黑水虻提取物在制备水产动物寄生虫杀虫剂中的应用

摘要

本发明公开了黑水虻提取物在制备水产动物寄生虫杀虫剂中的应用，涉及生物技术领域。具体地，本发明提供以下(1)或(2)所述的物质在制备水产动物寄生虫杀虫剂中的应用：(1)黑水虻提取物；(2)一种萜类化合物，结构式为所述水产动物寄生虫的生长过程中合成丙酸酯连接酶。本发明研究发现黑水虻提取物可以靶向抑制丙酸酯连接酶，进而有效杀灭能够合成丙酸酯连接酶的水产动物寄生虫。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及黑水虻提取物在制备水产动物寄生虫杀虫剂中的应用。

背景技术

小瓜虫病是一种危害严重的寄生虫病，几乎可以感染所有淡水鱼类，在流行季节感染小瓜虫后其死亡率最高可达100％，故而其也有鱼类“癌症”之称，容易给淡水鱼类养殖业造成巨大的经济损失。对小瓜虫具有治疗特效的药物为硝酸亚汞，但由于其具有较强的致癌作用，2019年12月，其被列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单。因此，目前人们主要利用甲醛、敌百虫、硫酸铜等药物进行小瓜虫病的防控，虽有一定的功效，但长期使用带来的是环境污染、药物残留和耐药性等一系列问题，这些也成为当前食品安全和水产品出口的绿色贸易壁垒问题，寻找新型、高效、低毒的杀灭小瓜虫的替代药物已成为一项迫在眉睫的任务，这对保障水产养殖业健康发展以及食品安全等方面具有重要的社会和经济意义。

黑水虻又称光亮扁角水虻，是双翅目水虻科扁角水虻属的一种昆虫，在全球热带和亚热带的大部分地区都有分布。因其能够取食禽畜粪便和生活垃圾，生产高价值的动物蛋白饲料，故而广泛应用于垃圾处理和饲料制作中，此外，黑水虻的幼虫还可以用于治疗烧伤和创后的伤口愈合，具有抗炎和镇痛功能，是一种医疗资源和药用昆虫。近年来，科研工作者对黑水虻的成分也开展了一定的研究，发现其具有一定的抗菌功能，以及抑制肿瘤细胞增殖的活性，但其在杀虫方面的研究还未有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供黑水虻提取物在制备水产动物寄生虫杀虫剂中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现黑水虻提取物可以靶向抑制丙酸酯连接酶，进而有效杀灭能够合成丙酸酯连接酶的水产动物寄生虫。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供以下(1)或(2)所述的物质在制备水产动物寄生虫杀虫剂中的应用：

(1)黑水虻提取物；

(2)一种萜类化合物，结构式为：

所述水产动物寄生虫的生长过程中合成丙酸酯连接酶。

进一步地，所述水产动物寄生虫为小瓜虫。

本发明还提供以下(1)或(2)所述的物质在制备丙酸酯连接酶抑制剂中的应用：

(1)黑水虻提取物；

(2)一种萜类化合物，结构式为：

本发明还提供一种丙酸酯连接酶抑制剂，活性成分包含以下(1)或(2)所述的物质：

(1)黑水虻提取物；

(2)一种萜类化合物，结构式为：

本发明还提供一种水产动物寄生虫杀虫剂，活性成分包含以下(1)或(2)所述的物质：

(1)黑水虻提取物；

(2)一种萜类化合物，结构式为：

所述水产动物寄生虫的生长过程中合成丙酸酯连接酶。

进一步地，所述水产动物寄生虫为小瓜虫。

进一步地，所述水产动物寄生虫杀虫剂还包括药学上可接受的辅料。

进一步地，所述辅料包括表面活性剂和溶解剂。

进一步地，所述表面活性剂为吐温-20或吐温-80。

进一步地，所述溶解剂为二甲基亚砜。

小瓜虫属原生动物门、纤毛虫纲、凹口科、小瓜虫属，其生活史主要包括掠食体、滋养体和包囊这三个阶段，小瓜虫寄生鱼体的阶段为滋养体，滋养体在鱼体寄生成熟后会自动脱离鱼体掉落水中，之后数小时内会形成包囊，包囊沉入水底后会进行分裂繁殖，分裂后的虫体从包囊中游出，侵入鱼体后再次成为滋养体。掠食体和包囊均不在鱼体，杀死包囊和掠食体是切断小瓜虫传播的有效方法，但包囊因具有厚厚的囊壁故而很难被杀死。本发明研究发现，丙酸酯连接酶是小瓜虫包囊阶段一个特有的蛋白，也是一个可用的药物作用靶点，因此研究筛选作用于该靶点的药物是一种切实可行的方案。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以黑水虻为研究对象，利用提取分离方法对其作用于丙酸酯连接酶的活性成分进行追踪分离，进而研发出一种靶向于丙酸酯连接酶的杀虫剂，该杀虫剂的活性成分包括cyclonerodiol oxide。经体外试验证明，该杀虫剂对小瓜虫掠食体和小瓜虫包囊具有较强的杀灭作用；体内杀虫试验证明，该杀虫剂对感染有小瓜虫的试验鱼具有较强的保护作用。

