用于治疗庞贝氏病的基因治疗构建体、药物组合物和方法

摘要

本发明涉及一种组成型启动子CAR‑Mut。本发明还涉及包含所述启动子及与之功能性连接的GAA编码核苷酸序列的表达构建体和重组载体及宿主细胞、和使用所述重组载体向哺乳动物细胞或个体递送GAA编码多核苷酸、和治疗庞贝氏病或酸性葡萄糖苷酶缺陷受试者的组合物和方法。

说明书

技术领域

本发明涉及基因治疗，更具体地涉及用于庞贝氏病基因治疗的构建体、以及包含所述构建体的药物组合物和治疗庞贝氏病的方法。

背景技术

基因治疗

首个获得授权的基因治疗研究诞生于1989年，经历了三十多年的发展之后，基因治疗获得了里程碑式的突破，进入了一个新时代。在治疗以前无法治愈的遗传疾病方面，基因治疗取得了长足的进步。目前已有几种基因治疗药物获得FDA/EMA的批准被用于临床。针对神经肌肉疾病和血友病等更多遗传疾病的基因治疗药品也有望在将来获得更多的批准许可。此外，基因治疗现在正被广泛用于肿瘤、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病的治疗研究中。

基因治疗药物的关键是采用适宜的载体材料将外源基因传递至受体细胞中，并通过转录表达达到疾病治疗的目的。目前常用的基因治疗载体主要包括病毒类和非病毒类两种。病毒载体凭借其天然特性可以高效的将外源基因导入受体细胞而被广泛应用，其中腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)载体具有良好的安全性，以及对多种靶组织的高效转导，成为体内基因治疗的最活跃的载体之一。

启动子作为基因工程表达载体中的重要元件，在很大程度上可以决定克隆基因的表达效率和组织表达谱。因此，在基因治疗领域中，为了满足基因治疗需求，常常需要基于具体的治疗目的，构建符合需求的新启动子。同时，在该领域也客观地存在着提供多样的启动子选择的需求。

作为转基因递送工具的病毒载体的基因容量是有限的。传统的单链AAV病毒载体(ssAAV)的情况下，总包装容量大约为4.8kb。在双链自互补型AAV病毒载体(scAAV)的情况下，总包装容量大约为一半，约2.5kb。因此，在兼顾基因构建体大小的情况下，选择适宜的载体基因元件组合，以保证目的基因以合适的水平在期望的组织(或多种组织)中表达，就显得尤为重要。

在一些情况下，转基因在所有或大多数细胞类型中的组成型表达是被期望的，例如，当所治疗的疾病或疾患累及多种组织时。本领域已经提出了一些组成型启动子，例如人延伸因子1、巨细胞病毒启动子CMV、鸡肌动蛋白启动子CBA、以及包含CMV增强子的合成CAG启动子等。然而，组成型启动子的使用效果常会因具体应用的疾病或疾患组织、施用方式等因素的影响而表现各异，并且在一些情况下会带来较高的药物免疫原性和/或动物毒性，从而限制基因治疗药物构建体的应用。因此，在基因治疗中，持续需要提供适于更有效转导疾病相关组织且更安全的基因治疗构建体。

庞贝氏病

庞贝氏病又称为酸性α-葡萄糖苷酶缺乏症或糖原贮积症Ⅱ型(GSDⅡ)，是一种系统性溶酶体贮积病，主要累及肌肉，也影响中枢神经系统。在患病个体中，溶酶体内缺乏功能性酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)，从而导致糖原不能转化为葡萄糖而被利用，致使糖原在患者体内细胞的溶酶体中，尤其是在骨骼肌、心肌等外周器官组织和中枢神经系统(包括脑和脊髓)的细胞内聚积而致病。庞贝氏病可以通过酶学活性检测，检测α-葡萄糖苷酶的活性来确诊。

根据起病年龄和严重程度，庞贝氏病可分为：婴儿型；和晚发型。婴儿发病型庞氏病(IOPD)个体具有极低的残留GAA酶活性，表现出呼吸困难、全身肌肉无力和心肺功能衰竭等比较严重的症状，并常具有致死性。儿童至成年发病型庞贝氏病个体，因残留GAA酶活性较高，病情进展较缓。这种较为温和形式的庞贝氏病也称作晚发型庞贝氏病(LOPD)。在LOPD个体中常常不存在心肌缺陷，但肌无力会导致严重呼吸问题和呼吸衰竭。

目前唯一获得批准的庞贝氏病治疗方法是酶替代治疗(ERT，enzyme replacementtherapy)。ERT具有持续改善心脏功能异常和预防心力衰竭的优势。然而，对于受累的骨骼肌和CNS系统，ERT表现出局限性。接受ERT治疗的患者个体可以具有差别较大的骨骼肌反应。这种反应差异性的因素之一被认为可能与高滴度抗药抗体的形成相关。在动物和人体中的研究已经提示，针对GAA酶形成的抗体可以降低ERT的疗效。此外，ERT药物不能跨血脑屏障，不能治疗CNS病变和受累的呼吸运动神经元。在接受ERT的婴儿个体中已经报道了严重的进行性神经变性。在ERT治疗的长期存活者中的脑MRI研究，也揭示出缓慢进展的白质损伤。ERT的再一局限性是某些组织类型中完全缺乏或仅具有不充分的糖原清除，例如血管、眼部、胃肠道和呼吸系统的平滑肌。

在病理学上，庞贝氏病作为一种常染色隐性单基因病症，由酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因的病理性突变(包括导致GAA酶活性丧失或减小的各种无义突变和错义突变)引起。因此，作为ERT的替代或补充，基因治疗方法被提出来克服患者个体的GAA基因缺陷。

Darin J Falk等(2013,Intrapleural Administration of AAV9 ImprovesNeural and Cardiorespiratory Function in Pompe Disease,doi:10.1038/mt.2013.96)使用AAV9携带在组成型启动子CMV和组织特异性启动子DES控制下的重组GAA基因，通过胸腔内注射来治疗庞贝氏病小鼠。结果显示，GAA酶活性在心脏中有增加，但在肝脏中几乎没有检测到GAA酶活性。

Enyu Deng等人(MOLECULAR THERAPY Vol.5,No.4,2002；doi:10.1006/mthe.2002.0563)使用携带组成型启动子CMV和重组GAA基因的AAV载体(Ad CMV-GAA)，通过静脉内注射小鼠来治疗庞贝氏病。结果显示，重组AAV注射后血浆中会出现瞬时高水平的GAA，但CMV启动子在载体注射数天中快速关闭，且AAV基因治疗触发了快速的抗GAA抗体，导致血浆中GAA水平快速降低至完全无法检测。

为了解决AAV载体药物引起的免疫反应，Sang-oh Han等人(Molecular Therapy:Methods&Clinical Development Vol.4March 2017,http://dx.doi.org/10.1016/j.omtm.2016.12.010.)提出使用肝特异性启动子LSP替代组成型启动子并采用肝靶向性AAV2/8，构建AAV载体AAV2/8-LSPhGAA用于治疗GAA KO小鼠。该研究评估了三种较低剂量AAV2/8-LSPhGAA在单独使用或与ERT结合使用时的功效。结果显示，尽管在组成型启动子CMV增强子/CB启动子控制下携带hGAA的AAV载体不诱导免疫耐受，但利用肝特异性启动子LSP的AAV8-LSP-hGAA可以有利于阻抑抗GAA抗体反应。然而，AAV2/8靶向肝脏，产生的蛋白无法跨越血脑屏障到达中枢神经系统，无法减轻庞贝氏病的中枢神经系统受累。也参见WO2009075815A1。

Allison M.Keeler等人和Jeong-A Lim等人提出通过改良病毒衣壳来提高AAV基因治疗对受累中枢神经系统CNS的疗效。在Allison M.Keeler的研究中(SystemicDelivery of AAVB1-GAA Clears Glycogenand Prolongs Survival in a Mouse Modelof Pompe Disease,HUMAN GENE THERAPY,VOLUME 30NUMBER 1,DOI:10.1089/hum.2018.016)，应用对肌肉和CNS具有高亲和力的AAVB1，构建了腺相关病毒(AAV)载体AAVB1-DES-h GAA及对照AAV9-DES-h GAA载体。在将载体注射到敲除了GAA基因的GAA KO小鼠的尾静脉中后，两种载体均能有效地转导心脏，导致糖原清除，并在组织切片上观察到膈肌和中枢神经系统的转导。然而，仅AAVB1处理的小鼠表现出稳定的增重和四肢力量的恢复。此外，受限于DES启动子的组织特异性和较弱的表达水平，经AAV处理的动物的肝脏GAA水平明显低于野生型，且在两个AAV治疗组的气管，髓质，颈，胸和腰脊髓中的GAA活性均低于酶测定的检测极限。

在Jeong-A Lim等人(Molecular Therapy:Methods&Clinical DevelopmentVol.12March 2019；https://doi.org/10.1016/j.omtm.2019.01.006.)的研究中，使用病毒衣壳PHP.B构建AAV病毒载体，在2周龄的GAA KO小鼠中单次静脉注射AAV-PHP.B-CB-GAA后，糖原含量在脑和心脏中降低至野生型水平，在骨骼肌中含量显著降低。PHP.B-CB-hGAA的转导效率足以阻止GAAKO小鼠大脑中糖原的积累并挽救相关的神经表型。但遗憾的是，PHP.B衣壳的这种异常高的中枢神经系统靶向性仅限于特定的转基因小鼠模型。

