一种预防、辅助预防或治疗宫腔粘连形成的多肽AIUAP及其应用

摘要

本发明公开了一种预防、辅助预防宫腔粘连形成的多肽AIUAP及其应用。本发明的一种预防、辅助预防或治疗宫腔粘连形成的多肽AIUAP，其氨基酸序列为：TFGGAPGFPLGSPLSSPVFPR(SEQ ID NO.1)，该多肽由21个氨基酸组成。本发明所述的多肽AIUAP在制备预防、辅助预防或治疗宫腔粘连的药物中的应用。本研究利用串联质谱的方法筛选宫腔粘连组织和正常增生期子宫内膜组织中差异表达的内源性多肽，并发现在宫腔粘连组织中高表达的多肽AIUAP可以抑制纤维化的形成。由于AIUAP本身具有分子量小，自身来源，毒性小等特点，可能成为宫腔粘连防治的一种重要辅助药物。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种预防、辅助预防或治疗宫腔粘连形成的多肽AIUAP及其应用。

背景技术

IUA(Intrauterine adhesions，宫腔粘连)是由于妊娠或非妊娠因素所致子宫内膜损伤，正常内膜组织为纤维化组织所代替，从而引起月经量减少或闭经、周期性下腹痛，造成不孕、胚胎停止发育或习惯性流产等后果[1]，许多患者因此而永久丧失了生育能力，严重损害了妇女的生育能力与生活质量，IUA是目前临床棘手的妇科疾病。如何减少IUA的发生，改善IUA患者的生理和生育能力是临床面临的重要问题。

IUA临床病理特征主要是子宫内膜的纤维化，临床上IUA的治疗手段包括宫腔镜下冷刀或电刀剪开或切除粘连组织，恢复宫腔容积；术后口服雌激素，宫腔局部使用物理屏障及防粘连药物来预防再粘连的发生、促进子宫内膜的再生[2]。但对于重度IUA患者，现有临床治疗方法预后均欠佳，由于正常子宫内膜少、宫内环境差、粘连极易复发，患者很难成功自然受孕或接受移植胚胎。许多研究期望通过骨髓间充质、子宫内膜或胚胎干细胞移植来实现子宫内膜的修复再生，也有个别干细胞治疗后成功受孕的报道，但尚需克服干细胞成活率低、定向诱导分化困难和成瘤性等问题，临床上大规模应用尚存在诸多限制[3-5]。而抑制IUA的形成和复发又是促进子宫内膜再生的前提[6]，因此，从源头上预防、减少甚至逆转子宫内膜的纤维化具有重要意义。

目前IUA具体发病机制仍不明确，有关IUA的病因机制主要是纤维细胞增生活跃学说，即任何原因使子宫内膜基底层损伤均可致各种致纤维化因子大量产生，刺激成纤维细胞增生，大量ECM(Extracellular matrix，细胞外基质)过度沉积，进而导致纤维结缔组织增生、疤痕形成[7]。有关IUA机制研究已涵盖细胞因子[8-11]、细胞外基质相关因子[12-13]和非编码RNA[14-15]等多个方面，并获得了较多的研究进展，但目前尚无有效的临床应用。

随着多肽组学的不断发展，多肽药物已经成为医药研发的新热点。小分子多肽在纤维化研究方面已经有诸多报道，ECM基质成分Decorin在不同病理条件下可以形成不同的肽段，其中C端335-359区域的多肽可以和CTGF结合，抑制纤维化的形成，而N端42-71肽段可以通过抑制肌生成抑制蛋白，剂量依赖性的抑制Smad2/3的活性[16]；血浆内自然存在的抗纤维化多肽AcSDKP可以在肾小球系膜细胞中抑制Smad信号途径[17]；靶向CD206受体的新宿主防御肽(HDP)片段RP-832c可显著降低肺纤维化的效果，以及显著降低炎性细胞因子和纤维化标记物TGF-β1和MMP-13的表达[18]。这些结果表明，机体内确实存在功能性多肽分子参与调控纤维化的形成。多肽类药物因其具有毒性小、靶向性高、可以通过化学修饰控制其半衰期等特点，具有其他药物无法比拟的独特优势。但在IUA相关研究中，尚未见任何报道。因此，我们认为从多肽角度出发探讨IUA的发生机制，探索具有治疗前景的生物活性多肽具有很好的科学性和可行性。

参考文献

[1]March CM.Asherman's syndrome.Semin Reprod Med.2011；29(2):83-94.

[2]Gargett CE,Healy DL.Generating receptive endometrium in Asherman'ssyndrome.J Hum Reprod Sci.2011；4(1):49-52.