本发明提供的杀虫剂对小瓜虫的杀灭效果显著，且来源于生物，对水产动物毒性小。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1的PCR产物；其中，A为扩增产物，B为表达产物；

图2为不同黑水虻提取物对小瓜虫丙酸酯连接酶活性的影响；

图3为E组分(Ea、Eb、Ec、Ed、Ee和Ef)对小瓜虫丙酸酯连接酶活性的影响；

图4为Ec组分(Ec1、Ec2、Ec3、Ec4和Ec5)对小瓜虫丙酸酯连接酶活性的影响；

图5为单体化合物Cyclonerodiol oxide对小瓜虫丙酸酯连接酶的活性影响；

图6为实施例2制备得到的杀虫剂对小瓜虫包囊的体外杀灭作用结果；其中，A为使用杀虫剂后的小瓜虫包囊，B为正常的小瓜虫包囊(分裂状态)；

图7为实施例2制备得到的杀虫剂对金鱼的毒性实验结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中使用的pET30a载体购自优宝生物。

实施例1

1材料与方法

1.1试验鱼

随机选取10尾严重感染小瓜虫的金鱼，取全鳃镜检观察统计鳃上小瓜虫数量，确定试验鱼小瓜虫感染率为100％，每尾鱼平均感染小瓜虫约200个(鳃加尾鳍部分)。

1.2小瓜虫丙酸酯连接酶克隆表达和纯化

因小瓜虫密码子的偏好性(TAA和TGA密码子编码谷氨酰胺，而这是其他生物的终止子)，故而参考已知丙酸酯连接酶的基因序列(NCBI Reference Sequence:XP_004029931.1)对其进行人工合成，合成时，本发明设计目的基因的DNA片段，其中所有的谷氨酰胺密码子都被通用谷氨酰胺密码子CAA或CAG取代，由上海生物工程有限公司合成。并在目的基因片段的两端加入限制性酶切位点BamHI和XholI，通过此二酶切位点将人工合成的丙酸酯连接酶片段克隆至pET30a载体(C端携带His标签便于后期纯化及检测)。主要过程简述如下：

载体构建反应体系如表1。

表1载体构建反应体系

94℃5min；32Cycle(94℃30sec、55℃30sec、68℃20sec)；10℃hold on。PCR扩增产物经PCR产物纯化试剂盒回收后，BamH/Xhol酶切。37℃酶切，回收后与同样酶切的pET-30a载体连接。反应体系如表2。

表2载体连接反应体系

构建好的质粒通过酶切与测序验证其正确。将经过鉴定的质粒10μL加入到制备好的大肠杆菌感受态细胞里混匀，冰上静置5min后，2000V进行电转化，加入1mL恢复培养基，30℃静置1h，涂布含1.5μg/mL Emr的LB平板，30℃培养，挑选单菌落(单克隆)进行菌落PCR进行鉴定。鉴定正确的单菌落接种到LB中进行富集、扩大培养，再利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，收集菌液、裂解、冰浴超声离心取上清，Ni-NTA层析柱，利用不同浓度梯度的咪唑溶液进行梯度洗脱，收集纯化蛋白，并利用TEA缓冲液进行透析过夜，经蛋白浓度测定后，-80℃保存备用。

1.3黑水虻提取物及单体化合物对小瓜虫丙酸酯连接酶活性的影响

精确称取经干燥浓缩后的黑水虻，配制成不同的浓度梯度，加入到1.2中经纯化透析的重组丙酸酯连接酶中(0.01mg/mL)，在温度为37℃的条件下反应，并测定小瓜虫丙酸酯连接酶的活性，进而确定药物对丙酸酯连接酶活性的作用。

1.4黑水虻提取物的制备

利用极性梯度法将干燥的黑水虻分别用石油醚、乙酸乙酯、氯仿和乙醇进行分别提取，每个溶剂分别提取3次，合并滤液并经减压浓缩干燥，干燥后的提取物分别按照1.3的方法测定其对小瓜虫丙酸酯连接酶活性的影响，其中黑水虻乙醇提取物的抑制酶活性最强，故而对黑水虻乙醇提取物进行进一步的分离，取干燥的乙醇提取物上硅胶柱，并利用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(9:1至1:9)，收集各馏分(Ea、Eb、Ec、Ed、Ee和Ef)并进行酶活性测定，其中Ec部分(5:5部分)部分活性最强，继续利用乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱，共获得5个馏分(Ec1、Ec2、Ec3、Ec4和Ec5)，酶活结果显示Ec4(3:7)馏分抑制小瓜虫丙酸酯连接酶活性最强，对该馏分利用中压制备柱进行分离，分离条件为(C18柱；波长：254nm；柱温30℃；洗脱剂：乙腈：甲醇＝2:3)，收集单一峰型的馏分，并对各馏分进行酶活性测定，结果显示出峰时间在5-8min的组分抑制酶活性最强。

