细胞培养物、细胞培养物的评价方法、细胞培养物的制作方法以及软骨样组织形成特性评价用的标志物

摘要

本申请提供一种适用于软骨修复的细胞培养物。本申请提供一种具有软骨样组织形成特性的细胞培养物，该细胞培养物所包含的细胞群为选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO‑1、CD108、CD164、CD6、CD106和CD107b所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各细胞表面标志物各自的阈值以下，和/或选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a和CD90所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各细胞表面标志物各自的阈值以上。

说明书

技术领域

本申请涉及一种细胞培养物、细胞培养物的评价方法、制备细胞培养物的方法以及评价软骨样组织形成特性的标志物。更详细地，本申请涉及包含表达特定细胞表面标志物之细胞群的细胞培养物、基于特定细胞表面标志物的细胞培养物评价方法、包含表达特定细胞表面标志物之细胞群体的细胞培养物的制作方法，以及用于评估软骨样组织形成特性的特定细胞表面标志物。

背景技术

针对变形性骨关节病等运动器官疾病的治疗，实施利用组织重策划技术的软骨组织治疗。在这种治疗中，可以将培养的软骨细胞或利用软骨细胞形成的软骨组织移植到患处。迄今为止已有各种移植材料被提出。

例如下述专利文献1中记载：“一种移植到预定的移植部位的移植用材料，为将预定的移植部位相对应的细胞保持在细胞保持载体中，该细胞保持载体为取自于自体组织与前述预定移植部位同种的组织结构物、维持着该组织结构物的形状并施行抗原抑制处理而获得”(权利要求1)。

(现有技术文献)

专利文献1：日本专利公开No.2003-180819。

发明内容

(发明所要解决的问题)

本申请的主要目的是提供一种适用于软骨修复的细胞培养物，尤其是提供一种适用于透明软骨(hyaline cartilage)修复的细胞培养物。

(解决问题的技术手段)

本申请的发明人发现具有特定特征的细胞培养物适用于软骨修复，尤其适用于透明软骨修复。

即，本申请提供一种具有软骨样组织形成特性的细胞培养物，所述细胞培养物所包含的细胞群为选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106以及CD107b所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各细胞表面标志物的阈值以下，和/或选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a以及CD90所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各细胞表面标志物的阈值以上。

此外，本申请还提供一种细胞培养物的评价方法，包括判定工程；前述判定工程针对细胞培养物所包含的细胞群体，判定选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106以及CD107b所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各细胞表面标志物的阈值以下，和/或判定选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a和CD90所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各表面标志物的阈值以上。

此外，本申请还提供一种具有软骨样组织形成特性的细胞培养物的制备方法，包括培养细胞以获得细胞培养物的培养步骤；在所述培养步骤中，关于所述细胞培养物所包含的细胞群体，为选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106和CD107b所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各细胞表面标志物各自的阈值以下，和/或选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a和CD90所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各细胞表面标志物各自的阈值以上的方式进行培养。

此外，本申请还提供一种用于评价软骨样组织形成特性的标志物，其包含选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106和CD107b所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物，和/或包含选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a和CD90所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物。

(发明的有益效果)

根据本申请可提供适用于软骨修复，尤其是适用于透明软骨修复用途的细胞培养物。此外，根据本申请，还可以评价细胞培养物的软骨修复能力，特别是评价透明软骨修复能力。

附图说明

图1为实验流程图。

图2为显示COL2A1和COL1A1的基因表达比的图。

图3为显示番红O染色结果的图。

具体实施方式

1.细胞培养物

本申请提供一种具有软骨样组织形成特性的细胞培养物，更尤其是提供一种具有透明软骨样组织形成特性的细胞培养物。前述细胞培养物所包含的细胞群体可以是选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106和CD107b所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各细胞表面标志物的阈值以下，和/或选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a和CD90所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各细胞表面标志物的阈值以上。由于这些细胞表面标志物在预定的阈值以上或者阈值以下，使得所述细胞培养物适用于软骨修复，更特别适用于膝软骨修复。

本申请的细胞培养物具有形成软骨样组织的特性，尤其是具有形成透明软骨样组织的特性。例如，当移植到活体人体时(尤其是移植到活体人体膝的关节软骨部分时)，本申请的细胞培养物具有软骨样组织形成特性(尤其是具有形成透明软骨样组织的特性)。在本说明书中，所谓的“软骨样组织”是指具有与软骨组织(尤其是膝软骨组织)同等或相同的组成和/或功能的组织，例如，与透明软骨组织相同表达II型胶原蛋白的组织。

本申请中，可选所述细胞表面标志物中，至少CD99和/或GD2的表达强度低于这些细胞表面标志物的阈值。由于CD99和/或GD2的表达强度低于预定阈值，细胞培养物可以表现出特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是透明软骨样组织形成特性。

此外，本申请中，可选所述细胞表面标志物中，至少CD26和/或CD73的表达强度为这些细胞表面标志物各自的阈值以上。由于CD26和/或CD73的表达强度高于预定阈值，细胞培养物可以发挥特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是发挥透明软骨样组织形成特性。

特别可选地，在所述细胞表面标志物中，至少CD99和/或GD2的表达强度低于这些细胞表面标志物各自的阈值，并且在所述细胞表面标志物中，至少CD26和/或CD73的表达强度高于这些细胞表面标志物各自的阈值。由于这4种细胞表面标志物满足所述阈值的标准，细胞培养物能够发挥特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是发挥透明软骨样组织形成特性。

此外，本申请中，可选所述细胞表面标志物中，至少CD26、CD73以及CD44中的任意一种、任意两种或任意三种的表达强度为这些细胞表面标志物各自的阈值以上。由于CD26、CD73以及CD44中的任意一种、任意两种或任意三种的表达强度高于预定阈值，细胞培养物可以发挥特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是发挥透明软骨样组织形成特性。

可选地，在所述细胞表面标志物中，至少CD99和/或GD2的表达强度低于这些细胞表面标志物各自的阈值，并且在所述细胞表面标志物中，至少CD26、CD73和CD44之中的任意一种、任意两种或任意三种的表达强度高于这些细胞表面标志物各自的阈值。由于这4种细胞表面标志物满足所述阈值的标准，细胞培养物能够发挥特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是发挥透明软骨样组织形成特性。

本申请的一个可选实施例中，所述细胞表面标志物中，至少CD44的表达强度高于该细胞表面标志物的阈值。由于CD44的表达强度高于预定阈值，细胞培养物可以表现出特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是透明软骨样组织形成特性。

可选地，在所述细胞表面标志物中，至少CD99和/或GD2的表达强度低于这些细胞表面标志物各自的阈值，并且在所述细胞表面标志物中，至少CD44的表达强度高于该细胞表面标志物的阈值。由于这3种细胞表面标志物满足所述阈值的标准，细胞培养物可以发挥出特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是透明软骨样组织形成特性。

本申请中，细胞表面标志物的表达强度可以是通过流式细胞术分析细胞群测定标准化平均荧光强度(nMFI，normalized Mean Fluorescence Intensity)。该标准化平均荧光强度适用于基于这些细胞表面标志物的软骨样组织形成特性的评价，尤其适用于透明软骨样组织形成特性的评价。标准化平均荧光强度可以通过后述的“5.实施例”中所记载的测定方法来测定。

本申请的细胞培养物，可选通过流式细胞仪分析该细胞培养物所包含的细胞群时所测定的标准化平均荧光强度为满足以下条件1至10中至少一项、和/或满足下列条件11至20中至少一项。