采用膈肌内递送AAV载体(rAAV1-CMV-hGAA)的基因治疗在庞贝氏病儿童患者中进行了临床试验。临床试验证实了AAV载体的安全性；但临床结果不显著，并在所有未接受免疫调节剂的患者中均观察到抗衣壳和抗转基因抗体反应。(Giuseppe Vita，2019，https://doi.org/10.1007/s10072-019-03764-z)。

因此，在庞贝氏病的基因治疗中，本领域仍持续需要提供新的治疗载体和药物，以实现疾病相关组织的有效转导和病变的改善，以及降低的抗药免疫反应。

发明概述

本发明人经过深入研究提出了一种可以用于在静脉注射后减轻庞贝氏病的中枢神经系统负担和纠正外周器官受累并同时具有低药物免疫原性的新型人工合成组成型启动子、基于所述启动子的新AAV病毒载体、及其用途。

因此，在一个方面，本发明提供了一种突变启动子，其包含SEQ ID NO:4或与SEQID NO:4具有至少95％同一性或一个或几个核苷酸改变的多核苷酸，且该多核苷酸在SEQID NO:4的位置562-572，优选地位置568中具有T到C或G或A,尤其是T到C的突变。本发明的突变启动子相对于未突变的参照启动子增加与之功能性连接的目的基因的表达，尤其是在哺乳动物细胞或组织中的表达。本发明突变启动子的强启动子活性使其尤其适用于庞贝氏病的治疗用途。

在再一方面，本发明提供了包含本发明突变启动子的表达构建体、载体、宿主细胞、以及其药物组合物。

在再一方面，本发明提供了包含本发明突变启动子和编码酸性α葡萄糖苷酶GAA的多核苷酸的重组AAV病毒载体。本发明的病毒载体可以是ssAAV或scAAV病毒载体。优选地，本发明的病毒载体包含具有肌肉和/或神经系统靶向性的AAV衣壳蛋白，例如AAV9血清型衣壳蛋白。

在再一方面，本发明提供了本发明的重组病毒载体在庞贝氏病或具有酸性葡萄糖苷酶缺陷的受试者中治疗或预防所述疾病或缺陷的应用方法，也提供在制备用于预防或治疗所述疾病或缺陷的药物中的用途。在优选实施方案中，本发明方法导致受试者的外周组织和中枢神经系统组织中GAA酶活性水平的增加和糖原贮积量减少。通过本发明方法，可以有利地在静脉注射后减轻庞贝氏病的中枢神经系统负担和纠正外周器官受累，并同时具有低药物免疫原性的优点。

附图说明

图1A-1D分别显示pscAAV-CAR-Gluc载体、pscAAV-CAR-MutC-Gluc载体、pscAAV-CAR-MutA-Gluc载体、和pscAAV-CAR-MutG-Gluc载体的结构示意图。

图2显示，在体外培养的细胞试验中，与未转染质粒的BHK-21细胞(即，空白对照)相比，在转染了pscAAV-CAR-Gluc载体以及pscAAV-CAR-MutC-Gluc载体、pscAAV-CAR-MutA-Gluc载体和pscAAV-CAR-MutG-Gluc载体的BHK-21细胞中，测定的Gluc水平变化。其中，**表示p<0.01。

图3A-3C分别显示，在以携带CAR及CAR-Mut启动子(SEQ ID NO:1)的重组AAV载体IV注射小鼠后，在解剖的小鼠脑组织(图3A)、心脏组织(图3B)和肝脏组织(图3C)中检测到的Gluc水平。其中，**表示p<0.01。

图4A-4D分别显示pRDAAV-CMV-EGFP载体、pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体、pRDAAV-CAR-Mut-coGAA载体、pRDAAV-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P载体的结构示意图。

图5显示，在体外培养的细胞试验中，在感染与未感染病毒的细胞中测定的GAA酶活性水平。BHK细胞：未感染病毒的BHK-21空白细胞；rAAV9-CAR-Mut-coGAA-142-3p：感染了重组AAV9病毒rAAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P的BHK-21细胞；其中，**表示p<0.01。

图6显示，在GAA

图7A-7D显示，在GAA

图8A-8C显示，在GAA

图9显示，在GAA

图10显示，在GAA

发明详述

本发明公开了用于治疗庞贝氏病或酸性葡萄糖苷酶缺陷受试者的基因治疗构建体、药物组合物和方法，尤其是用于递送GAA的重组AAV载体的构建、制备及应用。

除非下文中另外定义，否则本说明书中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

定义

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。该术语也旨在涵盖在指定数字±1％,±0.5％，或±0.1％范围内的数值。

在本文中，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。

在本文中，表述“第一”、“第二”或“第三”等用于在所述及的要素之间进行区分，并且除非另有说明，这些表述并不指示要求所述要素具有特定的数量或以任何特定顺序或位置存在。

在本文中，表述“和/或”用于表示所列相关项目中的任何一个、或所列相关项目中的多个的任何和所有可能的组合。

在本文中，重组腺相关病毒可以用衣壳的来源AAV病毒血清型单独来表示，或用衣壳和基因组ITR序列的来源AAV病毒血清型来表示。在后一情况下，在本文中，采用标识符“/”进行分隔，标识符“/”之后为衣壳的来源血清型，标识符“/”之前为ITR的来源血清型。因此，例如，表述重组AAV9中的数字9表示所述重组腺相关病毒具有来自AAV9血清型的衣壳；而表述重组AAV2/9中标识符“/”前的数字表示所述重组腺相关病毒具有来自AAV2的野生型或变体ITR序列，而标识符“/”后的数字表示所述重组腺相关病毒具有来自AAV9的衣壳蛋白。

术语“酸性α-葡萄糖苷酶”或“酸性葡萄糖苷酶”或GAA在本文中可互换使用，指：能在麦芽糖和其他线性寡糖中水解α-1-4键从而降解溶酶体中过量糖原的溶酶体酶。当GAA编码基因在细胞中表达时，GAA多肽将在胞质中合成，并在ER中被糖基化，在N端连接上高甘露糖型的糖链。在高尔基体中，GAA上的高甘露糖糖链可以进一步被修饰而添加甘露糖-6-磷酸(M6P)。通过M6P与M6P受体相互作用，GAA被递送到溶酶体中，并在其中发挥糖原降解功能。

GAA的例子包括但不限于，具有全长野生型(天然)人GAA(如Unipro数据库登录号UniProtKB-P10253所示)的氨基酸序列的酶蛋白、其成熟形式、其变体(例如，具有保守氨基酸置换的变体)、及其片段。人GGA在氨基酸残基516-521具有保守六肽WIDMNE，该六肽是GAA蛋白活性所必需的。在本文中，也可以应用GAA的变体和片段，只要所述变体或片段保留水解糖原的活性，并例如提供至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、或大约相同、或大于100％的全长野生型(天然)人GAA的酶活性水平。

在本发明的一个实施方案中，GAA多肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、或SEQ IDN:13的残基70-952的氨基酸序列；SEQ ID NO:13的残基123-952的氨基酸序列，SEQ ID NO:13的残基204-952的氨基酸序列，或与前述序列之任一具有至少90％，或至少95％，96％，97％，98％，99％或更高同一性的氨基酸序列。人GAA多肽的头27个氨基酸是溶酶体蛋白和分泌蛋白的典型信号肽。GAA可以通过该信号肽靶向溶酶体。因此，在一个实施方案中，本发明GAA多肽包含靶向溶酶体的信号肽，例如来自人GGA多肽的天然信号肽序列。在另一实施方案中，本发明GAA多肽包含来自异源溶酶体靶向蛋白的信号肽。

在本发明的一些实施方案中，编码GAA多肽的多核苷酸序列包含野生型GAA核酸序列。在本发明的再一实施方案中，编码GAA多肽的多核苷酸序列是人密码子优化的(即，为了在人类细胞中表达而被密码子优化)，以用于例如增强所述多核苷酸在体内的表达和/或稳定性。优选地，编码GAA的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:10的多核苷酸序列。

术语“ETR”或“酶替换治疗”在本文中是指，用于庞贝氏病或酸型葡萄糖苷酶缺陷治疗的一种治疗程序，其中重组GAA蛋白被施用于有需要的受试者。用于ETR的重组GAA蛋白可以在工程化哺乳动物细胞系例如CHO细胞中产生，或在转基因动物如转基因兔的奶中产生。

如本文中所用，术语“保守性”氨基酸或核苷酸改变是指，导致包含所述氨基酸或核苷酸改变的蛋白质或核酸分子实质性地保持原有功能的中性或近中性氨基酸或核苷酸改变。例如，保守性氨基酸置换是将氨基酸置换或取代成侧链具有相似生物化学性质(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。这类保守性修饰的变体相对于多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。本领域技术人员可以通过常规技术手段，例如功能性测定试验，容易地检测一个特定多肽序列或核苷酸序列中的氨基酸或核苷酸改变的保守性。

术语“功能性连接”也称作“有效连接”，意指指定的各组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系中。