1.5单体化合物化合物的结构鉴定

对获得的具有最强抑制酶活性的单体化合物利用质谱、核磁氢谱和核磁碳谱等波谱分析手段进行结构鉴定。

2结果

2.1小瓜虫丙酸酯连接酶克隆表达和纯化

根据设计的引物进行扩增，获得小瓜虫丙酸酯连接酶基因，其扩增产物如图1。由图可知：获得丙酸酯连接酶的大小为650bp。与预计大小一致。

2.2黑水虻提取物及单体化合物对小瓜虫丙酸酯连接酶活性的影响

黑水虻不同提取物对小瓜虫丙酸酯连接酶的活性影响结果如图2，由图2可知：不同浓度的提取物对酶活性均有一定的抑制作用，且存在一定的浓度梯度依赖关系，其中对酶活性抑制作用最强的是黑水虻的乙醇提取物，其在浓度为50.0mg/L时，对酶活性的抑制率可达74.1％。缓冲液组和空白对照组丙酸酯连接酶的活性分别为121.5U/mg和121.4U/mg。

黑水虻乙醇提取物不同石油醚-乙酸乙酯洗脱部位对小瓜虫丙酸酯连接酶的活性影响结果如图3。由图3可知：不同洗脱部位对酶活性均有一定的抑制作用，且存在一定的浓度梯度依赖关系，其中对酶活性抑制作用最强的是黑水虻的乙醇提取物的石油醚-乙酸乙酯(5:5)洗脱部位，其在浓度为30.0mg/L时，对酶活性的抑制率可达85.2％。缓冲液组和空白对照组丙酸酯连接酶的活性分别为120.9U/mg和121.1U/mg。

Ec洗脱馏分对小瓜虫丙酸酯连接酶的活性影响结果如图4。由图4可知：不同洗脱部位对酶活性均有一定的抑制作用，其中对Ec4酶活性抑制作用最强，其在浓度为20.0mg/L时，对酶活性的抑制率可达86.5％。缓冲液组和空白对照组丙酸酯连接酶的活性分别为121.2U/mg和121.1U/mg。

单体化合物(出峰时间5-8min)对小瓜虫丙酸酯连接酶的活性影响结果如图5。由图5可知：单体化合物对酶活性均有较强的抑制作用，其在浓度为1.0mg/L时，对酶活性的抑制率可达91.8％。

2.3单体化合物的结构鉴定

单体化合物的相关波谱数据如下：

m.p.：221～223℃；HR-ESI-MS:257.2120[M+H]

最终确定该化合物为Cyclonerodiol oxide，结构式为：

实施例2

取cyclonerodiol oxide 30.0g，在30.0g二甲基亚砜中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-2010.0g，加入20.0g的水混合搅拌均匀，得到杀虫剂。

实施例3

称取cyclonerodiol oxide 20.0g，在20.0g二甲基亚砜中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-80 5.0g，加入55.0g的水混合搅拌均匀，得到杀虫剂。

实施例4

称取cyclonerodiol oxide 25.0g，在25.0g二甲基亚砜中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-20 8.0g，加入42.0g的水混合搅拌均匀，得到杀虫剂。

实施例5

称取cyclonerodiol oxide 28.0g，在28.0g二甲基亚砜中搅拌溶解，称取表面活性剂吐温-80 10.0g，加入34.0g的水混合搅拌均匀，得到杀虫剂。

实施例6

杀小瓜虫药效试验：

1方法

1.1体外杀虫试验

将严重感染小瓜虫的金鱼放入烧杯中，待小瓜虫游出后，用吸管将成熟小瓜虫收集放入平皿中，一部分虫体用于小瓜虫掠食体的培养，一部分用于包囊的收集。

1.1.1体外杀小瓜虫掠食体的药效试验

试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入2mL不同浓度的实施例2制备的杀虫剂(以cyclonerodiol oxide的浓度计，0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/L)和约100个小瓜虫掠食体，于用药后15min、1h、2h、3h、4h镜检观察一次，4h后统计各孔的小瓜虫死亡率。试验设置DMSO溶剂组和充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。

