一种利用金铁锁毛状根诱导产生花青素的方法

摘要

本发明涉及植物组织培养技术领域，公开了一种利用金铁锁毛状根诱导产生花青素的方法，以金铁锁无菌苗叶片为外植体，以MS为基本培养基，在添加6‑BA 1.0mg/L+IBA 1.5mg/L的条件下诱导产生愈伤组织和毛状根，挑选生长良好的毛状根置于White液体培养基中继代增殖，添加6‑BA 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L，能在短时间内提取获得含量较高的天然花青素。本发明诱导的花青素是一种保健价值高、色泽鲜艳的可用于食品、医药行业的天然色素。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用金铁锁毛状根诱导产生花青素的方法。

背景技术

金铁锁(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)属于石竹科金铁锁属多年生草本植物，又名独定子、蜈蚣七等，其根入药，具有散淤止痛、排毒止血等功能。其1991年作为稀有濒危物种被列入《中国植物红皮书》第一册，1999年作为国家二级保护植物被列入《国家重点保护野生植物名录(第一批)》中。主要分布于我国贵州、四川、云南等地，在海拔2000～3800m的砾石山坡或石灰质岩石缝中生长良好。其在民间药用历史较长，已研制的中成药剂有跌打止痛膏、百灵草散、金骨莲胶囊等。金铁锁野生植株多呈紫绿色，花瓣为紫红色，即金铁锁植株的细胞有合成天然花青素的能力。

目前国内市场所用的花青素多为合成色素，存在许多未知风险，而从植物中提取的天然色素具有安全、无毒及一定药理作用等优势，可在食品、化妆、医药等方面应用。但花青素原材料的获取受环境因素的影响，而利用植物组织培养技术生产花青素成为一种新的有效途径。因此，加强药食兼用植物资源的开发利用，通过诱导毛状根，开发金铁锁植物的天然色素用于食品加工、工业染色等前景广阔。

现有的技术通常经无菌苗诱导愈伤组织或者诱导毛状根产生愈伤组织后进行花青素的积累，这些过程存在以下问题：一是过程较为繁琐，用时长。二是毛状根的诱导需要与Ar·A4发根农杆菌共培养后才能诱导产生，增加了成本。三是愈伤组织组织细胞较为疏松，不管固体培养还是液体培养容易分散，不利于后期色素提取。

发明内容

本发明意在提供一种利用金铁锁毛状根诱导产生花青素的方法，已解决现有技术中通过诱导愈伤组织产生花青素时存在的工艺复杂、成本高的问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种利用金铁锁毛状根诱导产生花青素的方法，以金铁锁无菌苗叶片作为外植体培养获得愈伤组织和毛状根，而后在液体培养基中添加复合植物生长调节剂对毛状根进行继代培养，诱导产生花青素。

优选的，作为一种改进，一种利用金铁锁毛状根诱导产生花青素的方法，包括如下步骤：

步骤一、愈伤组织和毛状根的诱导：以金铁锁无菌苗叶片作为外植体，在固体培养基中添加复合植物生长调节剂I进行培养，诱导获得愈伤组织和毛状根；

步骤二、毛状根的花青素诱导：将步骤一得到的毛状根进行液体继代培养，并向液体培养基内添加复合植物生长调节剂II，诱导产生花青素；

步骤三、金铁锁毛状根花青素的提取：利用提取剂提取花青素。

优选的，作为一种改进，步骤一中，培养基为MS固体培养基，复合生长调节剂I为6-BA0～2.0mg/L与IBA 0～2.0mg/L的混合物。

优选的，作为一种改进，步骤一中，培养条件为温度20～24℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。

优选的，作为一种改进，步骤二中，复合植物生长调节剂II为6-BA、NAA、2,4-D中的至少一种，6-BA添加量为0～1.0mg/L，NAA添加量为0～1.0mg/L，2,4-D添加量为0～1.0mg/L；培养基为液体培养基。

优选的，作为一种改进，步骤二中，继代培养为振荡培养，继代培养的条件为温度22～26℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx，摇床转速为80～100r/min。