术语序列“同一性”用于描述两个氨基酸序列或多核苷酸序列之间的序列结构相似性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，可以将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。在一些实施方案中，宿主细胞是可以用来产生本发明重组AAV载体的任何类型的细胞系统，例如，哺乳动物细胞(例如适用于通过三质粒包装系统生产重组AAV的HEK 293细胞)和昆虫细胞(例如适用于通过杆状病毒包装系统生产重组AAV的sf9细胞)。

术语“调控序列”或“表达控制序列”是指这样的核酸序列，其诱导、抑制或以其它方式控制与之有效连接的编码核酸序列的蛋白质转录。调控序列可以是例如起始序列、增强子序列、内含子序列和启动子序列等。

描述核酸或蛋白质时所用的术语“外源的”或“异源的”可互换使用，是指核酸或蛋白质不是天然存在于其存在的染色体或宿主细胞的位置。外源核酸序列也指衍生自并插入相同宿主细胞或受试者但以非天然状态存在的序列，例如，所述序列以不同的拷贝数存在，或处于不同调控元件的控制下。

在本文中，“分离的”多核苷酸(例如，分离的DNA或分离的RNA)是指，多核苷酸至少部分地从包含其的天然生物体或病毒的至少一些其他组分中分离出来。在一些实施方案中，“分离的”核酸相对于起始材料被富集了至少大约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。

在本文中，“分离的”多肽是指多肽至少部分地从包含其的天然生物体或病毒的至少一些其他组分中分离出来。在一些实施方案中，“分离的”多肽相对于起始材料被富集了至少大约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。

在本文中，“分离”或“纯化”病毒载体是指，病毒载体从包含其的起始材料的至少一些组分中被部分地分离出来。在一些实施方案中，“分离的”病毒载体相对于起始材料被富集了至少大约10倍、100倍、1000倍、10,000倍或更多。

在本文中，术语“病毒载体”是指，能够作为目的核酸的运载工具的病毒颗粒(例如AAV病毒颗粒)。通常，病毒载体包含衣壳和包装在其中的病毒基因组(例如，病毒DNA)，待递送的目的核酸插在病毒基因组中。在重组AAV病毒载体的情况下，为了产生可以将目的核酸递送至组织或细胞的重组病毒颗粒，通常仅需要在基因组中保留反向末端重复(ITR)顺式元件，而病毒包装所需的其余序列可以反式提供。因此，在一些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含衣壳和包装在其中的重组病毒基因组，其中所述重组病毒基因组包含或由位于两个AAV ITR序列之间的一个或多个外源核苷酸序列组成。位于重组病毒基因组5’和3’末端的两个ITR序列(即，5’ITR和3’ITR)可以相同或不同。

术语AAV“反向末端重复”(inverted terminal repeat,ITR)在本文中是指，来自AAV病毒基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用。天然AAV病毒的ITR序列中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site，RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site)，能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口。该ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用。最早分离到的AAV病毒，AAV2，具有位于基因组两端、长度145bp的呈回文-发卡结构的“反向末端重复序列”(ITR)。之后，在各种血清型的AAV病毒中发现不尽相同的ITR序列，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。基于这些野生型ITR序列的传统重组AAV病毒载体一般为单链AAV载体(ssAAV)，病毒基因组以单链形式包装在AAV衣壳中。与此类ssAAV不同，已经发现，通过改造ITR，删除AAV病毒的一侧ITR序列中的trs序列和任选地D序列，能够使包装得到的重组AAV病毒载体所携带的基因组自我互补，形成双链(Wang Z等人，Gene Ther.2003；10(26):2105-2111；McCarty DM等人，Gene Ther.2003；10(26):2112-2118)。由此包装得到的病毒为双链AAV病毒，即，scAAV(self-complementary AAV)病毒。scAAV病毒载体的包装容量更小，仅为ssAAV病毒载体包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。

在本文中，与AAV相关的该术语ITR涵盖野生型ITR和变体IRT。野生型ITR可以来自任何天然AAV病毒，例如AAV2病毒。野生型ITR中包含Rep蛋白结合位点(Rep binding site，RBS)和末端解链位点trs(terminal resolution site)，能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口。野生型ITR序列可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用。在本文中，变体ITR是非天然的ITR序列，其可以例如来自任何野生型AAV ITR序列，并相对于野生型ITR包含一个或多个核苷酸的缺失、替代、和/或添加，和/或截短，但仍具有功能性，即，能够用于产生ssAAV病毒载体或scAAV病毒载体。在一些实施方案中，变体ITR是缺失了功能性trs位点和任选地D区序列的AAV ITR序列(在本文中，也称作ΔITR)。在一些实施方案中，野生型ITR与ΔITR组合用于产生自我互补型重组AAV病毒载体(scAAV)。在另一些实施方案中，两个野生型ITR组合用于产生单链重组AAV病毒载体(ssAAV)。

AAV蛋白VP1,VP2和VP3是衣壳蛋白，其相互作用以形成AAV衣壳。不同血清型的AAV病毒具有不同的组织感染嗜性，可以通过选择重组AAV病毒载体衣壳的来源血清型，将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z等人，Mol Ther.2006；14(3):316-327)。在本发明中，重组AAV病毒载体可以通过选择衣壳的来源血清型，而具有不同的靶向性。在一些实施方案中，重组AAV病毒的衣壳来自对神经元细胞具有靶向性的AAV血清型。在一个实施方案中，重组AAV病毒载体包含来自AAV9的衣壳。在再一个实施方案中，重组AAV病毒载体包含来自AAV9的衣壳和来自AAV2的ITR。

术语“免疫相关miRNA”是优先在免疫系统细胞，例如抗原提呈细胞中表达的miRNA。在一些实施方案中，免疫相关miRNA在免疫细胞中的表达水平，相对于其在非免疫细胞(例如参照细胞，例如HEK293细胞)中的表达水平高，尤其是高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍。在一些实施方案中，表达免疫相关miRNA的免疫系统细胞是B细胞、T细胞、T杀伤细胞、T辅助细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、血管内皮细胞、或其他免疫细胞。在一些实施方案中，免疫相关miRNA是miR-142-3P。miR-142-3p是一种miRNA，其在造血干细胞系来源细胞中高表达。免疫细胞均分化来源于造血干细胞系，因此利用miRNA抑制基因表达的原理，携带miR-142-3p靶序列的基因表达会在免疫细胞中受到明显抑制，从而降低机体产生针对基因表达产物免疫反应的概率。

术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明重组AAV病毒在施用给庞贝氏病或GAA缺陷受试者后，优选在全身施用后，降低受试者的多个受累组织(尤其是，骨骼肌、心肌、膈肌和中枢神经系统)中的溶酶体糖原贮积量。在一些实施方案中，本发明重组AAV病毒在施用给庞贝氏病或GAA缺陷受试者后，优选在全身施用后，改善受试者的中枢神经系统损伤。在一些实施方案中，本发明重组AAV病毒在施用给庞贝氏病或GAA缺陷受试者后，优选在全身施用后，改善受试者的骨骼肌、心肌损伤。在一些实施方案中，本发明重组AAV病毒在施用给庞贝氏病或GAA缺陷受试者后，优选在全身施用后，改善受试者的神经系统(包括大脑、脊髓和/或小脑组织)中疾病所致的病理变化。在一些实施方案中，改善脑组织中胶质细胞的糖原累积。在另一实施方案中，本发明重组AAV病毒在施用给庞贝氏病或GAA缺陷受试者后，优选在全身施用后，延长受试者的生存期。

在本文中，“预防”包括对疾病或特定疾病的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有庞贝氏病发生倾向的受试者是预防性方案的候选者。通常，术语“预防”是指在疾病的至少一个症状发生前实施的医院干预。因此，在一个实施方案中，预防包括在具有GAA基因缺陷的受试者中于庞贝氏病的症状发生前的本发明基因治疗药物的施用，以延缓疾病发展或阻止疾病的出现。

以下对本发明的各个方面进行描述。

I.用于基因治疗的构建体

启动子(promoter)是RNA聚合酶(RNA polymerase)识别、结合、开始转录的一段特定DNA序列。真核生物类别Ⅱ(classⅡ)启动子参与蛋白质编码基因的转录控制，通常位于基因编码区的上游，通过与转录因子(transcription factors,TFs)的相互作用调控基因转录的时机和部位。该类启动子包含5类作用元件：基本启动子、起始子、上游元件、下游元件和应答元件。这些元件的不同组合及序列的变化，赋予了对启动子功能活性的多重影响(汤方,涂慧珍.真核启动子研究进展[J].林业科技开发.2015,29(2):7-12.)。

在本发明的一个方面，提供了一种人工合成的突变组成型启动子CAR-Mut。本发明组成型启动子可以在多种组织中有效启动外源基因表达，因而尤其适用在本发明治疗方法中应用以纠正庞贝氏病的外周器官受累并减少中枢神经系统负担。

在一个实施方案中，本发明提供了一种突变启动子，其包含选自以下的多核苷酸：

(i)SEQ ID NO:4的多核苷酸，

(ii)与SEQ ID NO.4具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％同一性的多核苷酸，

(iii)在SEQ ID NO.4的多核苷酸中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸得到的多核苷酸，