小瓜虫死亡判断标准：虫体纤毛不运动，胞质不流动，胞膜破裂，细胞核破碎。

1.1.2体外杀小瓜虫包囊虫的药效试验

试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入2mL不同浓度的实施例2制备的杀虫剂(0.1、0.2、0.4、0.6和0.8mg/L)和30个小瓜虫包囊，于用药后4h镜检观察一次，24h后统计各孔的小瓜虫包囊死亡率。试验设置充分暴气自然水对照组和溶剂组(DMSO)，每组试验重复三次。

小瓜虫包囊死亡判断标准：包囊未分裂或包囊未孵出掠食体。

1.2体内杀灭小瓜虫的药效试验

体内药效试验根据实验室前期构建的方法进行，具体简述如下：在一个体积为1m

试验第5天时，每个浓度组取出3尾金鱼，并放入烧杯中，按照体外杀虫试验的方法收集包囊，并观察包囊的死亡和分裂情况。

试验第10天，将所有组内的金鱼取出，全鳃制片、镜检，统计每尾金鱼在鳃部小瓜虫存活数量以及鳍条存活的虫体数量，计算平均杀虫率。

杀虫率(％)＝(对照组的小瓜虫平均存活数量－试验组的小瓜虫平均存活数量)/对照组的小瓜虫平均存活数量×100％；

鱼平均死亡率(％)＝(投放的鱼数量-镜检时的鱼存活数量)/投放的鱼数量×100％。

1.3对金鱼的急性毒性试验

先进行药物的毒性预实验，初步确定药物的浓度范围。试验在体积为80L的玻璃缸中进行，每个缸中放置健康的金鱼10尾，并加入浓度为20.0、30.0、40.0，50.0，60.0，70.0和80.0mg/L杀虫剂(实施例2制备得到的杀虫剂)，96h后统计金鱼死亡数量，并计算cyclonerodiol oxide对金鱼的半致死浓度。每个浓度组做3个重复，试验设置一个对照组(预实验结果显示最高浓度组溶剂对金鱼没有毒性)。

1.4数理统计

试验数据用SPSS16.0统计学软件进行处理，所有参数均用均数±标准差(X±SD)表示。

2结果

2.1体外杀小瓜虫试验

本发明制备的杀虫剂对小瓜虫掠食体具有较强的杀灭作用，并且随着浓度的增加其杀灭作用逐渐增强，他对小瓜虫掠食体15min、1h、2h、3h和4h半数致死有效浓度(EC

本发明制备的杀虫剂对小瓜虫包囊的体外杀灭作用见图6，其灭杀结果见表3。由表1可知：本发明制备的杀虫剂在浓度为0.8mg/L时，包囊未分裂，也未孵出掠食体，其对包囊的杀虫率为100％。其浓度为0.6、0.4和0.2mg/L时对包囊的杀灭率分别为90.0％、60.0％和33.3％，而0.1mg/L浓度组对包囊作用效果最差，杀灭率仅为13.3％。

由图6可以看出，正常掠食体细胞结构完整，包膜清晰、可见，而用药组细胞结构不完整，包囊破裂。

表3本发明制备的杀虫剂对小瓜虫包囊的杀灭率及对孵化的影响(6h)

注：不同字母表示差异显著(p＜0.05)

2.2体内杀虫试验

本发明制备的杀虫剂对寄生于金鱼上的体内杀虫试验结果如表4。由表4可知：本发明制备的杀虫剂对小瓜虫具有较强的杀灭作用，使用药物后，金鱼体表和鳃上的小瓜虫数量明显减少，且其掉落后的包囊的掠食体孵化率明显减少。当其浓度为0.8mg/L时，金鱼的死亡率为16.7％，其鳃上和鳍条的小瓜虫数为33.3±10.0。而对照组的金鱼死亡率为100％，鳃和鳍条上小瓜虫的数量为214.6±25.5。结果表明本发明制备的杀虫剂对感染有小瓜虫的试验鱼具有较强的保护作用。研究结果发现，最高浓度DMSO及表面活性剂组小瓜虫的杀灭效果和死亡率无明显变化，说明本发明中的表面活性剂仅具有溶解作用，其起杀虫作用的物质是Cyclonerodiol oxide。

表4本发明制备的杀虫剂对小瓜虫的体内杀虫效果

注：不同字母表示差异显著(p＜0.05)

2.3对金鱼的急性毒性试验

本发明制备的杀虫剂对金鱼的毒性结果如图7。浓度为20.0mg/L的杀虫剂用药96h后金鱼死亡率为0，且金鱼活性正常，也未见异常反应。浓度为80.0mg/L的杀虫剂用药2h后金鱼即出现呼吸急促，跳跃等异常反应，96h后金鱼全部死亡。本发明制备的杀虫剂对金鱼的96h LD

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。