优选的，作为一种改进，步骤三中，提取剂为盐酸-甲醇提取剂，盐酸与甲醇的料液比为1:10～40g/mL。

优选的，作为一种改进，步骤三中，花青素提取条件为提取剂浓度为1～3％，提取时间2～10h，提取温度4～60℃。

优选的，作为一种改进，步骤一中，复合植物生长调节剂I为6-BA 1.0mg/L与IBA1.5mg/L的混合物，培养温度为24℃，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d。

优选的，作为一种改进，步骤二中，继代培养的培养基为White基本培养基，White基本培养基内添加有复合植物生长调节剂II，复合植物生长调节剂II为6-BA 0.5mg/L与NAA1.0mg/L的混合物。

本技术方案的原理及有益效果在于：本技术方案中，在研发初期研究金铁锁毛状根皂苷类物质的又到提取，在研发过程中，偶然发现在激素组合试验时能够诱导产生色素，且相比较愈伤组织的色素诱导速度要更快。基于此，发明人针对现有技术中在通过诱导愈伤组织产生花青素时存在的工艺复杂、成本高的问题，对花青素的诱导方法进行了优化，尝试利用上述的基础研究发现的规律，通过调节植物生长调节剂的使用浓度及组合配比，使得本方案不需要经过发根农杆菌的诱导可直接产生愈伤组织和毛状根。而后挑选毛状根进行液体继代培养，通过改变培养基的类型及植物生长调节剂的种类即可诱导和积累花青素。由此可减少金铁锁花青素诱导步骤及时间，方法简单，提取方便，且能够达到降本的目的。在对金铁锁毛状根诱导花青素进行技术优化过程中，植物生长调节剂的组成是研究的一大难点，发明人曾尝试TDZ，但是诱导效果不好，没能诱导出紫红色色素。最终经过反复研究，确定了本方案的植物生长调节剂的TDZ，但是诱导效果不好，没能诱导出紫红色色素。通过反复研究，确定了本申请的生长调节剂组合。而后继续对生长调节剂的添加量进行了优化研究，最终形成本技术方案。

本技术方案的有益效果在于：

(1)花青素是金铁锁毛状根生物合成的天然色素，为黄酮类物质，具有一定的生理活性。本技术方案中，以金铁锁无菌苗叶片为外植体，在诱导产生愈伤组织和毛状根后，再选择毛状根进行花青素的诱导积累，方法简单，且避免了人工合成色素对身体健康的伤害，为天然花青素的获得开辟了新途径，可用于食品、医药等行业，以满足人们对天然花青素的需求。

(2)本技术方案诱导的金铁锁毛状根未使用发根农杆菌浸泡诱导，而是通过调节植物生长调节剂等直接诱导产生，减少了共培养、鉴定、除菌等步骤，程序简便。

(3)本技术方案中，步骤一和步骤二存在明显的协同加强作用，在利用金铁锁无菌苗叶片诱导毛状根时可先诱导出含有少量色素的毛状根，后期液体继代培养色素积累更容易。通过研究发现在液体培养时，单独使用一种植物生长调节剂的效果没有组合使用的效果好。

(4)本技术方案金铁锁毛状根利用液体震荡培养，与固体培养相比，缩短了培养时间，且方便获取，色素提取方便，利于加工。

(5)本技术方案首次利用毛状根诱导积累花青素，填补了金铁锁毛状根直接诱导花青素的技术空白，在领域内具有重要意义。

附图说明

图1为不同植物生长调节剂对金铁锁诱导毛状根的影响。

图2为不同植物生长调节剂对金铁锁毛状根色素积累的影响。

图3为同种植物生长调节剂对金铁锁愈伤组织及毛状根花青素诱导积累的影响。

图4为植物生长调节剂对金铁锁毛状根诱导的影响结果图。

图5为植物生长调节剂对花青素积累的影响结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施方式所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

本技术方案中的材料金铁锁(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)采自贵州省务川仡佬族苗族自治县、威宁彝族回族苗族自治县。

