一种克氏原螯虾甘露聚糖结合凝集素基因敲除突变体的构建方法

摘要

本发明公开了一种克氏原螯虾甘露聚糖结合凝集素基因敲除突变体的构建方法，属于生物技术领域。该方法包括：1）筛选获得可高度特异识别克氏原螯虾基因组中甘露聚糖结合凝集素基因的sgRNA；2）进行性腺注射，在自然交配获得的克氏原螯虾中验证CRISPR/Cas9产生甘露聚糖结合凝集素基因移码突变的能力；3）筛选到含移码突变甘露聚糖结合凝集素基因的克氏原螯虾创建者的子一代，并以子一代为亲本自交，获得去除甘露聚糖结合凝集素功能的突变的甘露聚糖结合凝集素基因的纯合突变基因的新品系。采用该方法可成功地对克氏原螯虾甘露聚糖结合凝集素基因进行定向突变，使该基因的正常功能丧失，最后获得的甘露聚糖结合凝集素基因突变的纯合子新品系克氏原螯虾缺失该基因功能，成为天然免疫缺陷模型。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种定点去除克氏原螯虾基因组中甘露聚糖结合凝集素基因的方法。

背景技术

甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin，MBL）作为是生物体重要的天然免疫因子，在抗感染机制中发挥重要的作用，可以通过Ca

CRISPR/Cas9是一种RNA导向的DNA内切酶，可应用于不同动物的基因组改造。

为获得甘露聚糖结合凝集素基因缺陷克氏原螯虾模型，本发明设计了一种定向敲除克氏原螯虾基因组中甘露聚糖结合凝集素基因的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种克氏原螯虾甘露聚糖结合凝集素基因敲除突变体的构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种克氏原螯虾甘露聚糖结合凝集素基因敲除突变体的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，设计高度特异识别克氏原螯虾基因组中甘露聚糖结合凝集素基因的sgRNA；

步骤2，将sgRNA与SpCas9 mRNA导入克氏原螯虾精巢或卵巢，通过自然交配，获得克氏原螯虾受精卵，将获得的克氏原螯虾受精卵培养至幼虾或次成虾；

步骤3，对步骤2得到的幼虾或次成虾进行鉴定，确定含移码突变甘露聚糖结合凝集素基因的克氏原螯虾创建者的基因型；

步骤4，筛选到含移码突变甘露聚糖结合凝集素基因的克氏原螯虾创建者的子一代，并以子一代为亲本自交，获得去除甘露聚糖结合凝集素基因功能的突变的甘露聚糖结合凝集素基因的纯合突变基因的新品系克氏原螯虾。

进一步地，步骤S1中sgRNA靶位点序列为Seq ID No.1至Seq ID No. 4所示序列。

进一步地，步骤2中sgRNA与SpCas9 mRNA的质量比为1：3。

采用本发明的方法可成功地对克氏原螯虾甘露聚糖结合凝集素基因进行定向突变，使该基因的正常功能丧失，最后获得的甘露聚糖结合凝集素基因突变的纯合子新品系克氏原螯虾缺失该基因功能，成为天然免疫缺陷模型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南（第三版）》（Sambrook等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

定向敲除克氏原螯虾基因组中MBL基因的方法

1、识别克氏原螯虾MBL基因的特异性sgRNA的设计

（1）利用可自由使用的公开软件设计识别克氏原螯虾MBL基因的特异性sgRNA。sgRNA靶位点序列为Seq ID No.1至Seq ID No. 4所示。

Seq ID No.1

sgRNA1靶位点

tcgttagtgaagccttaccaagg

Seq ID No.2

sgRNA2靶位点

tgggaacttcaattccatattgg

Seq ID No.3

sgRNA3靶位点

gcagtgttatttacgtaattggg

Seq ID No.4

sgRNA4靶位点

gtgaaagaacccatgcaggaggg

（2）使用聚合酶链式反应，使用序列如Seq ID No.5至Seq ID No. 8的正向引物与序列如Seq ID No. 9的反向引物，扩增含有如SeqID No.10序列的质粒，制备编码Seq IDNo.1至Seq ID No. 4的sgRNA的DNA模板。