且其中，所述多核苷酸在SEQ ID NO:4的核苷酸第562-572位或与之相应的位置具有突变，优选地所述突变为核苷酸568位或相应位置上的T突变为C或G或A，更优选为T突变为C。

在一个优选实施方案中，本发明的突变启动子，相对于由不具有所述突变的相应多核苷酸组成的参照启动子，增加与其功能性连接的目的基因的表达，例如，使所述目的基因表达增加1％-70％，例如，至少5％，10％，20％，30％，40％，或至少50％，60％。

在再一优选实施方案中，本发明的突变启动子，相对于参照启动子，增加与之功能性连接的目的基因在哺乳动物细胞或组织中的表达，例如，增加所述目的基因在哺乳动物外周组织和/或中枢神经组织，尤其是选自心脏、肝脏和/或脑的哺乳动物组织中的表达。优选地，所述哺乳动物为人或非人哺乳动物，例如，小鼠、大鼠和非人灵长类动物。

在再一些实施方案中，所述启动子包含选自SEQ ID NOs:1至3之任一的核苷酸序列、或与之相差一个或几个核苷酸取代、缺失和/或添加且具有同等启动子活性的核苷酸序列。优选地，所述启动子包含或由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成。

本领域技术人员可以采用本领域已知的任何启动子功能性测定试验(例如实施例1的荧光素酶报告基因表达测定试验)，来确定任何两个启动子是否具有同等启动子活性。在一个实施方案中，在相同的测试条件下，与参考启动子(例如SEQ ID NO：1-3)相比，如果待测启动子具有相同或基本上相同的活性，例如参考启动子活性±10％、优选地±5％，或更优选±1％的活性，则可以认为待测启动子具有同等启动子活性。

在一些方面，本发明也涵盖包含所述启动子及与之功能性连接的编码核苷酸序列的表达盒、重组载体和宿主细胞、以及使用所述表达盒、载体或宿主细胞向哺乳动物细胞或个体递送编码多核苷酸的组合物和方法。

在一个方面，本发明提供了表达构建体。本发明的表达构建体包含本发明的启动子，并可以有利地用于GAA编码核酸序列在庞贝氏病患者或酸性葡萄糖苷酶缺陷患者的期望组织或细胞中的表达。

在一个实施方案中，本发明的表达构建体以转录方向彼此功能性连接的如下元件：

-本发明的任何CAR-Mut启动子，尤其是SEQ ID NO：1的启动子，

-任选地，Kozak序列，

-编码目的基因的多核苷酸，例如，编码α酸性葡萄糖苷酶(GAA)的多核苷酸序列，优选地人密码子优化的人GAA多肽编码序列，更优选地SEQ ID NO:10的序列，

-任选地，至少一个(例如2-4个)免疫相关的miRNA结合位点，尤其是miR-142结合位点，例如包含至少一个(例如一个或两个)SEQ ID NO:11序列的miR-142结合位点，

-任选地，转录终止子，例如polyA信号序列，优选地选自SV40晚期polyA序列、兔β-珠蛋白polyA序列、牛生长激素polyA序列、或其任何变体，更优选包含SEQ ID NO:13或与其具有至少95％同一性的牛生长激素polyA序列。

在一些实施方案中，表达构建体还包括两个ITR序列。例如，从5’末端到3’末端，表达构建体可以包含如下排列的元件：5’ITR-启动子-GAA编码序列-miRNA结合位点-polyA-3’ITR。在一些实施方案中，5’ITR和3’ITR相同。在另一实施方案中，5’ITR和3’ITR不同，且其一(优选3’ITR)为缺少功能性trs位点的ΔITR。在一个实施方案中，表达构建体中的5’ITR和3’ITR相同，均包含或由SEQ ID NO:5序列组成。在再一实施方案中，表达构建体中的5’ITR和3’ITR不同，其中5’ITR包含或由SEQ ID NO:5序列组成，且3’ITR包含或由SEQ IDNO:6序列组成。

用于本发明表达构建体中的启动子可以是本发明上述任何实施方案中描述的CAR-Mut启动子。在一个优选的实施方案中，所述启动子包含或由SEQ ID No:1的核苷酸序列组成。在另一优选的实施方案中，所述启动子包含或由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成。在另一优选的实施方案中，所述启动子包含或由SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成。

本发明的表达构建体在一个实施方案中可以包含位于GAA编码核酸序列的起始密码子上游的Kozak序列，以促进GAA的翻译。用于本发明的Kozak序列可以是定义为GCCRCC的共有序列，其中R是嘌呤(即A或G)，且其中所述序列位于起始密码子上游。在一个优选的实施方案中，在本发明表达构建体的核酸序列中，所述Kozak序列具有5’-GCCACC-3’序列。也可以使用其他不同的Kozak序列。可通过序列文库筛选Kozak序列，并且对翻译效率的增强作用可以使用本领域已知的常规方式进行评估。例如，可以构建包含具有不同Kozak序列的报告基因或重组GAA基因的重组核酸，将重组核酸引入宿主细胞，例如BHK细胞中，经一段时间后检测细胞或培养上清液中的报告基因表达水平或GAA酶活性水平，并与具有参考Kozak序列的重组核酸进行比较，以确定所测试的Kozak序列的翻译增强效率。

在一些实施方案中，本发明的表达构建体还包含一个或多个免疫相关的miRNA结合位点，即，miRNA靶序列，位于目的GAA编码核酸序列的3’UTR中。不受任何具体理论的约束，包括miRNA结合位点在表达构建体中允许对目的基因在产生相应miRNA的细胞和组织中的表达进行调节(例如，抑制)。由此，在一个实施方案中，本发明表达构建体包含一个或多个miRNA结合位点，从而可以以细胞类型特异性方式下调GAA的表达。在一个实施方案中，本发明表达构建体包含一个或多个miRNA结合位点，其中所述miRNA在抗原呈递细胞中表达，由此降低了本发明表达构建体在所述抗原呈递细胞中表达GAA的效率。在一些实施方案中，一个或多个miRNA结合位点位于GAA编码基因的3’非翻译区(3’UTR)中，例如，编码GAA的核苷酸序列的最后一个密码子和polyA序列之间。

在一些实施方案中，表达构建体包含一个或多个(例如,1,2,3,4,5或更多个)miRNA结合位点，所述miRNA结合位点下调GAA基因从免疫细胞(例如，抗原呈递细胞APC,例如巨噬细胞和树突细胞等)的表达。不受具体理论的约束，此类免疫相关miRNA结合位点在表达构建体中并入可以导致减少目的GAA基因在具有该miRNA的抗原呈递细胞中的表达，并由此减少或抑制受试者产生抗GAA免疫反应。

在一些优选的实施方案中，表达构建体包含一个或多个miR-142结合位点(在本文中也称作miR-142靶序列)，例如SEQ ID NO:11的miR-142-3P靶序列，或其串联重复序列，例如2,3,4,5,6个串联重复,优选地2个串联重组，如SEQ ID NO：12的miR-142-3P靶序列。在一些实施方案中，所述miRNA结合位点可以降低重组AAV载体在抗原提呈细胞中的表达。在一些实施方案中，所述miRNA结合位点可以降低重组AAV载体的免疫原性。在一些实施方案中，包含所述miRNA结合位点的重组AAV载体在受试者中引发低的免疫反应。在另一些实施方案中，相对于不含miRNA结合位点的重组AAV载体对照，包含所述miRNA结合位点的重组AAV载体在施用后受试者中引发低的抗GAA血清效价。优选地，所述施用为静脉内施用。在一个实施方案中，在施用1-6周，例如5周后测量，确定抗GAA血清效价，优选地，相对于对照，该血清效价降低大约1至10倍，例如，大约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或8倍。

在一些实施方案中，本发明表达构建体包含至少一个polyA尾位于编码GAA和miRNA结合位点的多核苷酸下游。任何合适的polyA序列均可以使用，包括但不限于hGHpolyA,BGHpolyA,SV40晚期polyA序列、兔β-珠蛋白polyA序列、或其任何变体。在一个优选的实施方案中，polyA是BGHpolyA，例如SEQ ID NO:7所示的polyA，或与SEQ ID NO:7具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％的核苷酸序列同一性的polyA多核苷酸序列。

包含在本发明表达构建体中的GAA编码核酸可以是任何编码功能性GAA酶活性的多核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸编码人全长GAA序列例如SEQ ID NO：13的序列，或其片段，例如起始于SEQ ID NO:14的残基1-204之间且终止于残基952、或相应位置的GAA酶片段。优选地，所述GAA包含靶向溶酶体的天然信号肽(即，在SEQ ID NO：13的情况下，氨基酸1-27的信号肽)。或者，所述GAA可以包含来自异源信号肽，例如来自人溶酶体靶向蛋白或分泌蛋白的信号肽。可在本发明中使用的异源信号肽的例子包括但不限于：来自免疫球蛋白(例如IgG)、细胞因子(例如IL-2)、胰岛素的信号肽。参见例如WO2018046774。