名词释义：

6-BA：6-苄氨基嘌呤；

IBA：吲哚丁酸；

NAA：萘乙酸；

2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸。

方案总述：

一种利用金铁锁毛状根诱导产生花青素的方法，包括如下步骤：

步骤一、愈伤组织和毛状根的诱导：以金铁锁无菌苗的叶片作为外植体，选择MS培养基，并向MS培养基内添加6-BA 0～2.0mg/L和IBA 0～2.0mg/L进行培养，在光照0～2500lx条件下进行培养，诱导获得白色愈伤组织和毛状根。

步骤二、毛状根的花青素诱导：挑选步骤一的毛状根进行液体继代培养，以White为基本培养基，并向基本培养基内添加6-BA 0～1.0mg/L+NAA 0～1.0mg/L+2,4-D 0～1.0mg/L进行培养振荡培养，摇床转速为80～100r/min，诱导产生花青素。

步骤三、金铁锁毛状根花青素的提取：选择积累花青素后的毛状根，以盐酸-甲醇为提取剂，提取花青素。

实施例1

一种利用金铁锁毛状根诱导产生花青素的方法，包括如下步骤：

步骤一、愈伤组织和毛状根的诱导：以金铁锁无菌苗的叶片作为外植体，选择MS培养基，并向MS培养基内添加6-BA 1.0mg/L和IBA 1.5mg/L，每个培养瓶接种3个叶片，在温度24℃、光照强度1500lx和光照时间12h/d的条件下培养，培养7d左右即可获得白色愈伤组织，10d左右可诱导获得毛状根。

步骤二、毛状根的花青素诱导：挑选步骤一的毛状根中颜色白，生长良好的进行液体继代培养，以White为基本培养基，并向基本培养基内添加6-BA 0.5mg/L和NAA 1.0mg/L+2,4-D 0mg/L，在温度24℃，光照强度1500lx和照时间12h/d条件下培养，7d后毛状根诱导产生花青素，20d后花青素明显积累。

步骤三、金铁锁毛状根花青素的提取：从步骤二中选择相同培养条件下花青素积累的毛状根，先用滤纸吸干其表面水分，平均称取1g毛状根，在料液比1:10(g/mL)，以2％盐酸-甲醇为提取剂，提取时间10h及提取温度40℃条件下进行提取，并在紫外分光光度计波长范围为n＝529nm下扫描，测定吸光值，重复3次，计算色素提取率，色素提取率能达到0.91％。植物生长调节剂氟金铁锁毛状根的又到及花青素的积累影响对比图如图4、图5所示。

实验例一植物生长调节剂对金铁锁毛状根诱导的影响

为探究不同植物生长调节剂对金铁锁毛状根诱导的影响，选择6-BA、NAA、IBA、2，4-D进行单因素试验，设置每种植物生长调节剂浓度为0.5、1.0、1.5和2.0mg/L，每组进行三次重复实验，分析其对毛状根诱导的影响，结果如图1所示。另外，在实施例1的基础上，控制其他条件固定不变的条件下，以步骤一中6-BA与IBA的添加量为变量，探究不同植物生长调节剂组合对金铁锁毛状根诱导的影响，统计毛状根的数量及颜色，每组进行三次重复实验，实验设计及实验结果如表1所示。

表1 6-BA与IBA组合对金铁锁毛状根诱导的影响

注：表中不同小写字母表示两者具有差异显著性(P＜0.05)

从图1数据可知，不同植物生长调节剂单独使用时对毛状根的影响呈现单峰趋势，低浓度时毛状根诱导效果较差，随着浓度升高毛状根诱导数量增加，但浓度达到2.0mg/L时诱导量下降，说明过高过低浓度对毛状根的诱导有抑制作用。四种植物生长调节剂中诱导效果IBA＞NAA＞6-BA＞2,4-D，但毛状根最高诱导量只有10根，单一种类植物生长调节剂诱导效果并不理想。

