价)

图6表示后肢运动功能评价的测量结果。此外，BBB评分的统计分析是使用t检验法进行分析的，并对统计学方面的显著性进行了研究。将p值不足0.10的情况设为存在显著性差异。在图6的测量结果中，统计学方面的显著性倾向表示为“

根据图6的测量结果，可以确认：在施用了在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞的细胞组中，相对于作为阴性对照的溶剂组，BBB评分倾向于显著改善。因此，在后肢运动功能评价中，再次给出了在无血清培养基中培养的滑膜衍生的间充质干细胞改善了脊髓损伤的症状的启示。

产业上的可利用性

本发明能够提供使用间充质干细胞实现更安全且利用价值更高的中枢神经疾病治疗用组合物，因此可适用于以使用间充质干细胞实现中枢神经疾病的恢复及再生为目的的医疗中。