条件1：通过结合有PE的抗CD166抗体标记所述细胞群时，来源于所述PE的标准化平均荧光强度为240以下，可选为220以下，可选为200以下；条件2：通过结合有BB700的抗CD165抗体标记所述细胞群时，源自所述BB700的标准化平均荧光强度为132以下，可选为120以下，可选为110以下；条件3：通过结合有FITC的抗CD99抗体标记所述细胞群时，来自所述FITC的标准化平均荧光强度为1.9以下，可选为1.8以下，可选为1.6以下；条件4：通过结合有BB700的抗GD2抗体标记所述细胞群时，源自所述BB700的标准化平均荧光强度为3.6以下，可选为3.3以下，可选为3.0以下；条件5：通过结合有FITC的抗STRO-1抗体标记所述细胞群时，源自所述FITC的标准化平均荧光强度为1.4以下，可选为1.3以下，可选为1.2以下；条件6：通过结合有PE的抗CD108抗体标记所述细胞群时，源自所述PE的标准化平均荧光强度为1.9以下，可选为1.8以下，可选为1.6以下；条件7：通过结合有PE的抗CD164抗体标记所述细胞群时，源自所述PE的标准化平均荧光强度为3.0以下，可选为2.8以下，可选为2.5以下；条件8：通过结合有FITC的抗CD6抗体标记所述细胞群时，源自所述FITC的标准化平均荧光强度为1.4以下，可选为1.3以下，可选为1.2以下；条件9：通过结合有FITC的抗CD106抗体标记所述细胞群时，源自所述FITC的标准化平均荧光强度为2.4以下，可选为2.2以下，可选为2.0以下；条件10：通过结合有FITC的抗CD107b抗体标记所述细胞群时，源自所述FITC的标准化平均荧光强度为2.0以下，可选为1.9以下，可选为1.7以下；条件11：通过结合有FITC的抗CD26抗体标记所述细胞群时，源自所述FITC的标准化平均荧光强度为2.3以上，可选为2.6以上，可选为2.9以上；条件12：通过结合有FITC的抗CD73抗体标记所述细胞群时，源自所述FITC的标准化平均荧光强度为47以上，可选为53以上，可选为59以上；条件13：通过结合有PE的抗CD105抗体标记所述细胞群时，源自所述PE的标准化平均荧光强度为21以上，可选为24以上，可选为27以上；条件14：通过结合有FITC的抗CD44抗体标记所述细胞群时，源自于所述FITC的标准化平均荧光强度为128以上，可选为145以上，可选为160以上；条件15：通过结合有APC的抗CD120a抗体标记所述细胞群时，源自于所述APC的标准化平均荧光强度为24以上，可选为27以上，可选为30以上；条件16：通过结合有PE的抗CD201抗体标记所述细胞群时，源自于所述PE的标准化平均荧光强度为18以上，可选为20以上，可选为23以上；条件17：通过结合有PE的抗EGFR抗体标记所述细胞群时，源自于所述PE的标准化平均荧光强度为3.2以上，可选为3.6以上，可选为4.0以上；条件18：通过结合有FITC的抗CD146抗体标记所述细胞群时，源自所述FITC的标准化平均荧光强度在1.6以上，可选为1.8以上，可选为2.0以上；条件19：通过结合有PE的抗CD140a抗体标记所述细胞群时，源自于所述PE的标准化平均荧光强度为5.6以上，可选为6.4以上，可选为7.0以上；条件20：通过结合有APC的抗CD90抗体标记所述细胞群时，源自于所述APC的标准化平均荧光强度为800以上，可选为900以上，可选为1000以上。

通过满足所述任一或多个条件，本申请的细胞培养物具有更好的软骨样组织形成特性，尤其是具有透明软骨样组织形成特性。

可选的是，通过流式细胞仪分析所述细胞群时测定的标准化平均荧光强度为满足所述条件3和/或条件4，和/或满足所述条件11和/或条件12。可选地，通过流式细胞仪分析所述细胞群时测定的标准化平均荧光强度满足所述条件3和条件4，并且满足所述条件11和/或条件12。满足这四个条件中的一个、两个、三个或所有四个，特别是满足所有四个，为本申请的细胞培养物带来特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是带来透明软骨样组织形成特性。

在本申请的一个实施例中，通过流式细胞仪分析所述细胞群时测定的标准化平均荧光强度满足所述条件3和/或条件4，和/或满足所述条件11、条件12及条件14中的1项，2项或3项。可选地，通过流式细胞仪分析所述细胞群时测定的标准化平均荧光强度满足所述条件3和条件4，并且满足所述条件11、条件12和条件14。满足这5个条件中的1项、2项、3项、4项或全部5项，尤其是满足所有5项，为本申请的细胞培养物带来特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是带来透明软骨样组织形成特性。

在本申请的一个实施例中，通过流式细胞仪分析所述细胞群时测定的标准化平均荧光强度满足所述条件3和/或条件4，和/或满足所述条件14。可选地，通过流式细胞仪分析所述细胞群时测定的标准化平均荧光强度满足所述条件3和条件4，并且满足所述条件14。满足这三个条件中1一项、2项或所有3项为本申请的细胞培养物带来特别良好的软骨样组织形成特性，尤其是带来透明软骨样组织形成特性。

[细胞培养物的形状]

根据本申请的一个实施例，所述细胞培养物可以是固状。例如，该细胞培养物所包含的细胞群可以任何形状组织化。所述固状细胞培养物的形状可以是，例如片状、粒状、纤维状(丝状)或网状(网眼状)。

根据本申请的其他实施例，前述细胞培养物可以不是固状的，例如为可流动的。非固状的所述细胞培养物，例如可以是流体状、液状或凝胶状。

本申请的细胞培养物可选为片状。片状细胞培养物特别适用于软骨组织修复，尤其适用于透明软骨组织修复。在所述细胞培养物为片状的情况下，片状细胞培养物的厚度例如可以为4μm至5mm，特别是4μm至3mm，更特别是4μm至1mm。片状细胞培养物可以是1片的片状细胞培养物，再者，，亦可以是多片(例如2片至10片，特别是2片至8片，更特别是2片至5片)的片状细胞培养物的层叠物。

更进一步，片状细胞培养物的厚度例如可以为4μm至100μm，可选为4μm至70μm，可选为4μm至50μm。

本申请的片状细胞培养物可为细胞增殖步骤中细胞的自然多层化而形成。本申请的片状细胞培养物亦可为将分别制作的2个或2个以上的片状细胞培养物人为层叠并继续培养而得到。

[来源于软骨组织的细胞培养物]

在本申请的一个实施方式中，所述细胞培养物可以来源于软骨组织。亦即，所述细胞培养物可以是来自软骨组织的细胞的培养物，特别是用于获得所述细胞培养物的培养所使用的原料细胞可以是来自软骨组织的细胞。所述细胞培养物是通过体外人工培养而获得，故并非天然产物。来自软骨组织的细胞可以是，例如通过从软骨基质中分离包含在软骨组织中的细胞而获得的多个细胞。例如，软骨组织来源的细胞可以是通过下述方法回收的复数细胞：用消化酶处理软骨组织使软骨组织中的细胞从软骨基质中游离，然后将游离的细胞通过离心分离回收。

所述细胞培养物可选非来源于滑膜。亦即，所述细胞培养物可选不含来自滑膜的细胞。所述细胞培养物可选不是由来自滑膜的细胞的培养物所形成，也不是由滑膜细胞的培养物所形成。本申请的细胞培养物可选为仅来源于软骨组织的细胞的培养物，特别是仅来源于透明软骨组织的细胞的培养物。

在本申请中，所述来源于软骨组织的细胞可以是来源于多指症(polydactylism)动物的软骨组织，也可以是来源于多肢症(polymelism)动物的软骨组织。该动物可选为哺乳动物，可选为灵长类动物，进而可选为人类。该软骨组织可取自于例如赘生指切除手术时所获得的组织。该组织可以是，例如当用伦琴射线(X射线)拍摄时不显影成白色的部分(亦即显影成黑色穿透的部分)。多指畸形可以是末节骨型、中节骨型或基节骨型中的任一种。赘生指也可以是任何一指，例如拇指或小指。当采集到的赘生指(肢)为疣状且较小时，采集的皮下组织均可使用。当该动物为人时，人的年龄不受限制，例如可以为5岁以下、3岁以下或2岁以下。