从表1数据可知，诱导金铁锁毛状根较好较多的植物生长调节物质组合为6-BA1.0mg/L+IBA 1.5mg/L，与其他组合差异显著。且结合图1可知，诱导毛状根效果好的为IBA，浓度适中为1.5mg/L，随着浓度的增加，会对毛状根的诱导产生抑制，其中图1左为叶片诱导的愈伤组织，无毛状根产生(6-BA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L)；图1右为叶片诱导产生白色愈伤组织及毛状根(6-BA 1.0mg/L+IBA 1.5mg/L)。因此，以MS为基础培养基，添加6-BA 1.0mg/L、IBA 1.5mg/L两种植物生长调节剂，在温度为24℃，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d的条件下培养能诱导大量毛状根产生，为后续毛状根积累花青素提供大量原材料。

实验例二不同培养方式及植物生长调节剂组合对金铁锁毛状根花青素积累的影响

在实施例1的基础上，控制其他条件不变的条件下，探究不同植物生长调节剂对金铁锁毛状根诱导的影响，选择6-BA、NAA、2，4-D、TDZ进行单因素试验，设置每种植物生长调节剂浓度为0、0.5、1.0和1.5mg/L，每组进行三次重复实验，分析其对毛状根色素诱导积累的影响，结果如图2所示。从图2数据可知，6-BA、NAA和TDZ三种植物生长调节剂单独使用时对毛状根色素的诱导积累呈现先上升后下降的趋势，浓度在1.0mg/L时效果较好，花青素提取率最高为0.45％，且NAA＞6-BA＞TDZ。其中2,4-D诱导积累色素时随着浓度的升高花青素提取率降低，因此选择6-BA、NAA两种效果较好的植物生长调节剂和2,4-D进行进一步组合探究，致力于研究出更好的花青素积累配比。

调整步骤二中培养方式及植物生长调节剂的组合，探究不同培养方式(固体培养、半固体培养和液体培养)及植物生长调节剂组合对金铁锁毛状根花青素积累的影响，每组进行三次重复实验，统计花青素的提取率，结果如表2所示。

提取率计算公式如下：

式中：A为色素在529nm波长处的吸光度；V为定容体积；N为比色时的稀释倍数；98.2为色素在529nm波长处的消光系数；M为毛状根的质量。

表2金铁锁毛状根花青素积累条件优化

注：表中不同小写字母表示两者具有差异显著性(P＜0.05)。

从表2数据可知，固体培养的毛状根难以挑选，花青素积累少，提取率达到0.41％，半固体培养的毛状根生长较差，花青素提取率0.35％，而液体培养的毛状根容易挑取，花青素积累多，提取率能达到1.11％。最佳的花青素诱导条件为：在液体培养条件下，添加植物生长调节剂6-BA 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+2,4-D 0mg/L，以White为基础培养基，在温度为24℃，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d的条件下培养。结合图2分析发现，未添加2,4-D的培养基比添加2,4-D的培养基诱导花青素的效果好，其中图2左为液体培养的毛状根，无花青素积累(6-BA 0mg/L+NAA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L)；图2右为液体培养的毛状根，积累花青素(6-BA 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+2,4-D 0mg/L)。液体培养效果＞固体培养＞半固体培养，可能是因为液体震荡培养使得毛状根能充分吸收养分并快速稀释毛状根排出的次生代谢产物，而半固体培养会影响毛状根的呼吸作用、细胞渗透压等等从而降低毛状根的生长能力及花青素的诱导能力。

实验例三植物生长调节剂对金铁锁愈伤组织及毛状根花青素积累的影响

目前现有的金铁锁诱导花青素技术主要通过愈伤组织进行色素积累，在实施例1的基础上，控制其他条件不变的条件下，探究同种植物生长调节剂对金铁锁愈伤组织及毛状根色素诱导积累的影响，以MS为基本培养基，添加6-BA 0.5mg/L和NAA 1.0mg/L，分别接种金铁锁愈伤组织和毛状根进行培养，每组进行三次重复实验，分析其花青素诱导积累的情况，结果如图3所示。

结果表明：在同样培养条件下，通过添加相同植物生长调节剂诱导愈伤组织和毛状根中的色素，最后分别提取愈伤组织和毛状根中的花青素发现毛状根中的色素提取率高于愈伤组织中的色素提取率，说明本发明有较好的花青素诱导优势。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。