在一些实施方案中，本发明的表达构建体包含GAA编码核酸序列，其中所述核酸序列编码具有GAA酶活性的多肽，其中所述多肽包含：与SEQ ID NO：13的序列、或与SEQ IDNO:13的氨基酸70-952的序列、与SEQ ID NO:13的氨基酸123-952的序列、或与SEQ ID NO:13的氨基酸204-952的序列，具有至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列。优选地，所述多肽与SEQ ID NO:13的参照GAA蛋白相比具有大约相同的糖原水解活性，例如所述多肽的GAA酶活性是参照GAA蛋白酶活性的至少大约95％、大约96％，大约97％、98％、99％或更高。用于测定GAA酶活性的测定试验是本领域已知的。本领域技术人员可以采用任何这样的测定试验确定可以用于本发明表达构建体、重组AAV病毒载体、以及方法和用途中的适宜GAA多肽。

为了有利于在人类细胞中的表达，用于编码GAA多肽优选地进行密码子优化。在一个实施方案中，用于本发明表达构建体中的GAA编码核酸包含SEQ ID NO:13的多核苷酸序列，或与之具有至少大约95％、大约96％，大约97％、98％、99％或更高核苷酸序列同一性的多核苷酸序列。

在一些方面，本发明也提供包含本发明表达构建体的载体。在一些实施方案中，所述载体是质粒(例如用于重组病毒颗粒生产的质粒)。在另一些实施方案中，所述载体是病毒载体，例如重组AAV载体或杆状病毒载体。在一些实施方案中，重组AAV载体的基因组是单链的(例如单链DNA)。在一些实施方案中，重组AAV载体的基因组是自互补的。在再一些实施方案中，载体是杆状病毒载体(例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)载体)。

在再一方面，本发明也提供了包含本发明的表达构建体或载体的宿主细胞，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以用于生产重组AAV病毒。

在一个方面，本发明提供了重组AAV载体。本发明的重组AAV载体尤其可用于治疗庞贝氏病或酸性葡萄糖苷酶缺陷。在一个实施方案中，重组AAV载体包含衣壳和位于衣壳中的核酸，在本文中也称作“重组AAV载体的基因组”。重组AAV载体的基因组包含多个元件，包括但不限于两个反向末端重复(ITR，即，5’-ITR和3’-ITR)，以及位于两个ITR之间的其它元件，包括启动子、异源基因、和polyA尾。优选地，两个ITR之间还可以包含至少一个免疫相关的miRNA结合位点。

在本文中，腺相关病毒(AAV)包括但不限于，任何血清型的AAV，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11型AAV，及具有人工改变的衣壳蛋白的AAV。各种血清型和人工AAV的基因组序列及其天然反向末端重复(ITR)序列、Rep蛋白和衣壳cap蛋白是本领域已知的。这些序列可以在公开数据库例如GenBank或文献中找到。

在一些实施方案中，本发明提供包含衣壳的重组AAV病毒载体，其中所述衣壳由能够跨血脑屏障的衣壳蛋白，例如AAV9、AAVPHP.B、AAVPHP.eB衣壳蛋白构成。在一些实施方案中，本发明的重组AAV载体转导中枢神经系统(CNS)的神经元细胞，也转导外周非神经元细胞。在另一些实施方案中，重组AAV载体在全身给药后能靶向和转导肌细胞和神经元细胞。在另一实施方案中，重组AAV载体在全身给药后能靶向和转导受试者的外周器官和中枢神经系统。在再一实施方案中，重组AAV载体在全身给药后能靶向和转导受试者的多数组织(例如，脑、脊髓、骨骼肌、心脏、和肝脏)，且优选地，以未接受重组AAV载体施用的对照受试者相比，重组AAV载体在所述靶向和转导的组织中导致更高的目的外源基因(在本申请中GAA)的表达和/或酶活性。

在一些实施方案中，本发明的重组AAV载体具有来自AAV9血清型的衣壳(也本文中也称作AAV9载体)；优选地，所述重组AAV载体在其基因组具有来自AAV2的野生型或变体ITR序列(也在本文中也称作AAV2/9载体)。

在一些实施方案中，本发明的重组AAV载体的两个ITR序列均是全长ITR(例如长度为约125-145bp，并含有功能性的Rep结合位点(RBS)和末端解链位点(trs))。在一些实施方案中，全长功能性ITR被用于生产单链重组AAV载体(ssAAV)。在再一些实施方案中，所述重组AAV载体的ITR之一是截短的。在一些实施方案中，截短的ITR缺少功能性末端解链位点trs并被用于生产自我互补型重组AAV载体(scAAV载体)。

在一些实施方案中，本发明的重组AAV载体包含野生型AAV ITR，例如野生型AAV2ITR，例如SEQ ID NO:5所示的ITR序列。在另一些实施方案中，本发明的重组AAV载体包含相对于野生型AAV ITR具有一个或多个修饰，例如核苷酸添加、缺失和/或替代的变体ITR，例如相对于野生型AAV2 ITR发生截短而缺失功能性trs位点的ΔITR，例如SEQ ID NO：6所示的ΔITR序列。

因此，在一个方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒(AAV)载体，其中所述重组AAV载体在其基因组中包含：

a.5’和3’AAV反向末端重复(ITR)序列，和

b.位于5’和3’ITR之间的表达构建体，其中所述表达构建体包含以转录方向彼此功能性连接的如下元件：

-根据本发明的任何CAR-Mut启动子，尤其是SEQ ID NO：1的启动子，

-任选地，Kozak序列，

-编码人α酸性葡萄糖苷酶(GAA)的多核苷酸，

-任选地，至少一个(例如2-8个)免疫相关的miRNA结合位点，尤其是miR-142结合位点，例如包含至少一个(例如1个或2个)SEQ ID NO:11序列的miR-142结合位点，

-转录终止子，例如polyA信号序列，优选地选自SV40晚期polyA序列、兔β-珠蛋白polyA序列、牛生长激素polyA序列、或其任何变体。

在一些实施方案中，所述重组AAV载体中，编码GAA的多核苷酸为人密码子优化的，优选地所述密码子优化用于增强所述多核苷酸的体内表达效率和/或稳定性，更优选地，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:10的序列。

在一些实施方案中，所述重组AAV病毒载体的两个ITR均为野生型AAV2 ITR序列，或所述ITR之一是缺少功能性末端解链位点(trs)的AA2ΔITR序列。

在一些实施方案中，所述重组AAV载体为ssAAV载体。在另一些实施方案中，所述重组AAV载体是scAAV载体。

在一些实施方案中，所述重组AAV载体包含来自AAV9血清型的衣壳蛋白，优选地，所述重组AAV载体是AAV2/9载体。

现有技术中对AAV载体具有相对成熟的包装系统，这便于规模化生产AAV载体。

目前常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒作为辅助病毒的系统、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV1)作为辅助病毒的包装系统、以及基于杆状病毒的包装系统。每种包装系统都各具特点，本领域技术人员可以根据需要做出合适的选择。

三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。

Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统(Yuan Z等人，Hum GeneTher.2011；22(5):613-624)，该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。

HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略(伍志坚，吴小兵等，科学通报，1999，44(5)：506-509；Conway JE等人，Gene Ther.1999，6：986-993)。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略(Wustner JT等人，MolTher.2002，6(4)：510-518)。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列(Inverted terminal repeat，ITR)/外源基因表达框，然后用这两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒(Booth MJ,et al.Gene Ther.2004；11:829-837)。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统(Thomas DL等人，Gene Ther.2009；20:861-870)，使更大规模的AAV病毒生产成为可能。

Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构基因、非结构基因和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两个或一个杆状病毒(Chen H.，Mol Ther.2008，16(5)：924-930；Galibert L.et al.，JInvertebr Pathol.2011；107Suppl:S80-93)以及一个杆状病毒组合一株诱导细胞株策略(Mietzsch M等人，Hum Gene Ther.2014；25:212-222，Mietzsch M等人，Hum GeneTher.2015；26(10):688-697)。

本发明的重组AAV病毒载体可以使用本领域已知的任何合适的方法来生产。在一个实施方案中，本发明重组AAV病毒采用三质粒包装系统进行生产。在另一实施方案中，本发明重组AAV病毒采用杆状病毒包装系统进行生产。

因此，在一个方面，本发明提供了一种细胞，其包含：(i)编码一种或多种腺相关病毒rep蛋白和/或一种或多种腺相关病毒cap蛋白的第一载体；和(ii)包含本文中所述的本发明任何表达构建体的第二载体。本发明的细胞可以用于生产本发明重组AAV病毒载体的生产。

在再一方面，本发明也提供了一种生产重组AAV病毒载体的方法，其中所述方法包括步骤：

(i)提供细胞，其中所述的细胞包含：(i)编码一种或多种腺相关病毒rep蛋白和/或一种或多种腺相关病毒cap蛋白的第一载体；和(ii)包含本发明任何表达构建体的第二载体；

(ii)在允许包装重组AAV的条件下培养所述细胞；和

(iii)收获培养的宿主细胞或培养基以收集所述重组AAV病毒载体。

在上述细胞和生产方法的一个实施方案中，第一载体是质粒，且第二载体是质粒；所述细胞是哺乳动物细胞，任选地其中所述哺乳动物细胞是HEK293细胞。根据情况，细胞可以提供感染性重组AAV病毒粒子生产所需的其它功能，或部分功能。在细胞仅提供部分功能的情况下，在一些实施方案中，所述细胞还包含第三辅助质粒载体。通过瞬时共转染第一质粒载体、第二质粒载体，和/或第三辅助质粒，可以容易地制备本发明的细胞。在一些实施方案中，感染性AAV粒子生产所需的功能由腺病毒基因提供，其中第三辅助质粒提供腺病毒基因VA,E2A和E4；其余生产所需的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的宿主细胞提供。参见例如T Matsushita等,Adeno-associated virus vectors can beefficientlyproduced without helper virus.Gene Therapy(1998)5,938–945.