所述消化酶处理中使用的酶的实例包括胶原蛋白酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶、玻糖醛酸苷酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶和分散酶。可选可以使用这些酶的组合。酶的可选组合例为，例如胶原蛋白酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶的组合。含有该组合的酶制剂的例子包括Ⅰ型胶原蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶、Ⅲ型胶原蛋白酶、Ⅳ型胶原蛋白酶和Ⅴ型胶原蛋白酶(均可购自Fujifilm Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，但不限于这些。此外，酶的可选组合的其他例为，例如胶原蛋白酶和分散酶或嗜热菌蛋白酶的组合。作为含有该组合的酶制剂，例如可以例举释放酶(liberase)(可购自Roche DiagnosticsCo.,Ltd.)，但不限于此。此外，根据组织的状态，亦可通过多种酶，分阶段进行酶消化处理。例如，也可以通过用胶原蛋白酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶依序处理来进行分离。酶处理的条件可以由本申请本技术领域人员根据所使用的酶的种类和/或软骨组织的状态适当确定。酶处理例如可以在30℃至50℃、可选33℃至45℃、35℃至40℃，进行例如1小时至12小时、可选2小时至5小时。当酶处理温度过高时，可能会出现细胞变性、活细胞减少、增殖能力下降、无法分离等问题。另外，当酶处理温度过低时，可能发生无法达到充分的酶活性，细胞无法分离的情况。在酶处理时，通过增加物理刺激可以实现高效率的细胞回收。

所述酶反应可以通过洗涤正在进行酶处理的关节软骨的细胞悬液对其进行稀释而停止。酶反应停止后，该细胞悬液可通过离心分离分为细胞块和上清液。关于Liberase酶，可以通过两次以上的洗涤来停止酶反应。所述离心可在能收集更多25μm以下细胞，尤其是20μm以下至15μm以上的细胞的条件下进行。为了收集更多这样的细胞，该离心分离可在例如1000rpm以上、1500rpm以上、或2000rpm以上进行例如5分钟以上、7分钟以上、或10分钟以上。

所述来源于软骨组织的细胞也可以通过所谓outgrowth法获得。Outgrowth法可以包括：将收集到的软骨组织切碎的步骤；将切碎的软骨组织片与少量培养基一起接种到培养皿并进行培养的步骤。通过这种培养，生成了从软骨组织片增殖而来的细胞。该生成的细胞通过酶处理和离心分离而回收。该回收的细胞可用于制造本申请的细胞片。

所述的软骨组织切碎工序例如可以在湿润状态下进行。该工序例如可以将组织块和少量培养基置于50ml离心管中，并用Metzenbaum Scissors,SuperCut TungstenCarbide 18cm Long Curve(World Precision Instruments公司)将其剪碎来执行该步骤。可选获得尽可能小的软骨组织块。此外，用于培养经切碎的软骨组织块的培养基可由在本申请的技术领域中具备常规知识者适当地选择，可选为DMEM/F12+20％FBS+抗生素(以下也称为AB)。培养开始后确认细胞附着于培养皿后，可选将培养基更换为DMEM/F12+20％FBS+AB+抗坏血酸(以下也称为AA)。当培养基从培养开始就含有抗坏血酸时，细胞与培养皿的粘附会受到阻碍。此外，所述培养也可以在一般的培养条件下进行，例如可以在37℃、5％CO

在本申请中，前述来源于软骨组织的细胞可以可选包含间充质干细胞。除了间充质干细胞之外，所述来源于软骨组织的细胞还可以包括软骨组织中所含的细胞。即，在本申请中，所述来自软骨组织的细胞可以是包含间充质干细胞在内的多种细胞的细胞群。间充质干细胞以外的细胞的例子包括，例如软骨细胞和软骨胚细胞，但不限于这些。本申请的细胞培养物由所述软骨组织来源的细胞培养物形成，更适合于软骨的修复。

[源自干细胞的细胞培养物]

在本申请的其他实施方式中，所述细胞培养物也可以来源于干细胞。前述干细胞可包括多能干细胞、胚胎干细胞或成体干细胞，例如也可包含iPS细胞(inducedpluripotent stem cell；诱导多能干细胞)。

在该实施方案中，本申请的细胞培养物可以通过下述方式获得：例如将多能干细胞(尤其是iPS细胞)在培养基中进行培养，使其分化从而获得软骨细胞或类似软骨细胞，进而将该软骨细胞或类似软骨细胞在固定化有，例如刺激响应聚合物(stimuli responsivepolymer)的培养表面上进行培养。本申请的细胞培养物也可以通过下述方式获得：将例如多能干细胞(特别是iPS细胞)接种在固定化有刺激响应聚合物的基材上，使之分化成软骨细胞或类似软骨细胞来进行培养。

[细胞培养的用途]

本申请的细胞培养物可以是用于修复软骨组织而使用的细胞培养物，可选为用于修复膝软骨组织而使用的细胞培养物，可选为用于修复膝透明软骨组织而使用的细胞培养物。本申请的细胞培养物为具有软骨样组织形成特性，特别是具有透明软骨样组织形成特性，故适用于所述修复。

在本申请中，所谓的软骨组织修复包括但不限于治疗有炎症和/或损伤的软骨组织、补强软骨组织、填补软骨组织的缺损、以及软骨组织的再生。此外，本申请的细胞培养物也可以用于软骨组织相关疾病的预防。本申请的细胞培养物可以施用于例如患有疾病的软骨组织或骨组织。应用本申请的细胞培养物的疾病的实例包括但不限于关节炎、关节病、软骨损伤、骨软骨损伤、半月板损伤和/或椎间盘退化。

本申请的细胞培养物更特别适用于软骨组织的外科处置，尤其适用于外科治疗。通过本申请的细胞培养物进行的软骨修复可以通过例如经由外科处置使待修复的软骨部分暴露，并将细胞培养物施用于该暴露的部分来进行。

例如，可以将片状的本申请的细胞培养物施用于该露出部分。施用的片状细胞培养物的数量和大小可以由本申请所属技术领域人员考虑，例如待处理部分的状态或疾病类型等而适当决定。此外，本申请的片状细胞培养物可选在给予片状细胞培养物之前，以从软骨下硬骨确认出血的方式来处理软骨下硬骨。该处理可以让本申请所属领域的具备常规知识者用已知的方式进行，例如可通过微裂缝(microfracture)或钻孔来进行。通过进行该处理，可进一步促进本申请的片状细胞培养物对软骨的修复。

当将本申请的片状细胞培养物施用于患处时，也可以通过体内粘合剂进行粘合或缝合。或者，也可以不进行该粘合或缝合，仅将该片状细胞培养物贴附于患部。

当本申请的细胞培养物是片状细胞培养物时，所述片状细胞培养物的各面均可具有基质。所述基质可选可包含纤连蛋白。在基材上培养细胞的情况下，通常是在细胞与基材面之间产生基质，而在与基材相反的一侧(即不与基材接触的部分)不会产生基质。本申请的片状细胞培养物不仅在与基材接触的一侧产生基质，而且在不与基材接触的一侧也产生基质。本申请的片状细胞培养物在片状细胞培养物的各个面均具有基质，能够更适合软骨修复。

本申请的片状细胞培养物可选为在培养步骤中形成的细胞-多孔膜间的基底膜状蛋白质不受到例如分散酶、胰蛋白酶等蛋白水解酶等酶的破坏。即，本申请的片状细胞培养物为可具有细胞-多孔膜间的基底膜状蛋白质。特别是，本申请的片状细胞培养物可以在片状细胞培养物的一面或片状细胞培养物的两面具有细胞-多孔膜间的基底膜状蛋白质。通过片状细胞培养物含有该基底膜状蛋白质，片状细胞培养物可以发挥更好的软骨修复能力。

本申请的片状细胞培养物的细胞密度可选为100×10

本申请的细胞培养物可选为不含人工支架成分。即，本申请的细胞培养物可以仅由所述培养物中的细胞和由该细胞产生的成分(以及附着在细胞片上的培养基成分)构成。可选地，本申请的细胞培养物可以在没有人工支架成分的情况下移植到患者体内。

本申请的细胞培养物可以通过以下2.中记载的制造方法来制造。因此，关于本申请的细胞培养物的制造方法，请参照以下2.。

2.细胞培养物的制造方法

本申请提供具有软骨样组织形成特性的细胞培养物的制造方法。前述制造方法包括培养细胞以获得细胞培养物的培养步骤。前述制造方法还包括：分析工序，关于所述细胞培养物所包含的细胞群体，分析细胞表面标志物的表达强度；以及判定工序，基于在所述分析工序中获得的表达强度，判定所述细胞培养物是否具有软骨样组织形成特性。以下针对各个工序进行说明。