[3]Bosteels J,Weyers S,Kasius J,Broekmans FJ,Mol BWJ,D'HoogheTM.Anti-adhesion therapy following operative hysteroscopy for treatment offemale subfertility.Cochrane database of systematic reviews(Online),2015；11(11):CD011110.

[4]Jing Z,Qiong Z,Yonggang W,Yanping L.Rat bone marrow mesenchymalstem cells improve regeneration of thin endometrium in rat.FertilSteril.2014；101(2):587-594.

[5]Nagori CB，Panchal SY，Patel H.Endometrial regeneration usingautologous adult stem cells followed by conception by in vitro fertilizationin a patient of severe Asherman’s syndrome.J Hum Reprod Sci.2011；4(1):43-48.

[6]Ye L，Mayberry R,Lo CY,Britt KL,Stanley EG,Elefanty AG,GargettCE.Generation of human female reproductive tract epithelium from humanembryonic stem cells.PLoS One.2011；6(6):e21136.

[7]March CM.Management of Asherman’s syndrome.ReproductiveBiomedicine Online,2011；23(1):63-76.

[8]Li J,Cen B,Chen S,He Y.MicroRNA-29b inhibits TGF-β1-inducedfibrosis via regulation of the TGF-β1/Smad pathway in primary humanendometrial stromal cells.Mol Med Rep.2016；13(5):4229-4237.

[9]Hu J,Zeng B,Jiang X,Hu L,Meng Y,Zhu Y,Mao M.The expression ofmarker for endometrial stem cell and fibrosis was increased in intrauterineadhesious.Int J Clin Exp Pathol.2015；8(2):1525-1534.

[10]Zhu Y,Hu J,Yu T,Ren Y,Hu L.High Molecular Weight Hyaluronic AcidInhibits Fibrosis of Endometrium.Med Sci Monit.2016；22:3438-3445.

[11]Wang X,Ma N,Sun Q,Huang C,Liu Y,Luo X.Elevated NF-κB signaling inAsherman syndrome patients and animal models.Oncotarget.2017；8(9):15399-15406.

[12]Hu S,Li Y,Meng WJ,Tan SQ.Effects of Fukang oral liquid on theprevention of intrauterine adhesion and expressions of TGF-beta1,PAI-1andMMP-9in endometrium of rats.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban.2013；44(4):540-544.

[13]Ries C.Cytokine functions of TIMP-1.Cell Mol Life Sci.2014；71(4):659-672.

[14]Liu X,Duan H,Zhang HH,Gan L,Xu Q.Integrated Data Set of microRNAsand mRNAs Involved in Severe Intrauterine Adhesion.Reprod Sci.2016；23(10):1340-1347.

[15]Ning J,Zhang H,Yang H.MicroRNA-326inhibits endometrial fibrosisby regulating TGF-β1/Smad3 pathway in intrauterine adhesions.Mol MedRep.2018；18(2):2286-2292.

[16]Vial C,Gutiérrez J,Santander C,Cabrera D,Brandan E.Decorininteracts with connective tissue growth factor(CTGF)/CCN2 by LRR12 inhibitingits biological activity.J Biol Chem.2011；286(27):24242-24252.

[17]Kanasaki K,Koya D,Sugimoto T,Isono M,Kashiwagi A,Haneda M.N-Acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline inhibits TGF-beta-mediated plasminogenactivator inhibitor-1expression via inhibition of Smad pathway in humanmesangial cells.J Am Soc Nephrol.2003；14(4):863-872.

[18]Ghebremedhin A,Salam AB,Adu-Addai B,Noonan S,Stratton R,AhmedMSU,Khantwal C,Martin GR,Lin H,Andrews C,Karanam B,Rudloff U,Lopez H,JaynesJ,Yates C.A Novel CD206 Targeting Peptide Inhibits Bleomycin InducedPulmonary Fibrosis in Mice.bioRxiv[Preprint].2020；2020.07.27.218115.