在上述细胞和生产方法的另一个实施方案中，第一载体是杆状病毒载体且第二载体是杆状病毒载体；所述细胞是昆虫细胞，任选地其中所述昆虫细胞是sf9细胞。在一些实施方案中，AAV的Rep和Cap蛋白分别由分开的两个第一杆状病毒载体提供；在另一些实施方案中，AAV的Rep和Cap蛋白由一个第一杆状病毒载体同时提供。在一些实施方案中，可以通过例如Bac-to-AAV系统，产生分别编码目的GAA基因和AAV的Rep和Cap蛋白的两个杆状病毒，使用两个杆状病毒共感染草地贪夜蛾(Sf9)昆虫细胞而产生本发明的细胞。参见例如，Galibert L.et al.，J Invertebr Pathol.2011；107Suppl:S80-93。

III.药物组合物

再一方面，本发明提供了包含本发明的重组AAV病毒载体的药物组合物。本发明的药物组合物优选地包含可药用赋形剂、稀释剂或载体。本发明的药物组合物可以配制为任何合适的制剂形式。

用于配制的合适可药用赋形剂、稀释剂或载体的实例在本领域中是众所周知的，包括例如，磷酸盐缓冲盐溶液，水，乳液，例如油/水乳液，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。制剂可以通过常规方法配制，并以合适的剂量向受试者给药。合适配制的组合物的施用可以通过不同的方式来实现，例如。通过静脉内，腹膜内，皮下，肌肉内，局部或皮内给药。具体施用途径尤其取决于药物组合物中包含的载体的类型。剂量方案将由主治医师和其他临床因素决定。如医学领域众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型，体表面积，年龄，性别，所要施用的特定活性剂，所用的时间和途径，所用药物的种类和阶段。感染或疾病，一般健康状况、以及其他药物的联用。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含第二活性剂。在一些实施方案中，第二活性剂是用于ERT的重组GAA蛋白，例如来自转基因动物奶或生产性哺乳动物细胞系的重组GAA蛋白。在一些实施方案中，第二活性剂是支气管扩张剂。

在另一些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含能够降低药物施用时副反应(例如抗药免疫反应)的组分。在一些情况下，所述组分可以是免疫抑制剂。

本发明的药物组合物可以通过任何合适途径给药，包括全身给药和局部给药。在一个优选方案中，本发明药物组合物用于全身给药方式给药，尤其是静脉注射给药。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明重组AAV载体的药物组合物，其中所述药物组合物是静脉注射制剂，或适用于配制为静脉注射制剂的冻干稳定制剂。在另一些实施方案中，本发明药物组合物适用于局部给药，例如直接施用予受试者的待治疗器官或组织中或附近。

IV.治疗方法

在另一方面，本发明涉及使用本发明的重组AAV载体或包含其的药物组合物治疗疾病的方法。在一个的实施方案中，所述疾病是庞贝氏病。在另一实施方案中，所述疾病是酸性α葡萄糖苷酶缺陷。在一个实施方案中，所述方法包括：将本发明的任何重组AAV载体或药物组合物施用给有需要的受试者。所述重组AAV载体或药物组合物可以通过任何适宜的途径施用，包括但不限于，肌内，皮下，脊髓内，脑室内，鞘内，静脉内，膈肌内，胸腔内，腹膜内。优选地，本发明的重组AAV载体或药物组合物通过全身给药方式，尤其是静脉内给药方式递送给受试者。在一些实施方案中，所述治疗是治疗性的。在另一些实施方案中，所述治疗是预防性的。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，其中所述哺乳动物尤其是人、灵长类、狗、马、牛，特别是人类受试者。

在涉及治疗庞贝氏病受试者的方法中，在一些实施方案中，治疗包括以下之任一项或多项：(1)阻止或延迟庞贝氏病的发作；(2)减轻庞贝氏病的严重程度；(3)减轻或阻止庞贝氏病的至少一个症状的出现和/或恶化；(4)改善庞贝氏病相关的神经变性和/或受试者行为；和(5)延长受试者的生存期。可以接受治疗的庞贝氏病受试者包括IOPD和LOPD患者。在一些实施方案中，受试者是IOPD患者。在再一些实施方案中，受试者是LOPD患者。

因此，在一个方面，本发明提供了本发明重组AAV病毒载体用于驱动编码α酸性葡萄糖苷酶(GAA)的多核苷酸在哺乳动物细胞(尤其是人细胞)中表达的用途，或在制备用于驱动编码α酸性葡萄糖苷酶(GAA)的多核苷酸在哺乳动物细胞或哺乳动物(尤其人)体内一种或多种组织或器官中表达的药物中的用途，

优选地，所述药物用于在哺乳动物的心脏、肝脏、肌肉、中枢神经系统(包括脑和脊髓)中表达GAA，

优选地，所述药物全身给药，例如腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、动脉内或静脉内(i.v.)注射给药，优选地静脉内注射。

在再一方面，本发明提供了一种用于治疗庞贝氏病受试者或具有酸性葡萄糖苷酶缺陷的受试者的方法，和本发明的重组AAV载体在制备用于治疗庞贝氏病受试者或具有酸性葡萄糖苷酶缺陷的受试者的药物中的用途。所述治疗包括向所述受试者施用本发明的任何一个或多个重组AAV载体，优选地，通过全身给药，例如腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、动脉内或静脉内(i.v.)注射给药，优选地静脉内注射，施用所述重组AAV载体。

在本发明治疗方法和用途的一些实施方案中，在施用本发明重组AAV载体后，GAA多肽在受试者的心脏、肝脏、肌肉、中枢神经系统(包括脑和脊髓)中表达。在再一些实施方案中，重组AAV载体施用导致受试者的骨骼肌、心肌、膈肌和中枢神经系统中的溶酶体糖原贮积量减少，且优选地不诱导或诱导低的免疫原性。在一些实施方案中，施用本发明重组AAV载体可以改善受试者的心脏、呼吸和/或骨骼肌功能。在再一些实施方案中，施用本发明重组AAV载体可以预防或改善受试者的中枢神经系统，例如脑、脊髓和/或神经元因糖原贮积而致的病变，例如进行性神经变性。在一些实施方案中，施用本发明重组AAV载体可以延长受试者的生存期。

因此，本发明也提供了如下方法和本发明重组AAV载体在制备用于如下方法的药物中的用途：

(1)在患有或有风险患有庞贝氏病风险或酸性葡萄糖苷酶缺陷的受试者中用于预防或减少受试者体内细胞的病理学溶酶体糖原过量贮积的方法；

(2)在患有或有风险患有庞贝氏病风险或酸性葡萄糖苷酶缺陷的受试者中用于预防或改善因溶酶体糖原过量贮积所致的心脏、呼吸和/或骨骼肌功能损伤的方法；

(3)在患有或有风险患有庞贝氏病风险或酸性葡萄糖苷酶缺陷的受试者中用于预防或改善因溶酶体糖原过量贮积所致的神经系统损伤的方法；

(4)在患有或有风险患有庞贝氏病风险或酸性葡萄糖苷酶缺陷的受试者中用于减轻因溶酶体糖原过量贮积所致的中枢神经系统负担和纠正外周器官受累的方法；

(5)在患有或有风险患有庞贝氏病风险或酸性葡萄糖苷酶缺陷的受试者中用于延长受试者生存期的方法。

在本发明治疗方法和用途的一些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体与另一治疗药物或治疗程序组合施用。可以与本发明重组AAV载体组合施用的治疗药物或治疗程序可以选自免疫调节剂、支气管扩张剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、呼吸肌强度训练(RMST)、酶替换治疗(ERT)、和/或膈肌起搏治疗。

实施例

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。

实施例1：CAR-Mut启动子构建和表征

1.