Seq ID No.5

sgRNA1制备引物F

TAATACGACTCACTATAtcgttagtgaagccttaccaGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

Seq ID No.6

sgRNA2制备引物F

TAATACGACTCACTATAtgggaacttcaattccatatGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

Seq ID No.7

sgRNA3制备引物F

TAATACGACTCACTATAgcagtgttatttacgtaattGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

Seq ID No.8

sgRNA4制备引物F

TAATACGACTCACTATAgtgaaagaacccatgcaggaGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

Seq ID No.9

sgRNA反向引物

AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC

Seq ID No.10

gRNA骨架模板

gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc

（3）使用T7体外转录试剂盒，将上述模板转录为Seq ID No.1至Seq ID No. 4的sgRNA。

（4）将编码序列为Seq ID No.11的SpCas9 mRNA与上述sgRNA混合，随后与Lipo3000等试剂混合，形成注射液（2.5μg RNA – 其中SpCas9与sgRNA质量比为3:1，12μLLipo3000，PBS补充至50μL，用于1-2只克氏原螯虾个体）。

Seq ID No.11

SpCas9 mRNA

auggacuauaaggaccacgacggagacuacaaggaucaugauauugauuacaaagacgaugacgauaagauggccccaaagaagaagcggaaggucgguauccacggagucccagcagccgacaagaaguacagcaucggccuggacaucggcaccaacucugugggcugggccgugaucaccgacgaguacaaggugcccagcaagaaauucaaggugcugggcaacaccgaccggcacagcaucaagaagaaccugaucggagcccugcuguucgacagcggcgaaacagccgaggccacccggcugaagagaaccgccagaagaagauacaccagacggaagaaccggaucugcuaucugcaagagaucuucagcaacgagauggccaagguggacgacagcuucuuccacagacuggaagaguccuuccugguggaagaggauaagaagcacgagcggcaccccaucuucggcaacaucguggacgagguggccuaccacgagaaguaccccaccaucuaccaccugagaaagaaacugguggacagcaccgacaaggccgaccugcggcugaucuaucuggcccuggcccacaugaucaaguuccggggccacuuccugaucgagggcgaccugaaccccgacaacagcgacguggacaagcuguucauccagcuggugcagaccuacaaccagcuguucgaggaaaaccccaucaacgccagcggcguggacgccaaggccauccugucugccagacugagcaagagcagacggcuggaaaaucugaucgcccagcugcccggcgagaagaagaauggccuguucggaaaccugauugcccugagccugggccugacccccaacuucaagagcaacuucgaccuggccgaggaugccaaacugcagcugagcaaggacaccuacgacgacgaccuggacaaccugcuggcccagaucggcgaccaguacgccgaccuguuucuggccgccaagaaccuguccgacgccauccugcugagcgacauccugagagugaacaccgagaucaccaaggccccccugagcgccucuaugaucaagagauacgacgagcaccaccaggaccugacccugcugaaagcucucgugcggcagcagcugccugagaaguacaaagagauuuucuucgaccagagcaagaacggcuacgccggcuacauugacggcggagccagccaggaagaguucuacaaguucaucaagcccauccuggaaaagauggacggcaccgaggaacugcucgugaagcugaacagagaggaccugcugcggaagcagcggaccuucgacaacggcagcaucccccaccagauccaccugggagagcugcacgccauucugcggcggcaggaagauuuuuacccauuccugaaggacaaccgggaaaagaucgagaagauccugaccuuccgcauccccuacuacgugggcccucuggccaggggaaacagcagauucgccuggaugaccagaaagagcgaggaaaccaucacccccuggaacuucgaggaagugguggacaagggcgcuuccgcccagagcuucaucgagcggaugaccaacuucgauaagaaccugcccaacgagaaggugcugcccaagcacagccugcuguacgaguacuucaccguguauaacgagcugaccaaagugaaauacgugaccgagggaaugagaaagcccgccuuccugagcggcgagcagaaaaaggccaucguggaccugcuguucaagaccaaccggaaagugaccgugaagcagcugaaagaggacuacuucaagaaaaucgagugcuucgacuccguggaaaucuccggcguggaagaucgguucaacgccucccugggcacauaccacgaucugcugaaaauuaucaaggacaaggacuuccuggacaaugaggaaaacgaggacauucuggaagauaucgugcugacccugacacuguuugaggacagagagaugaucgaggaacggcugaaaaccuaugcccaccuguucgacgacaaagugaugaagcagcugaagcggcggagauacaccggcuggggcaggcugagccggaagcugaucaacggcauccgggacaagcaguccggcaagacaauccuggauuuccugaaguccgacggcuucgccaacagaaacuucaugcagcugauccacgacgacagccugaccuuuaaagaggacauccagaaagcccagguguccggccagggcgauagccugcacgagcacauugccaaucuggccggcagccccgccauuaagaagggcauccugcagacagugaaggugguggacgagcucgugaaagugaugggccggcacaagcccgagaacaucgugaucgaaauggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaaugaagcggaucgaagagggcaucaaagagcugggcagccagauccugaaagaacaccccguggaaaacacccagcugcagaacgagaagcuguaccuguacuaccugcagaaugggcgggauauguacguggaccaggaacuggacaucaaccggcuguccgacuacgauguggaccauaucgugccucagagcuuucugaaggacgacuccaucgacaacaaggugcugaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgugcccuccgaagaggucgugaagaagaugaagaacuacuggcggcagcugcugaacgccaagcugauuacccagagaaaguucgacaaucugaccaaggccgagagaggcggccugagcgaacuggauaaggccggcuucaucaagagacagcugguggaaacccggcagaucacaaagcacguggcacagauccuggacucccggaugaacacuaaguacgacgagaaugacaagcugauccgggaagugaaagugaucacccugaaguccaagcugguguccgauuuccggaaggauuuccaguuuuacaaagugcgcgagaucaacaacuaccaccacgcccacgacgccuaccugaacgccgucgugggaaccgcccugaucaaaaaguacccuaagcuggaaagcgaguucguguacggcgacuacaagguguacgacgugcggaagaugaucgccaagagcgagcaggaaaucggcaaggcuaccgccaaguacuucuucuacagcaacaucaugaacuuuuucaagaccgagauuacccuggccaacggcgagauccggaagcggccucugaucgagacaaacggcgaaaccggggagaucgugugggauaagggccgggauuuugccaccgugcggaaagugcugagcaugccccaagugaauaucgugaaaaagaccgaggugcagacaggcggcuucagcaaagagucuauccugcccaagaggaacagcgauaagcugaucgccagaaagaaggacugggacccuaagaaguacggcggcuucgacagccccaccguggccuauucugugcuggugguggccaaaguggaaaagggcaaguccaagaaacugaagagugugaaagagcugcuggggaucaccaucauggaaagaagcagcuucgagaagaaucccaucgacuuucuggaagccaagggcuacaaagaagugaaaaaggaccugaucaucaagcugccuaaguacucccuguucgagcuggaaaacggccggaagagaaugcuggccucugccggcgaacugcagaagggaaacgaacuggcccugcccuccaaauaugugaacuuccuguaccuggccagccacuaugagaagcugaagggcucccccgaggauaaugagcagaaacagcuguuuguggaacagcacaagcacuaccuggacgagaucaucgagcagaucagcgaguucuccaagagagugauccuggccgacgcuaaucuggacaaagugcuguccgccuacaacaagcaccgggauaagcccaucagagagcaggccgagaauaucauccaccuguuuacccugaccaaucugggagccccugccgccuucaaguacuuugacaccaccaucgaccggaagagguacaccagcaccaaagaggugcuggacgccacccugauccaccagagcaucaccggccuguacgagacacggaucgaccugucucagcugggaggcgacaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaaguaa

2、注射克氏原螯虾性腺，验证CRISPR/Cas9产生MBL基因移码突变的能力

（1）利用显微注射技术将注射液注射到卵巢发育状态III期的雌性克氏原螯虾卵巢中，或在5-8月或10月注射到雄性克氏原螯虾精巢中。

（2）通过自然交配，获得克氏原螯虾受精卵

（3）将获得的克氏原螯虾受精卵培养至幼虾或次成虾，剪取部分组织样品，提取总RNA，逆转录制备cDNA。

（4）使用Seq ID No.12与Seq ID No.13引物扩增上述cDNA。

Seq ID No.12

mbl鉴定引物F

gagtcgtggggacctgctac

Seq ID No.13

mbl鉴定引物R

cctcaagtatgtcatcatctg

（5）将上述PCR产物经柱层析纯化后连接到pGEM-T载体上，将5μL连接产物加入50μL DH5α感受态细胞，在冰上静置30分钟，在42摄氏度热激90秒，在冰上静置2分钟后涂布到含有100ng/ml氨苄青霉素的培养基平板上，在37摄氏度培养14小时后随机挑取克隆进行PCR鉴定（条件同上），每个个体随机选取100个含目标片段的克隆进行测序鉴定，与Seq IDNo.14进行对比，确定克氏原螯虾基因组MBL基因被CRISPR Cas9切割后形成的突变方式，存在突变的个体即为MBL突变体创建者。

Seq ID No.14

克氏原螯虾mbl基因cDNA序列

gagtcgtggg gacctgctac tggacatggg gctcctcagg tctgccctcc ttatctcctt

cttctccttc atctacacag aagaatggaa cacccacgag tacatgatcc gggagcactc

gttagtgaag ccttaccaag gtttgggaac ttcaattcca tattgggatt ttcttggaag

caccattgtg accaacaatt acattagact aacagcagat gtgcaaagtt tgcgtggagc

aatatggaat aaagtgcagt gttatttacg taattgggaa atgcacattc aatttaaagt

tcacggccat ggaaaggact tgtttggtga tggctttgcc ttctggtacg tgaaagaacc

catgcaggag ggtgatgtgt ttggtagcaa ggacttcttc accgggttag cagtaatcat

ggacacctac agtaatcata acggaccaca caatcatggt catccctaca tctcggccat

gatcaacaat ggcactctcc actacgacca tgaccgtgat ggcactcaca cccagttgtc

atcaggttgc gtttccaagt ttaggaatct ggagcatgat acatacgttt ccatcaagta

tgtccacgac acattaacag tgtcaactga tatagacaac aggcaaatat tcaaggaatg

ttttactgtg gccggggtta agctgccctt gggatatttt cttggcgtgt ctgctgctac

aggtgatctc agtgacgcac atgacatcat ttccctcaag atgtatgatc tgtcaacccc

cagatgatga catacttgag g

3、筛选含移码突变MBL基因的克氏原螯虾创建者的子一代，并以子一代为亲本自交，获得去除MBL功能的突变的MBL基因的纯合突变基因的新品系；

（1）将携带移码突变MBL基因的克氏原螯虾创建者饲养至性成熟，每个个体分别与野生克氏原螯虾通过人工授精方式进行自然交配获得受精卵。将受精卵在室温下培养至成虾，按常规方法提取附肢RNA并逆转录为cDNA作为PCR模板，然后用2中所描述的方法进行鉴定，确定每个个体的基因型。含突变的MBL基因的子一代即为携带突变MBL基因的杂合子克氏原螯虾。

（2）将携带突变等位基因杂合子的克氏原螯虾饲养至性成熟，然后相互交配。对得到的后代饲养至两个月后进行基因型鉴定，在基因组中含两份拷贝的个体即为突变MBL基因纯合子的克氏原螯虾。将此基因型的克氏原螯虾饲养至性成熟，纯合子相互交配可获得稳定遗传的含突变MBL基因的新品系克氏原螯虾。