2-1.培养工序

在所述培养步骤中，关于所述细胞培养物所包含的细胞群，还可以选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106和CD107b所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度低于各自细胞表面标志物的阈值以下，和/或选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a和CD90所组成群组中的至少一种的细胞表面标志物的表达强度为各自细胞表面标志物的阈值以上的方式进行培养。

通过所述培养方法获得的细胞培养物具有优良的软骨样组织形成特性，尤其是透明软骨样组织形成特性。当该细胞培养物移植到例如活人体内，尤其是活人体内的膝软骨部分时，能够形成软骨样组织，尤其是透明软骨样组织。即该细胞培养物可以发挥软骨修复作用，尤其是透明软骨修复作用。然后该细胞培养物发挥与软骨组织相同的功能。

所述培养步骤中培养的细胞可以是所述1.中所述的来源于软骨组织的细胞，也可以是来源于干细胞的细胞。例如，用于培养的原料细胞可以是所述软骨组织来源的细胞，该软骨组织来源的细胞可以是通过在含有FBS的DMEM/F12中将软骨组织中的细胞培养至少2天而获得的细胞。

在本申请的一个可选实施例中，用于获得所述细胞培养物的培养所用的原料细胞可以通过原料细胞制备方法制备，所述原料细胞制备方法包括：第一培养步骤，将软骨组织中的细胞在培养基中培养并融合；解离步骤是将第一培养步骤中汇合的细胞群相互解离；第二培养步骤是对所述解离步骤中解离的细胞群进一步解离，在与前述的培养基相同的新鲜培养基中进行培养。该原料细胞制备方法所制备的原料细胞，适用于制造具有软骨修复适应性的组织培养物。

在所述培养步骤中，细胞可选为可以在具有固定化有刺激响应性聚合物培养面的基材的培养基中进行培养，例如可以在具有固定化有刺激响应性聚合物的多孔膜的面上培养细胞。通过在包含具有固定化有刺激响应性聚合物的基材(尤其是多孔膜)的培养基中培养细胞，可以获得具有软骨样组织形成特性的细胞培养物，且能不损伤该细胞培养物而从基材上剥离细胞培养物。前述刺激响应性聚合物可以是例如：温度响应性聚合物、pH响应性聚合物或光响应性聚合物。更具体而言，可为分别通过温度刺激(例如温度变化)，pH刺激(如pH变化)，或光刺激(如光照射)改变聚合物的性质(如水合力)。该特性的变化例如可以促进所述培养物从所述基材剥离的特性变化。

例如，通过在固定化有刺激响应性聚合物的表面上接种细胞，在聚合物水合力弱的温度区域的培养基中培养细胞来形成细胞培养物。然后，在细胞培养物形成后，通过将培养液温度改变到聚合物水合力强的状态的温度，促进细胞培养物从该面剥离。例如，所述用于培养的温度区域(即水合力弱的温度区域)可以是例如33℃至40℃。所述用于剥离的温度(即水合力强的温度区域)可以比所述温度区域低，例如可以为31℃以下。

在本技术的一个实施例中，刺激响应性聚合物是温度响应性聚合物。在包含具有经固定化有温度响应性聚合物培养面的基材的培养基中培养所述细胞的情况下，例如通过培养后，将培养基的温度设置为该温度响应性聚合物的上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，该面由疏水性转变为亲水性的结果，使得培养物与多孔膜之间的剥离变得容易。另外，本申请的制造方法中的培养，例如可以是二维培养(也称为平面培养)，也可以是三维培养(例如悬浮培养、球团培养等)。

在培养工序中使用多孔膜时，所述细胞可与多孔膜上侧的培养基接触，也可以通过所述多孔膜的孔与多孔膜下侧的培养基接触。通过在这种状态下培养，可以获得更适合软骨修复的细胞。

当在培养步骤之后要使细胞培养物从基材培养面剥离时，不需要用例如分散酶和胰蛋白酶等蛋白水解酶进行处理。利用所述温度响应性聚合物的特性，通过改变培养基的温度，可以将所述细胞培养物自基材剥离。因此，通过本申请的制造方法制造的所述细胞培养物，具有不被酶损伤而能够从基材剥离的优点。

通过蛋白水解酶的处理，会造成细胞-细胞间桥体(desmosome)结构和细胞-基材间的基底膜状蛋白质的分解，结果使细胞培养物中的细胞被单个分离。另一方面，通过本申请的制备方法获得的细胞培养物可以通过改变培养基的温度而不用蛋白酶处理使其自基材剥离。结果所述细胞间桥体结构得以维持，且能减少细胞培养物的缺陷。此外，当通过改变培养基的温度将通过本申请的制备方法获得的细胞培养物从基材剥离时，即使是所述基底膜蛋白也不会被酶破坏。因此，可以在移植时更好地粘附到患处，并且可以进行有效的治疗。

作为蛋白水解酶的分散酶，已知能够将所述细胞间桥体结构维持在10％至60％的状态使细胞片剥离，但由于所述基底膜状蛋白质几乎被破坏，因此所获得的细胞培养物的强度较弱。

通过本申请的制造方法制造的细胞培养物，可以在细胞间桥体结构和基底膜状蛋白质均保持80％以上的状态下从基材剥离。

本申请中使用的温度响应性聚合物的高临界溶解温度(upper criticalsolution temperature；UCST)或低临界溶解温度(lower critical solutiontemperature；LCST)，可选为0℃至80℃，可选为20℃至50℃，进而可选为25℃至45℃。当高临界溶解温度或低临界溶解温度过高时，细胞会死亡。当高临界溶液温度或低临界溶液温度过高时，细胞增殖速度降低或细胞死亡。

在本申请的制造方法中，温度响应性聚合物可以是均聚物，也可以是共聚物。该聚合物可以是例如(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或N,N-二)烷基取代的(甲基)丙烯酰胺衍生物、或乙烯基醚衍生物的均聚物，或可为这些单体的共聚物。

所述(甲基)丙烯酰胺化合物例如可以是例如丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。

所述N-烷基取代的(甲基)丙烯酰胺衍生物例如可以是N-乙基丙烯酰胺(均聚物的低临界溶解温度为72℃)、N-正丙基丙烯酰胺(低临界溶解温度为21℃),N-正丙基甲基丙烯酰胺(低临界溶解温度为27℃),N-异丙基丙烯酰胺(低临界溶解温度为32℃),N-异丙基甲基丙烯酰胺(低临界溶解温度为43℃),N-环丙基丙烯酰胺(低临界溶解温度为45℃),N-环丙基甲基丙烯酰胺(低临界溶解温度为60℃),N-乙氧基乙基丙烯酰胺(低临界溶液温度约35℃)、N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺(低临界溶液温度约45℃)、N-四氢糠基丙烯酰胺(低临界溶液温度约28℃)或N-四氢糠基甲基丙烯酰胺(低临界溶液温度约35℃)。

前述的N,N-二烷基取代的(甲基)丙烯酰胺衍生物例如可以是N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-乙基甲基丙烯酰胺(均聚物的低临界溶解温度为56℃),或N,N-二乙基丙烯酰胺(低临界溶解温度为32℃)。

前述乙烯基醚衍生物例如可以是甲基乙烯基醚(均聚物的低临界溶解温度为35℃)。

在本申请中，作为温度响应性聚合物，也可以使用与所述单体以外的单体的共聚物，也可以使用通过相互接枝聚合或共聚而得到的聚合物，或使用聚合物或共聚物的混合物。另外，可以在不损害聚合物本来的性质的范围内进行交联。

为了选择具有更适于本申请中培养或剥离的临界溶解温度的温度响应性聚合物，或为了调节多孔膜与培养物之间的相互作用，或为了调节多孔膜面的亲水性或疏水性，可适当选择所述聚合物。