发明内容

本发明的目的是针对临床宫腔粘连诊治中、现有防粘连措施的不足，提供一种用于预防或辅助预防宫腔粘连形成的多肽AIUAP(anti-intrauterine adhesion peptide)。

本发明的另一目的是提供该该多肽AIUAP的应用。

本发明的一种预防、辅助预防或治疗宫腔粘连形成的多肽AIUAP，其氨基酸序列为：TFGGAPGFPLGSPLSSPVFPR(SEQ ID NO.1)，该多肽由21个氨基酸组成。

本发明所述的多肽AIUAP在制备预防、辅助预防或治疗宫腔粘连的药物中的应用。

一种用于预防、辅助预防或治疗宫腔粘连的药物组合物，其特征在于含有本发明所述的多肽AIUAP。

本发明所述的多肽AIUAP可作为研发其他纤维化相关疾病治疗药物的潜在靶点。

有益效果

本研究利用串联质谱的方法筛选宫腔粘连组织和正常增生期子宫内膜组织中差异表达的内源性多肽，并发现在宫腔粘连组织中高表达的多肽AIUAP可以抑制纤维化的形成。由于AIUAP本身具有分子量小，自身来源，毒性小等特点，可能成为宫腔粘连防治的一种重要辅助药物。

附图说明

图1.两组肽段的总体情况

A：检测到的肽段数量；B：检测到的唯一性肽段数量；C：肽段的长度分布柱状图；D：肽段的分子量分布柱状图；E：肽段的等电点分布柱状图

图2.IUA和正常子宫内膜组织中差异表达多肽火山图

红点显示IUA组织中显著表达上调的多肽；绿点显示IUA组织中显著表达下调的多肽。

图3.差异表达多肽的位点分析

A：上调和下调多肽在C端和N端的酶切位点，每个系列从左至右分别代表上调肽的c末端氨基酸、上调肽的N末端氨基酸、下调肽的c末端氨基酸、下调肽的N末端氨基酸；B：含多肽数量最多的前十位前体蛋白。

图4.不同肽处理的子宫内膜间质细胞中纤维化相关标记物的基因和蛋白质表达。A：对照组和各肽治疗组子宫内膜间质细胞中α-SMA、COL1A1、VIM、CTGF、N-钙粘蛋白和FN的相对基因表达水平。B：对照组和T1-T6治疗组子宫内膜间质细胞中α-SMA和COL1A1的相对蛋白表达水平。C：对照组和T1–T6治疗组子宫内膜间质细胞中COL1A1的免疫组化染色。

图5.不同浓度的AIUAP对子宫内膜间质细胞纤维化基因和蛋白质表达的影响。A：对照组和不同浓度AIUAP处理组子宫内膜间质细胞中α-SMA、COL1A1、VIM、CTGF、N-钙粘蛋白和FN的相对基因表达水平。B：对照组和不同浓度AIUAP处理组子宫内膜间质细胞中α-SMA和COL1A1的相对蛋白表达。C：对照组和不同浓度AIUAP处理组子宫内膜间质细胞中α-SMA的免疫荧光染色。

具体实施方案

实施例1：IUA差异内源性多肽的筛选

1.1样本收集：选择南京医科大学附属妇产医院住院的患者，获取重度IUA组织和因宫颈病变行全子宫切除患者的增生期子宫内膜组织各三例。于手术室冷刀收集IUA及正常增生期全层内膜组织，组织离体后立即置于冰盒，修剪为约5mm*5mm*5mm大小，随后立即转移置于-80℃液氮中保存。本研究已经过南京医科大学附属妇产医院伦理委员会批准并征得患者书面知情同意。

1.2肽提取：将样品组织放置于研钵中，在液氮条件之下将组织研磨成粉末状；将收集的粉末放置于管中，随后加入50％蛋白裂解液，混匀之后放置于冰上孵育5min；加入终浓度为l0 mM的DTT，冰浴超声15min；4℃、13,000rpm离心30min，取上清液转入新的离心管中；向离心管中加入DTT至终浓度为10mM，56℃水浴进行还原反应30min；加入IAM至终浓度为55mM，避光室温放置进行烷基化反应30min；用10kD的超滤管处理，4℃、10,000rpm离心30min，收集到的穿透液即为多肽样品。

1.3质谱分析：质谱数据采集使用的是：TripleTOF 5600+液质联用系统(SCIEX)。将多肽样品溶解于2％乙腈/0.1％甲酸中，随后使用跟Eksigent nanoLC系统(SCIEX，USA)偶联的TripleTOF 5600plus质谱仪进行系统分析。将多肽溶液加到C18捕获柱上，并以90min为时间梯度，流速设置为300nL/min，在C18分析柱上进行梯度洗脱。两个流动相分别是是缓冲液A(2％乙腈/0.1％甲酸/98％H2O)与缓冲液B(98％乙腈/0.1％甲酸/2％H2O)。IDA(信息依赖性采集)，以250ms离子累积时间对一级质谱图进行扫描，同时以50ms离子累积时间对30个前体离子的二级质谱图进行采集。在350-1500m/z范围内采集MS1光谱，并且在100-1500m/z范围内采集MS2光谱，将前体离子动态排除时间设置为15s。将质谱检测过的数据与数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配，从而得到蛋白质鉴定结果。IUA和正常内膜组织两组共鉴定到786个前体蛋白的5416条肽段，肽段长度主要分布于10-30AA，平均长度为19.25AA；分子量主要位于1000-4000Da之间；多肽等电点3-14、主要分布在4-5。共有155个前体蛋白的321个肽段差异表达，在IUA组织中有56个前体蛋白的70个肽段表达上调、120个前体蛋白的251个肽段表达下调(图1-3和表1)。