在由人CMV病毒的增强子序列和鸡β-actin蛋白的基础启动子组成的CA启动子上，在序列3’端引入人TATA盒结合蛋白相关因子1基因(GenBank:NG_012771.2)中第62804位至62890位的内含子序列，得到命名为CAR启动子。对CAR启动子进行改造，将启动子末端第568位的T突变为非T核苷酸，获得CAR-Mut启动子，即，CAR-MutC(具有突变T568C，序列如SEQ IDNO:1所示)，CAR-MutA(具有突变T568A，序列见SEQ ID NO:2所示),和CAR-MutG(具有突变T568G，序列见SEQ ID NO:3所示)。

为表征启动子CAR-Mut，构建了图1A所示的pscAAV-CAR-Gluc质粒载体，包含：

i)来自AAV2基因组(GenBank No.AF043303)3’端的ITR，序列如SEQ ID NO:5所示；

ii)CAR启动子，序列如SEQ ID NO:4所示；

iii)Gluc，编码荧光素酶报告基因的核苷酸序列；

iv)牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号，也缩写为BGH polyA；

v)以AAV2基因组(GenBank No.AF043303)3’端ITR序列为基础，缺失该序列中的trs序列和D序列，得到的ΔITR，序列如SEQ ID NO:6所示。

以pscAAV-CAR-Gluc质粒(图1A)为基础，用CAR-Mut启动子(SEQ ID No.1,2,或3)替换pscAAV载体中的CAR启动子，得到pscAAV-CAR-Mut-Gluc(图1B-1D)载体。简言之，合成CAR-Mut启动子序列并在两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。将合成的序列克隆入pUC57simple载体(金斯瑞生物科技，南京)，得到pUC57-CAR-Mut。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CAR-Mut载体和pscAAV-CAR-Gluc载体，回收CAR-Mut片段和切去了CAR启动子的pscAAV载体片段，连接后转化E.coli DH5α感受态细胞(擎科新业，北京)，筛选、鉴定后得到含有CAR-Mut启动子的AAV质粒载体pscAAV-CAR-Mut-Gluc。

将生长良好的BHK-21细胞传代至24孔板，待密度达到60％时，利用Lipofectamine2000(Invitrogen,美国)，根据厂商说明书，转染pscAAV-CAR-Gluc、pscAAV-CAR-MutC-Gluc、pscAAV-CAR-MutA-Gluc和pscAAV-CAR-MutG-Gluc各3孔。转染48小时后每孔取上清液100μL，用Glomax96微孔板光度计(Promega)检测Gluc水平，并使用检测仪软件进行数据分析。

结果(图2)比较得出，与空白(未转染质粒的BHK-21细胞)相比，在转染质粒pscAAV-CAR-Gluc与pscAAV-CAR-Mut-Gluc后，细胞Gluc表达水平极显著的增加，且转染pscAAV-CAR-MutC-Gluc后Gluc水平相比转染pscAAV-CAR-Gluc提升29.8％。pscAAV-CAR-MutA-Gluc、pscAAV-CAR-MutG-Gluc与pscAAV-CAR-MutC-Gluc无明显差异。

这说明，CAR启动子经568位碱基替换后具有增加的功能。

以CAR-Mut启动子CAR-MutC为代表，检测了包含CAR-Mut启动子的重组AAV病毒在动物体内的功能活性。

(1)重组AAV病毒制备

应用三质粒包装系统包装和纯化重组AAV病毒，得到rscAAV9-CAR-Mut-Gluc和rscAAV9-CAR-Gluc重组病毒。

首先，构建AAV的Rep和Cap蛋白表达质粒pAAV-R2C9。以AAV Helper Free System(Agilent Technologies，目录号#240071)中的pAAV-RC质粒为基本骨架，采用标准的分子克隆方法，用合成的AAV9基因组中的衣壳蛋白编码序列(也称为Cap9)替换pAAV-RC质粒中HindIII至PmeI限制性酶切位点之间的序列，获得了pAAV-R2C9质粒。所述pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV9病毒时提供包装所必须的4种Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和AAV9衣壳蛋白。

将之前构建的AAV载体质粒(pscAAV-CAR-Gluc与pscAAV-CAR-Mut-Gluc)、辅助质粒(pHelper,来自AAV Helper Free System，Agilent Technologies)和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒pAAV-R2C9，按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞。转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒，得到rscAAV9-CAR-Gluc与rscAAV9-CAR-Mut-Gluc。

(2)重组AAV病毒的滴度检测

采用点杂交方法测定制备得到的重组AAV病毒(rAAV)的基因组滴度。具体过程如下：

在CAR-Mut启动子中设计两条引物CAR-Mut-F与CAR-Mut-R：

CAR-Mut-F：5’-GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGG-3’(SEQ ID NO:8)

CAR-Mut-R：5’-CCCATAAGGTCATGTACTGGGCAT-3’(SEQ ID NO:9)

以CAR-Mut-F与CAR-Mut-R为引物利用PCR法特异性地扩增CAR-Mut启动子得到长度为175bp的DNA探针片段，使用pscAAV-CAR-Mut-Gluc质粒及其2倍比梯度稀释液为标准品，将rAAV样品2倍比梯度稀释为检测样品。将标准品和检测样品点在杂交膜上，用探针对膜进行杂交。操作过程详见分子克隆实验指南(第四版)。使用ImigeJ软件灰度扫描，比较样品点与系列标准点的杂交信号，分析计算rAAV样品滴度。

(3)重组AAV病毒的体内功能活性表征

将携带CAR及CAR-Mut启动子的重组AAV载体注射小鼠后检测Gluc水平，以对启动子的功能活性进行表征。具体而言，6周龄C57 BL/6J野生小鼠共18只，随机分为3组。第1组小鼠尾静脉注射rscAAV9-CAR-Gluc，剂量为1×10

结果(图3A,B,C)显示在注射两种AAV载体后，小鼠各组织能够有效的表达Gluc，注射rscAAV9-CAR-MutC-Gluc的小鼠组织Gluc水平相比注射rscAAV9-CAR-Gluc在多种组织内表达水平均显著提升，其中心脏提升34.7％(图3A)，肝脏提升47.6％(图3B)，脑提升48.0％(图3C)。

实施例2.用于庞贝氏病治疗的重组AAV的构建

1.AAV质粒载体的构建

在本实施例中构建了包含目的基因GAA和目的基因表达调控元件、以及ITR序列的AAV质粒载体。

首先以pRDAAV-CMV-EGFP(图4A)为基础，用CAR-MutC启动子(SEQ ID No.1)替换pRDAAV载体中的CMV启动子，得到pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体(图4B)。pRDAAV-CMV-EGFP质粒载体包含：

i)来自AAV2基因组的ITR，序列如SEQ ID NO:5所示；

ii)组成型CMV启动子；

iii)表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的核苷酸序列；

iv)牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号BGH polyA；

v)来自AAV2基因组的ITR，序列如SEQ ID NO:5所示。

在CAR-MutC启动子序列(SEQ ID No.1)的两端分别添加XhoI和KpnI酶切位点。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入pUC57 simple载体(金斯瑞生物科技，南京)，得到pUC57-CAR-Mut。用XhoI和KpnI分别双酶切消化pUC57-CAR-Mut载体和pRDAAV-CMV-EGFP载体，回收CAR-Mut启动子片段和切去了CMV启动子的pRDAAV-CMV-EGFP载体片段(约6.9kb)，两片段连接后转化E.coli DH5α感受态细胞(擎科新业，北京)，筛选、鉴定后得到含有CAR-Mut启动子的AAV质粒载体pRDAAV-CAR-Mut-EGFP(图4B)。

接下来，将人工合成的密码子优化的人类GAA编码核苷酸序列(以下简称coGAA)克隆入pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体的KpnI和EcoRI酶切位点之间，得到pRDAAV-CAR-Mut-coGAA载体(图4C)。具体而言，由金斯瑞生物科技有限公司合成密码子优化的人类GAA基因的cDNA序列(coGAA，序列见SEQ ID No.10)，并在合成序列的coGAA序列上游加入KpnI酶切位点与Kozak序列5’-GCCACC-3’，在下游加入taa终止密码子及EcoRI酶切位点。合成后的序列克隆入pUC57 simple载体(金斯瑞生物科技，南京)，得到pUC57-coGAA载体。KpnI和EcoRI分别双酶切消化pUC57-coGAA载体和pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体，回收coGAA片段和去除了EGFP报告基因的pRDAAV-CAR-Mut-EGFP载体片段，两片段连接后转化E.coli DH5α感受态细胞(擎科新业，北京)，筛选、鉴定后得到pRDAAV-CAR-Mut-coGAA载体(图4C)。

接着，将人工合成的miR-142-3pT片段(包含串联的两个miR-142-3p靶序列，序列信息见SEQ ID No.12)克隆入pRD.AAV-CAR-Mut-coGAA载体的EcoRI和SalI酶切位点之间得到pRD.AAV-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P载体(图4D)。简言之，由北京擎科新业生物技术有限公司合成含有MicroRNA 142-3pT的oligo引物，退火后得到上游为EcoRI酶切位点，下游为SalI酶切位点的142-3pT片段。使用EcoRI和SalI消化pRDAAV-CAR-Mut-coGAA载体使其线性化，回收载体骨架与142-3pT片段连接后转化E.coli DH5α感受态细胞(擎科新业，北京)，筛选、鉴定后得到pRDAAV-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P载体(图4D)。

2.重组AAV病毒的制备与检定

(1)重组AAV病毒的包装

采用Bac-to-AAV系统包装AAV病毒。简要地，实施如下操作：Sf9细胞培养、转染制备及鉴定分别编码目的GAA基因和AAV-Rep2/Cap9的两个杆状病毒、扩增两个杆状病毒、以两个杆状病毒共感染Sf9细胞、收获Sf9细胞沉淀、裂解细胞释放AAV病毒、超速离心纯化AAV病毒、膜包脱盐浓缩AAV病毒及除菌过滤，以得到重组AAV病毒rAAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P。

包装过程可以采用在Chen H.Intron Splicing-mediated Expression of AAVRep and Cap Genes and Production of AAV Vectors in Insect Cells，[J].MolecularTherapy,the Journal of the American Society of Gene Therapy,2008,16(5):924和专利US8945918和CN101522903B中描述的方法进行。