在可选的实施方案中，所述温度响应性聚合物为聚(N-异丙基丙烯酰胺)。

在本申请的制造方法中，被固定化在膜表面的温度响应性聚合物的量可选为0.3μg/cm

在本申请的制造方法中，可选所述基材为多孔膜，在所述培养步骤中，所述细胞为与所述多孔膜上侧的培养基接触，并通过所述多孔膜的孔与所述多孔膜下侧的培养基接触。通过在这种状态下进行培养，可以更有效地进行培养。

在本申请的制造方法中，膜的材料，特别是多孔膜的材料可以是，例如聚碳酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate；PET)、聚苯乙烯或聚四氟乙烯。其中，可选为PET。通过使用PET多孔膜，可以更有效地制造本申请的细胞培养物。

将温度响应性聚合物固定在多孔膜表面上的方法，例如可以通过日本专利公开平2-211865号中所记载的方法进行。即，通过将多孔膜和所述温度响应性聚合物通过化学反应结合的方法或通过物理相互作用使之结合的方法来进行固定化。这些方法也可以组合使用。

在所述通过化学反应使之结合的方法中，例如，可以进行电子束照射(EB)、γ射线照射、紫外线照射、可见光照射、LED照射、电浆处理或电晕处理。或者，也可以通过自由基反应、阴离子自由基反应、阳离子自由基反应等通常使用的有机反应将温度响应性聚合物固定化在多孔膜上。此外，也可以将水不溶性聚合物链段和温度响应性聚合物链段结合而成的结构的嵌段共聚物作为温度响应性聚合物部分涂布在基材的表面上。也可以通过物理吸附或疏水性进行固定化。

在所述通过物理相互作用使之结合的方法中，可以将温度响应性聚合物或该聚合物与任意介质的混合物涂布于多孔膜。

本申请的制造方法中用于培养的培养基可以是用于细胞培养、特别是哺乳动物细胞培养的培养基，例如可为DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium:NutrientMixture F-12)等。该培养基可包含添加因子。作为添加因子，例如可以例举：细胞生长因子、激素、结合蛋白、细胞粘附因子、脂质和其他成分等。

前述细胞生长因子的实例包括TGF-β、b-FGF、IGF、EGF(Epidermal GrowthFactor：表皮生长因子)、BMP(Bone morphogenetic protein：骨生长因子)、成纤维细胞生长因子受体3(Fibroblast growth factor receptor 3；FGFR-3)、卷曲相关蛋白(frizzled-related protein；FRZB)、CDMP-1、生长分化因子5(Growth differentiationfactor 5；GDF-5)、粒细胞集落刺激因子(Granulocycyte Colony Stimulating Factor：G-CSF)、白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor：LIF)、白细胞介素,血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor：PDGF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor；NGF)、激活素A等的TGF(Transforming Growth Factor：转化生长因子)家族、Wnt家族，尤其是Wnt-3a(Wingless-type MMTV integration site family,member 3A)等，但不限于这些。在TGF家族中，有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。

前述激素的实例包括胰岛素、转铁蛋白、皮质醇、雌二醇、催乳素、胰高血糖素、甲状腺素、生长激素、促卵泡激素(Follicle Stimulation Hormone：FSH)、黄体化激素(Leutenizing Hormone：LH)、糖皮质激素和前列腺素等，但不限于这些。

前述细胞粘附因子的实例包括胶原蛋白、胶原蛋白肽、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白，但不限于这些。胶原蛋白肽的实例包括结合有胶原蛋白中含有RGD(Arg-Gly-Asp；精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的区域的重组肽等。作为这样的重组肽，例如可以举出cellnest(Fuji Film Co.,Ltd.)。

前述脂质的实例包括磷脂、不饱和脂肪酸等，但不限于这些。

可以添加到培养基中的所述其他成分的实例包括抗坏血酸、血清、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐(insuline-transferrin-selenite；ITS)、转铁蛋白、亚硒酸钠、丙酮酸，脯氨酸、白蛋白、脂蛋白、铜蓝蛋白(ceruloplasmin)等，但不限于这些。血清的实例包括但不限于胎牛血清(FBS)和人血清。在本申请的制造方法中，所述培养基可选为含有FBS的培养基，特别是含有FBS的DMEM/F12。为了更有效地培养，FBS的含量可选为相对于培养基的总体积为1体积％至30体积％，可选为10体积％至30体积％，可选为12体积％至28体积％，更进一步可选为15体积％至25体积％的容量。

此外，在本申请的制造方法中，培养基也可以是无血清培养基。由于ITS等添加因子可以代替血清的功能，因此通过在培养基中含有该添加因子，在无血清培养基中可进行本申请的制造方法中的培养。此外，通过使用无血清培养基，可以避免移植到人体时因使用生物来源原料而产生的风险。

为了更好的细胞增殖，本申请中所使用的培养基可选为可相对于培养基体积以，例如0.01mg/mL至1mg/mL，可选0.05mg/mL至0.5mg/mL，可选0.07mg/mL至0.3mg/mL的比例含有抗坏血酸。通过抗坏血酸，可以促进培养中的细胞产生关节软骨特异性基质，和/或细胞培养物的表型表现可以变得更适合软骨修复。亦即，抗坏血酸可以有助于关节软骨损伤部位通过透明软骨再生的修复。当抗坏血酸浓度过高时，会阻碍培养中的细胞附着于多孔膜。抗坏血酸浓度过低时，有时无法发挥该效果。

在一个可选的实施方案中，本申请的细胞培养物可以通过在培养基中培养细胞获得，可选为在含有FBS和/或抗坏血酸的培养基中，或例如在含有FBS和/或抗坏血酸的DMEM/F12中培养细胞而获得。

在本申请的制造方法中，细胞在膜上的培养期间可根据培养物的状态，例如根据表型表现(phenotypic expression)状态等来适当选择，例如可为10天到20天，可选为11天到18天，可选为12天到16天。通过这个培养期间，细胞培养物可以变得更适合软骨修复。

在所述培养中，所述细胞群可以在与多孔膜上侧的培养基接触，也可以通过多孔膜的孔与多孔膜下侧的培养基接触的状态下进行培养。通过在该状态下进行培养，不仅可以在细胞片朝向的多孔膜的粘附面上，也可以在与粘附面相反的面，与所述上侧的培养基接触的面上产生粘附蛋白。本申请的细胞片通过在细胞片的两面具有基质，能够更适合于软骨修复。

为了在所述状态下进行培养，例如，可以使用细胞小室(cell insert)(也称为细胞培养小室)或具有相同结构的培养容器。例如，在本申请的制造方法中，可以使用具有在多孔膜上固定有刺激响应性聚合物(例如温度响应性聚合物)的细胞小室的培养容器。所述细胞群可以在固定化有刺激响应性聚合物(例如温度响应性聚合物)的多孔膜的表面上培养。

刺激响应性聚合物的固定可以通过本申请所属领域具备常规知识者通过已知的方法进行，例如通过日本专利公开平2-211865中记载的方法。此外，固定化有刺激响应聚合物的细胞小室可使用市售的细胞小室，例如可使用Thermo Scientific(商标)Nunc(商标)CC培养小室#140660；BD Falcon细胞培养小室#353090、#353490、#353102、#353091、#353092、#353093。

在本申请的制造方法中，培养容器可由此发明所属领域中具备常规知识者适当选择，例如可以例举：培养皿、多孔板、培养瓶、以及形状与这些培养容器类似的容器，但不限于这些。

本申请的制造方法中得到的细胞培养物的特征如所述1.所述。此外，在所述培养步骤中培养的细胞和制备方法如所述1.中所述。

2-2.分析工序

本申请的制造方法可选包括分析工序，即分析前述细胞培养物中所含的细胞群的细胞表面标志物的表达强度。可选地，在所述分析中，测定选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106和CD107b所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度，和/或选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a和CD90所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度。该测定可选通过流式细胞术进行。该流式细胞术的测定可以如后述“5.实施例”中记载的那样进行。

在本申请的一个实施例中，在所述分析步骤中，至少测量CD99和/或GD2的表达强度，和/或至少测量CD26和/或CD73的表达强度。这四种细胞表面标志物特别适用于评估软骨样组织形成特性，尤其是透明软骨样组织形成特性。