表1

实施例2：差异内源性多肽的功能验证

2.1肽合成：筛选出的多肽均由江苏金斯瑞生物科技有限公司合成，纯度均≧95％，均为标准型转醋酸盐、未修饰。多肽以20mM溶解于灭菌水中，并根据实验需要稀释至10μM、20μM、50μM和100μM。

2.2细胞系：hESC(Human endometrial stromal cells，人子宫内膜间质细胞)由上海信裕生物科技有限公司提供。细胞培养条件如下：培养液：DMEM不完全高糖培养液(1×)+10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)+1％双抗；消化液：0.25％Trypsin-EDTA(1×)；冻存液：FBS：二甲亚砜(DMSO)＝9：1。

2.3差异内源性多肽分析

我们通过生物信息学分析，进一步分别对升高或降低表达、特异表达的差异内源性多肽进行筛选，选出了与纤维化最为密切的6条内源性多肽，多肽详细信息见表2。其中肽1(T1)、肽2(T2)和肽3(T3)在IUA组织中特异性下调；肽4(T4)在IUA组织中下调；而肽5(T5)和肽6(T6)则在IUA组织中上调。

表2

2.4内源性多肽的功能验证：我们将筛选出的6条多肽通过化学合成，并将其(终浓度50μM)分别与TGF-β1(终浓度5ng/ml)及hESC共培养48h，通过qRT-PCR、免疫组织化学染色和Western blot，从基因和蛋白两个水平来评价内源性多肽对子宫内膜间质细胞纤维化的作用效果。结果显示，与对照组相比，T6处理的子宫内膜间质细胞，纤维化相关指标α-SMA、COL1A1、VIM、N-cadherin、FN在基因水平均明显下调、差异有统计学意义，CTGF表达下降，差异无统计学意义；α-SMA、COL1A1在蛋白水平的表达也明显降低，且在6条多肽中下调纤维化指标最为显著(见图4)。DESM来源的内源性多肽T6尚未见任何功能报道，为便于后续研究，我们将这条DESM来源的内源性多肽命名为AIUAP。

实施例3：不同浓度AIUAP对子宫内膜间质细胞纤维化的抑制效果

将不同浓度(终浓度20μM、50μM、100μM)AIUAP及AIUAP的乱序肽(肽氨基酸序列：PGSGRFPGLSTLPFVAGPSPF，终浓度100μM)分别与TGF-β1(终浓度5ng/ml)及hESC共培养72h，通过qRT-PCR，从RNA水平来评价不同浓度内源性多肽AIUAP对子宫内膜间质细胞纤维化相关指标的影响。结果显示，肽浓度为50μM时，纤维化相关指标α-SMA、COL1A1、VIM、CTGF、N-cadherin和FN的相对表达量均明显下降，与对照组比差异有统计学意义。而肽浓度为20μM或100μM时，α-SMA、VIM、CTGF、N-cadherin和FN的相对表达量与对照组比无明显下降，差异无统计学意义。将不同浓度(终浓度10μM、20μM、50μM、100μM)AIUAP及AIUAP的乱序肽(PGSGRFPGLSTLPFVAGPSPF，终浓度100μM)分别与TGF-β1(终浓度5ng/ml)及hESC共培养72h，通过Western blot和组织免疫荧光染色，从蛋白水平评价不同浓度内源性多肽AIUAP对子宫内膜间质细胞纤维化相关指标的影响。结果显示，与对照组相比，20μM、50μM和100μMAIUAP处理组α-SMA的蛋白表达明显降低，差异有统计学意义，且100μM AIUAP浓度组降低最为明显；而COL1A1蛋白的表达在50μM AIUAP处理组明显降低，差异有统计学意义；10μM、20μM和100μM AIUAP浓度组COL1A1蛋白表达无明显差异(图5)。

序列表

<110> 南京市妇幼保健院

<120> 一种预防、辅助预防或治疗宫腔粘连形成的多肽AIUAP及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Phe Gly Gly Ala Pro Gly Phe Pro Leu Gly Ser Pro Leu Ser Ser

1 5 10 15

Pro Val Phe Pro Arg

20