(2)重组AAV病毒的滴度检测

采用实施例1中描述的点杂交方法，测定制备得到的rAAV基因组滴度。具体过程如下：

以CAR-Mut-F(SEQ ID NO:8)与CAR-Mut-R(SEQ ID NO:9)为引物利用PCR法特异性地扩增CAR-Mut启动子得到长度为175bp的DNA探针片段，使用pRDAAV-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P质粒及其2倍比梯度稀释液为标准品，将rAAV样品2倍比梯度稀释为检测样品。将标准品和检测样品点在杂交膜上，用探针对膜进行杂交。使用ImigeJ软件灰度扫描分析计算rAAV样品滴度。

3.庞贝氏病基因治疗重组AAV病毒的体外表达

将BHK-21细胞铺到6孔板中。细胞汇合度约80％时消化计数，根据计数结果以每个细胞50000病毒颗粒计算所需病毒量，将病毒与新鲜培养基混匀后加至对应孔板。37℃孵育。感染后6-8h用含1％血清的新鲜培养基替换含有病毒的培养基。继续培养48h后，消化收集细胞。采用反复冻融后离心的方式提取细胞总蛋白。利用Pierce BCA Protein AaasyKit(ThermoFisher,美国)分别测定转染了rAAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P的细胞及空白细胞的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。

在提取细胞总蛋白后，将上述提取的蛋白分别取10ul，使用4-MUG为底物在酸性条件下反应1h后检测荧光值(激发365nm，发射450nm)，根据标准曲线计算生成的4-MU浓度，进一步计算得到样品GAA蛋白酶活。(参见，邱文娟等，2010，干血滤纸片和白细胞酸性α-葡萄糖苷酶活性测定平台的建立及临床应用)

结果见图5。在BHK-21细胞中，GAA酶活性为65.62±7.49nmol/h/mg protein。而转染了rAAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P质粒的BHK-21细胞的GAA酶活性为113.60±4.19nmol/h/mg protein，是空细胞的1.73倍(**,p<0.01)。证明庞贝氏病基因治疗重组AAV可以在转导细胞后表达具有活性的GAA蛋白。

实施例3.庞贝氏病基因治疗重组AAV病毒在模型小鼠体内的有效性评价

实验1：

8-10周龄的GAA基因纯合缺失的模型小鼠(GAA-KO小鼠，购自Jax lab，编号004154)32只，随机平均分为4组。其中1组为模型对照组，作为阴性对照，每只单次IV注射200uL PBS；另外三组为低剂量组、中剂量组和高剂量组，其作为实验组分别单次IV注射剂量为5E12 vg/kg、1.1E13 vg/kg、3E13 vg/kg的rAAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P。另加入1组为野生对照组，以8只8-10周龄的129野生小鼠作为对照。注射后5周处死全部小鼠，解剖分离每只小鼠的心脏、肝脏、脾、肺、肾、及肌肉组织等。

取适量的不同组织，提取组织总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit(ThermoFisher,美国)分别测定各组的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。所有小鼠的不同组织均取5ul总蛋白用于测定GAA酶活力，结果见图6。

从图6可见，注射PBS的模型小鼠由于缺乏GAA蛋白，酶活力极低；而在重组AAV给药组中，经过IV单次注射后，rAAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P能够广泛转导小鼠的外周组织并表达具有活性的GAA蛋白，且随注射剂量的升高，各组织的酶活力呈剂量依赖性提高。

取部分组织，切成合适尺寸后用4％多聚甲醛浸泡固定，做好标记送至龙麦达斯有限公司用作病理分析。结果见图7。

图7A显示了，经AAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P病毒载体静脉治疗后5周，肝脏组织H&E染色结果。Gaa

图7B显示Gaa

图7C显示Gaa-/-模型小鼠在IV单次注射给药后的骨骼肌细胞H&E染色。PBS给药组的Gaa

图7D显示了在本实验前的探索性动物模型实验中Gaa

按照以实验1基本相似的方式，处理8-10周龄的GAA基因纯合缺失的模型小鼠。简言之，模型小鼠随机平均分为3组(每组5只)。其中1组作为阴性对照组，每只单次IV注射200uL PBS；另外两组作为实验组分别单次IV注射剂量为3E13 vg/kg和6.8E13 vg/kg的rAAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P。另加入1组8-10周龄的129野生小鼠作为对照。注射后5周处死全部小鼠，解剖分离每只小鼠的大脑组织、脊髓及小脑组织。

取部分组织，切成合适尺寸后用4％多聚甲醛浸泡固定，做好标记送至龙麦达斯有限公司用作病理分析。

AAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P单次静脉注射后的大脑组织PAS染色结果显示在图8A中。结果表明，庞贝模型动物的脑组织中，胶质细胞出现广泛的糖原累积，导致大面积出现PAS染色阳性的区域(左上图，黑色箭头)，野生型小鼠未见此类现象(右上图)。经重组AAV药物干预的庞贝模型小鼠随剂量的提升，有效的改善了胶质细胞糖原累积的现象，于6.8E+13vg/kg剂量时检测不到糖原累积的胶质细胞(左下图和右下图)。

AAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P单次静脉注射后的脊髓组织PAS染色结果显示在8B中。结果表明，庞贝模型动物脊髓前脚存在较多PAS糖原强阳性细胞，PAS阳性神经元比例相对较多(左上图)，说明模型动物的脊髓存在糖原累积的现象，这与模型动物相关文献结果相符。WT小鼠的脊髓前角运动神经元仅个别存在糖原强阳性(右上图)，说明前脚运动神经元偶有糖原代谢旺盛的细胞个体。重组AAV治疗后，3E+13vg/kg剂量组PAS阳性神经元比例出现小幅度改变，剂量提升至6.8E+13vg/kg时，脊髓运动神经元PAS强阳性数量明显下降，仅个别神经元存在PAS糖原阳性现象，与WT的特征近似(左下图和右下图)。

AAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P单次静脉注射后的小脑组织PAS染色结果显示在8C中。结果表明，庞贝模型动物小脑浦肯野细胞糖原累积不明显，但是浦肯野细胞周围的胶质细胞存在较明显的糖原颗粒累积情况，小脑髓质区有明显的糖原累积特征(左上图，白色箭头)。施用重组AAV干预后，3E+13vg/kg的小脑组织中，浦肯野周围糖原阳性细胞数量有下降趋势(左下图)。剂量提升至6.8E+13vg/kg后，未检测到糖原的累积情况(右下图)。

图8A-8C的结果显示，本发明重组AAV药物能有效改善神经系统(包括大脑、脊髓和小脑组织)的疾病所致的病理变化。这说明，本发明重组AAV药物在IV注射后具有剂量依赖的中枢神经糖原清除能力，可以穿越血脑屏障，纠正细胞内糖原代谢障碍。

取适量的不同组织，提取组织总蛋白。利用Pierce BCA Protein Aaasy Kit(ThermoFisher,美国)分别测定各组的总蛋白浓度，详细过程参考试剂盒说明书。所有小鼠的不同组织均取5ul总蛋白用于测定GAA酶活力，结果见图9。

如图9所示，6.8E+13vg/kg剂量组显著提升脑组织GAA酶活力水平。庞贝模型小鼠脑组织中的GAA酶活力阴性。AAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P单次静脉注射后，能够在脑组织中检测到高于模型对照7～8倍的GAA酶活力水平(n＝5,p＜0.001)。说明，重组AAV病毒能够经血液系统穿越血脑屏障，将GAA表达载体递送至中枢神经系统，成功表达具有活性的GAA酶。因此，本发明重组AAV药物对于改善庞贝中枢神经系统的酶缺乏特征具有针对性的纠正作用。

构建不带有miRNA-142靶序列的对照重组AAV9病毒AAV9-CAR-Mut-coGAA，并与带有miRNA-142靶序列的重组AAV9病毒AAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P，在治疗效果和血清抗体效价上进行了比较。

基本按照类似于实施例1和2的方式，在重组AAV9病毒给药后，检查了治疗效果。

血清抗药抗体效价采用如下方式检测。在AAV施用后5周后，处死小鼠并取血，分离血清后使用ELISA检测小鼠血清样品中抗GAA抗体的效价。

结果显示，带与不带miRNA-142靶序列对于治疗效果无显著差异；但携带miRNA-142靶序列的重组AAV9病毒在IV施用后，抗药抗体滴度有所下降，其中携带mi142靶序列的重组AAV病毒试验组的抗体滴度为1:800，而不携带mi142靶序列的对照组的抗体滴度大于1：6400，表明mi142靶序列的加入削弱了药物相关抑制物的水平，有助于诱导免疫耐受。

实验4

8-10周龄的GAA基因纯合缺失的模型小鼠(GAA-KO小鼠，购自Jax lab)16只，并随机平均分为2组。其中1组作为阴性对照组，每只单次IV注射200uL PBS；另外1组作为实验组单次IV注射剂量为1.1E13vg/kg的rAAV9-CAR-Mut-coGAA-2×142-3P。观察其生存情况，记录生存曲线。结果见图10。

如图10所示，Gaa

以上描述了本发明的示例性实施方案。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实施本申请的发明。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明的技术。