在本申请的另一个实施例中，在所述分析步骤中，测量至少CD99和/或GD2的表达强度，和/或CD26、CD73和CD44中至少一种、两种或三种的表达强度。这五种细胞表面标志物特别适用于评估软骨样组织形成特性，尤其是透明软骨样组织形成特性。

在本申请的另一个实施方式中，在所述分析步骤中，至少测量CD99和/或GD2的表达强度，和/或至少测量CD44的表达强度。这三种细胞表面标志物特别适用于评估软骨样组织形成特性，尤其是透明软骨样组织形成特性。

2-3.判定工序

本申请的制造方法可选包括判定工序，即基于在前述分析工序中所获得的细胞表面标志物的表达强度，来判断前述细胞培养物是否具有软骨样组织形成性(特别是是否具有透明软骨样组织形成特性)。

在所述判断步骤中，还可以基于所述分析工序中获得的细胞表面标志物的表达强度，判断所述细胞培养物是否适用于软骨组织的修复，尤其是是否适用于透明软骨组织的修复，更尤其是是否适用于膝关节透明软骨组织的修复。

在所述判定步骤中，可选针对所述细胞培养物中的细胞群，判定选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106和CD107b所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度低于各表面标志物的阈值，和/或判定选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146，CD140a和CD90所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物的表达强度高于各表面标志物的阈值。

特别可选的是，在所述判定工序中，通过流式细胞仪分析该细胞培养物中所含的细胞群时测定的标准化平均荧光强度满足所述1.中所述的条件1至10中至少一项，和/或满足所述1.中所述的条件11至20中的至少一项的情况，可以判定所述细胞培养物具有类软骨样组织形成特性，例如，还可以判定具有透明软骨样组织形成特性。

此外，在所述判定步骤中，通过流式细胞仪分析该细胞培养物中所含的细胞群时测定的标准化平均荧光强度满足所述1.中所述的条件1至10中的至少一项，和/或满足所述1.中所述的条件11至20中的至少一项，还可以判定所述细胞培养物适用于软骨组织的修复，尤其是透明软骨组织的修复，更尤其是膝透明软骨组织的修复。

在所述判定步骤中，判定为适合软骨修复的细胞培养物可用于移植到人体内。即，在所述判定工序中，通过流式细胞仪对细胞培养物中所含的细胞群进行分析时所测定的标准化平均荧光强度满足所述1.中所述的条件1至10中至少一项，和/或满足所述1.中所述的条件11至20中至少一项也可以判定为适合移植到人体膝关节。

3.评价方法

本申请还提供细胞培养物的评价方法。所述评价方法可以包括判定工序，基于细胞培养物所包含的细胞群体的细胞表面标志物的表达强度，来判定是否具有软骨样组织形成特性(特别是是否具有透明软骨样组织形成特性)。

此外，在所述判断步骤中，还可以基于所述2.所说明的分析工序中得到的细胞表面标志物的表达强度，判断所述细胞培养物是否适合软骨组织的修复，尤其是是否适合透明软骨组织的修复，更尤其是是否适合膝透明软骨组织的修复。

所述判定步骤可以与所述2.中所说明的判定步骤相同。例如，所述判定也可以基于例如在所述2.中所列的特定细胞表面标志物的表达强度，特别是标准化平均强度是否满足针对每个细胞表面标志物设定的条件来进行。

此外，评价方法还可以包括通过流式细胞仪分析细胞群的分析步骤。所述判定处理中的判定可以基于所述分析处理工序中的分析结果来进行。所述分析步骤可以与所述2.中描述的分析步骤相同。

所述特定细胞表面标志物的表达强度作为判断细胞培养物是否具有软骨样组织形成特性(特别是是否具有透明软骨样组织形成特性)的指标是有效的。因此，本申请的评价方法可以适当评价软骨的修复适宜性，尤其是透明软骨的修复适宜性。

此外，在本申请的评价方法中，可以根据细胞表面标志物的表达强度来判断是否适合软骨修复，因此可以在不将细胞培养物诱导培养成软骨样组织的情况下判断是否适合软骨修复。因此，可以减少软骨修复适用性判定所需的时间。此外，由于本申请的评价方法可以在短时间内进行，因此可以将其作为制造软骨修复用细胞培养物的工序之一，从而可以更确切地制造适合软骨修复的细胞培养物。此外，本申请的评价方法与实际通过将细胞培养物诱导培养成软骨样组织来评价软骨修复适宜性相比，也可以更低成本地评价软骨修复适宜性。

4.用于评估软骨样组织形成特性的标志物

本申请提供用于评价软骨样组织形成特性的标志物。前述标志物包括：选自由CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106和CD107b所组成的群组中至少一种细胞表面标志物，和/或选自由CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a和CD90所组成的群组中至少一种的细胞表面标志物。

这些细胞表面标志物适用于评估细胞培养物的软骨样组织形成特性。

在本申请的一个实施例中，本申请的评价软骨样组织形成特性的标志物包括CD99和/或GD2，和/或包括CD26和/或CD73。这些细胞表面标志物特别适用于评估细胞培养物的软骨样组织形成特性。

在本申请的另一个实施例中，本申请的评价软骨样组织形成特性的标志物包含CD99和/或GD2，和/或包含CD26、CD73和CD44中的一种、两种或三种。这些细胞表面标志物特别适用于评估细胞培养物的软骨样组织形成特性。

在本申请的其他实施例中，本申请的用于评价软骨样组织形成特性的标志物包含CD99和/或GD2，和/或包含CD44。这些细胞表面标志物特别适用于评估细胞培养物的软骨样组织形成特性。

对于这些细胞表面标志物，例如，可以通过所述2.和3.中描述的分析步骤和判定步骤来评价细胞培养物的软骨样组织形成特性。

此外，本申请还提供一种用于评价软骨修复适合性的标志物。前述标志物包括所述用于评价软骨样组织形成特性的细胞表面标志物。

以下，将基于实施例更详细地说明本申请，但本申请不限于这些实施例。

5.实施例1

包含以特定表达强度表达特定细胞表面标志物的细胞群的细胞培养物，如下所述被证实具有软骨样组织形成特性。

即，在图1的步骤1中，制备多个片状细胞培养物。接着，在步骤2中，对多个片状细胞培养物进行细胞表面标志物的表达分析。对于此表达分析，对片状细胞培养物进行细胞分离、抗体染色并附加了FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting；流式细胞术)分析。此外，在步骤3中，评估了软骨样组织形成特性。对于该评估，进行了片状细胞培养物的三维培养，然后分析了COL2A1和COL1A1的表达量比。其次，在步骤4中，使用步骤2和步骤3的结果进行相关性分析。通过该相关性分析，确认了细胞培养物具有软骨样组织形成特性，并且细胞培养物包含以特定表达强度表达特定细胞表面标志物的细胞群。

下面将描述所述步骤1至4的细节。

5-1.第1步：细胞培养物的制备

准备了总共16种软骨组织片(源自多指症手术步骤中废弃组织的软骨)。这些软骨组织片分别用酶(Collagenase Type-1/Worthington CLS-1或Liberase MNP-S/Roche)处理，并从每个软骨组织片中分离出软骨细胞。将分离的软骨细胞接种到细胞培养小室(UpCell(注册商标)培养小室，CellSeed Inc.)。以接种日为第0天，每3至4天更换培养基。在接种后10至21天获得来自每个软骨组织片中的软骨细胞的片状细胞培养物。

5-2.步骤2：细胞表面标志物的表达分析

将步骤1得到的16种片状细胞培养物用PBS洗涤后，与Accutase(BectonDickinson)室温反应15分钟。在该反应之后，回收每个片状细胞培养物并去除Accutase。该去除后，与0.25mg/ml的胶原酶P(Roche)在37℃下反应30分钟以分散每个片状细胞培养物中的细胞。用PBS洗涤分散的细胞并悬浮在0.2％FBS/5mM EDTA/PBS中以获得悬浮液。将242种细胞表面标志物的每种抗体添加到含有从每种片状细胞培养物中获得的细胞群的悬浮液中，并使其在冰上反应30分钟。即，对于每个片状细胞培养物，获得242种含有抗体的细胞悬浮液。下表1所示的，是这242种中，在后述步骤4中确认到相关性的细胞表面标志物的抗体。

在下表1中，“荧光染料”是标识每种抗体的荧光染料。“标的表面抗原”是作为每种抗体标的的细胞表面抗原。“抗体制造商”和“抗体制造序列号”是每个抗体的制造商和制造序列号(目录号)。关于抗体制造商，BD是Becton Dickinson，SC是SANTA CRUZBIOTECHNOLOGY，BL是BioLegend。

[表1]

表1.抗体列表

在冰上进行所述反应后，用0.2％FBS/5mM EDTA/PBS洗涤每个细胞群，并通过流式细胞仪(BD FACSVerse，Becton Dickinson)测量荧光强度。使用分析软件Flowjo(BectonDickinson Company)进行分析，通过FSC(forward scatter：前向散射)和SCC(sidescatter：侧向散射)来设门(gate)，单细胞(single cell)和活细胞群体，求出该细胞群体内每种荧光标记抗体的荧光强度中值，并通过未染色样品的荧光强度的中值进行标准化(normalize)。

5-3.步骤3(软骨样组织形成特性的评估)

制备具有下表2所示组成的基础培养基。

[表2]

表2.基础培养基成分

所述基础培养基以下表3所示浓度补充丙酮酸钠、地塞米松、L-脯氨酸、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐和TGF-β1，以获得诱导培养基。

[表3]

表3.诱导培养基成分

将每个片状细胞培养物弄圆成球形，置于含有配置好的诱导培养基的低粘附性6孔板(6well plate)中，在5％CO

5-4.第4步(相关性分析)

供体ID11的片状细胞培养物的所述基因表达比显示出软骨样组织形成特性(特别是透明软骨样组织形成特性)，与全人工关节置换术的废弃组织来源的软骨制作的片状细胞培养物(以下简称“TKA来源的片状细胞培养物”)(Sato M et al.，Combined surgeryand chondrocyte cell-sheet transplantation improves clinical and structuraloutcomes in knee osteoarthtitis，NPJ Regen Med,4,4,2019.)相同，也可以用作具有软骨样组织形成特性的细胞培养物的基准。因此，可以判断COL2A1/COL1A1基因表达比高于供体ID11的COL2A1/COL1A1基因表达比的片状细胞培养物具有软骨样组织形成特性。

对于242种细胞表面标志物，当通过Pearson积矩相关分析研究其与COL2A1/COL1A1基因表达比的相关性时，表1所示的20种细胞表面标志物与COL2A1/COL1A1基因表达比呈正相关或负相关。

具体而言，已知CD166、CD165、CD99、GD2、STRO-1、CD108、CD164、CD6、CD106和CD107b与COL2A1/COL1A1基因表达比呈负相关。因此，发现含有这些表面标志物的表达强度低于阈值的细胞群的细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的细胞培养物来利用，适合于软骨修复。

此外，已知CD26、CD73、CD105、CD44、CD120a、CD201、EGFR、CD146、CD140a和CD90与COL2A1/COL1A1基因表达比呈正相关。因此，发现含有这些表面标志物的表达强度高于阈值的细胞群的细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的细胞培养物来利用，适用于软骨修复。

此外，在与COL2A1/COL1A1基因表达比呈负相关的10个细胞表面标志物中，已知CD99和GD2具有更强的负相关性(CD99:r＝-0.430；GD2:r＝-0.397)，并且与阴性对照组有明确的差异。因此，发现至少含有CD99和/或GD2的表达强度低于这些细胞表面标志物的阈值的细胞群的细胞培养物可以作为具有优良的软骨样组织形成特性的细胞培养物来利用，特别适用于软骨修复(尤其是透明软骨修复)。

此外，在与COL2A1/COL1A1基因表达比呈正相关的10种细胞表面标志物中，已知CD26和CD73具有更强的正相关性(CD26：r＝0.485；CD73：r＝0.456)，并且与阴性对照组有明显差异。因此，发现至少含有CD26和/或CD73的表达强度为这些细胞表面标志物的阈值以上的细胞群的细胞培养物可以作为具有优良软骨样组织形成特性的细胞培养物来利用，特别适用于软骨修复(尤其是透明软骨修复)。

另外，关于所述20种与COL2A1/COL1A1基因表达比呈正相关或负相关的细胞表面标志物，具有与TKA来源的片状细胞培养物的COL2A1/COL1A1基因表达比以上的COL2A1/COL1A1基因表达比的片状细胞培养物中，COL2A1/COL1A1基因表达比最低的片状细胞培养物的nMFI如下表4所示。

[表4]

表4.最低nMFI

例如，关于正相关的细胞表面标志物CD26，在COL2A1/COL1A1基因表达比高于源自TKA的片状细胞培养物的COL2A1/COL1A1基因表达比的片状细胞培养物中，COL2A1/COL1A1基因表达比为最低的片状细胞培养物的nMFI如上表4所示为2.9。

因此，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有FITC的抗CD26抗体标记时，来自FITC的标准化平均荧光强度例如为2.3以上，可选2.6以上，可选在2.9以上的情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有PE的抗CD166抗体标记时，源自PE的标准化平均荧光强度为，例如240或更小，可选220或更小，可选在200以下的情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有BB700的抗CD165抗体标记时，源自BB700的标准化平均荧光强度为132或更小，可选120或更小，可选110或更小的情况下，则认为该片状细胞培养物可以用为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适用于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有FITC的抗CD99抗体标记时，源自FITC的平均化平均荧光强度为1.9或更小，可选1.8或更小，可选为1.6以下的情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适合于软骨修复。

同样地，在片状细胞培养物中的细胞群被与结合有BB700的抗GD2抗体标记时，来自BB700的平均化平均荧光强度为3.6以下，可选为3.3以下，可选为3.0以下的情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有FITC的抗STRO-1抗体标记时，来自FITC的标准化平均荧光强度为1.4或更小，可选1.3或更小，可选1.2以下的情况，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适合于软骨修复。

同样地，在片状细胞培养物中的细胞群被与结合有PE的抗CD108抗体标记的情况下，来自PE的标准化平均荧光强度为1.9以下，可选为1.8以下，可选为1.6以下的情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有PE的抗CD164抗体标记时，源自PE的标准化平均荧光强度为3.0或更小，可选2.8或更小，可选2.5或更小的情况下，则认为该片状细胞培养物可作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适用于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有FITC的抗CD6抗体标记时，来自FITC的标准化平均荧光强度为1.4或更小，可选1.3或更小，可选1.2以下的情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有FITC的抗CD106抗体标记时，源自FITC的标准化平均荧光强度为2.4或更小，可选2.2或更小，可选2.0或更小的情况下，则认为该片状细胞培养物可作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适用于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有FITC的抗CD107b抗体标记时，来自FITC的标准化平均荧光强度为2.0或更小，可选1.9或更小，可选1.7以下的情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有FITC的抗CD73抗体标记时，来自FITC的标准化平均荧光强度为47以上，可选53以上，可选59以上的情况下，则认为该片状细胞培养物可作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有PE的抗CD105抗体标记时，源自PE的平均化平均荧光强度为21或更大，可选24或更大，可选27或更大的情况下，则认为该片状细胞培养物可作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有FITC的抗CD44抗体标记时，源自FITC的标准化平均荧光强度为128或更高，可选145或更高，可选160或更高的情况下，则认为该片状细胞培养物可作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有APC的抗CD120a抗体标记时，源自APC的标准化平均荧光强度为24或更大，可选27或更大，可选30或更大地情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有PE的抗CD201抗体标记时，源自PE的标准化平均荧光强度高于18，可选高于20，可选高于23地情况下，则它认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适合于软骨修复。

同样地，在片状细胞培养物中的细胞群被与结合有PE的抗EGFR抗体标记的情况下，来自PE的标准化平均荧光强度为3.2以上，可选为3.6以上，可选为4.0以上地情况下，则认为该片状细胞培养物可作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适用于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有FITC的抗CD146抗体标记时，来自FITC的标准化平均荧光强度为1.6以上，可选1.8以上，可选为2.0以上的情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有PE的抗CD140a抗体标记时，源自PE的标准化平均荧光强度为5.6或更高，可选6.4或更高，可选为7.0以上地情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物利用，适合于软骨修复。

同样地，当片状细胞培养物中的细胞群被与结合有APC的抗CD90抗体标记时，源自APC的标准化平均荧光强度为800或更高，可选900或更高，可选在1000以上的情况下，则认为该片状细胞培养物可以作为具有软骨样组织形成特性的片状细胞培养物使用，适合于软骨修复。

6.实施例2

在所述“5.实施例1”中提及的细胞表面标志物中的CD44，被证实可用下述步骤用于评估软骨样组织形成特性。

即，在步骤2-1中，制备了多个片状细胞培养物。接着，在步骤2-2中，对多个片状细胞培养物进行CD44的表达分析。此外，在步骤2-3中，对多个片状细胞培养物进行三维培养，并通过染色确认软骨样组织形成特性。

这些步骤的细节和获得的结果如下所述。

6-1.细胞培养物的制备(步骤2-1)

通过所述“5.实施例1”的步骤1中所述的程序，分别从三种软骨组织片中获得来自各软骨组织片的软骨细胞，并制备片状细胞培养物。获得的三个片状细胞培养物在下文中也分别称为“样品1”、“样品2”和“样品3”。

6-2CD44的表达分析(步骤2-2)

对于步骤2-1中获得的三种片状细胞培养物，通过以下细胞分散处理和FCM(flowcytometry；流式细胞术)测量来分析CD44的表达程度。

(1)细胞分散处理

[试剂]

20％FBS DMEM-F12/AB/AA(以下也称为“AA(+)培养基”)

DPBS(-)(gibco:14190-250)

LiberaseTM TL Researh Grade(sigma:54010200001)(以下也称为“LiberaseTL”)

注射用水(Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation：161-08247)

5.0g/l-Trypsin/5.3mmol/l-EDTA溶液(Nacalai Tesque：35556-44)(以下也称“Trypsin/EDTA”)

0.4％台盼蓝染色剂(Invitrogen，T10282)

STEM-CELLBANKER(ZENOAQ RESOURCE,CB045)(以下也称“cell banker”)

[程序]

[制备0.65Units/mL Liberase TL]

1.将2mL注射用水加入到Liberase TL并混合(下文中也将获得的混合物称为“13Units/mL Liberase TL”)。

2.将5.7mL的AA(+)添加到50mL试管中。

3.添加300μL 13Units/mL Liberase TL并混合(下文中获得的混合物也称为“0.65Units/mL Liberase TL”)。

[细胞分散]

1.准备适当数量的已培养14天的细胞片。

2.以3ml/well将DPBS(+)分注于6孔板。

3.将温度响应性培养小室(CellSeed:CS6301)移到2.。

4.将10mL Trypsin/EDTA放入50mL试管中并加热至37℃。

5.去除培养小室中的培养基，用DPBS(-)2mL/well进行wash(洗涤)。

6.将细胞片剥离并将它们放入4个试管中(最多4sheet/tube)。

7.放入37℃水浴中孵育30min(适当摇晃试管)。

8.添加10mL的AA(+)培养基以停止酶处理。

9.350×g，25℃离心5分钟。

10.去除上清液。

11.添加0.65Units/mL Liberase TL 3mL。

12.放入37℃水浴中，孵育30min(适当摇晃试管)。

进行13.至16.至细胞团块消失的时间点，进入17.

13.如果仍有细胞团块，添加1mL的0.65Units/mL Liberase TL。

14.放入37℃水浴中，孵育15分钟(适当摇晃试管)。

15.如果仍有细胞团块，添加1mL的0.65Units/mL Liberase TL。

16.放入37℃水浴中，孵育15分钟至(适当摇晃试管，细胞团块消失为止)。

17.如果细胞团块消失，则添加剩余的0.65Units/mL Liberase TL。

18.通过40μm细胞过滤器并回收到新的50mL试管中。

19.用5mL AA(+)培养基预洗50mL试管，通过18.的40μm细胞过滤器，回收到50mL试管中。

20.350×g，25℃离心5分钟。

21.去除上清液。

22.悬浮在AA(+)培养基中。

23.对细胞进行计数。

24.350×g，25℃离心5分钟。

25.去除上清液。

→进行以下FCM测试。

→如果不立即执行FCM测试，按以下方式保存。

26.悬浮于cell banker。

27.分装到冷冻管(Cryotube)中。

28.-80℃冷冻保存。

29.次日后，移至-150℃保存。

(2)流式细胞仪检测

[试剂]

DPBS(-)(gibco:14190-250)

0.4％台盼蓝染色剂(Invitrogen，T10282)

[抗体]

NEG.CTRL IgG1(mouse)-FITC 100t CE(Beckman&Coulter:A07795)(以下也称为“IgG1-FITC”)

MOUSE IgG1-APC,100t CE(Beckman&Coulter:IM2475)(以下也称为“IgG1-APC”)

Hu CD44 FITC G44-26 100Tst(BD Pharmingen:559596)(以下也简称“CD44-FITC”)

[程序]

1.以含有活细胞1×10

2.添加1mL的PBS(-)并悬浮。

3.350×g，4℃离心3分钟。

4.去除上清液。

5.添加1mL的PBS(-)并悬浮。

6.350×g，4℃离心3分钟。

7.去除上清液。

8.添加50μL的PBS(-)并重新悬浮。

9.以5μL/tube添加抗体并重新悬浮。

Tube1：IgG1-FITC、IgG1-APC

Tube 2：CD44-FITC

10.避光并在4℃下孵育30至60分钟。

11.添加1mL的PBS(-)并悬浮。

12.350×g，4℃离心3分钟。

13.去除上清液。

14.添加0.3mL的PBS(-)并悬浮。

15.添加到附有细胞过滤器的5mL试管中。

16.使用BD FACSVerse进行测量和分析。

使用BD FACSuite Software Application(Becton Dickinson)进行测量和分析。具体而言，设定10,000个计数，以对照组(IgG1-FITC)为1％时获得CD44的％。这里，“CD44的％”是指以对照组为1％时，抗CD44抗体染色的细胞数的比例。另外，直方图的范围设定为使对照组(IgG1-FITC)在嵌套状态下为1％的方式设定，此时的计数(events)的数值在95至104的范围内。

6-3.3D培养和染色(步骤2-3)

对步骤2-1中获得的三种片状细胞培养物分别进行以下三维培养处理和染色处理。

(1)3D培养处理

如上文“5.实施例1”的步骤3中所述，将每个片状细胞培养物弄圆成球体并放置在含有诱导培养基的低粘附性6孔板中，于5％CO

(2)染色处理

对球状组织进行以下番红O染色。

[试剂]

Mayer’s苏木精溶液(Fuji Film Wako Pure ChemicalCorporation,131-09665)

0.08％Fast Green固绿(制备试剂)

1％乙酸水溶液(制备试剂)

0.1％番红O(武藤化学，42262)

100％乙醇(Fuji Film Wako Pure ChemicalCorporation，054-00461)

二甲苯(Fuji Film Wako Pure ChemicalCorporation,241-00096)

屈大麻酚(marinol)750cps(武藤化学，20091)

[1％乙酸制备程序]

1.在染色缸中以1:99的比例混合乙酸和纯净水。

[染色程序]

1.用水洗涤载玻片10分钟。

2.一边用显微镜确认染色状态，一边进行苏木精染色(约10秒)。

3.用水洗涤载玻片5分钟。

4.浸入0.08％固绿中5分钟。

5.浸入1％乙酸水中10秒。

6.浸入0.1％番红O中5分钟。

7.准备3个装有100％乙醇的缸，进行3次一边1缸摇晃约10秒一边浸泡的操作。

8.准备3个装有二甲苯的缸，进行3次一边1缸摇晃约10秒一边浸泡的操作。

9.将约2滴大麻酚(marinol)置于盖玻片上并与二甲苯混合。

10.慢慢盖上载玻片。

11.用显微镜观察和拍照。

6-4.结果和考察

所述步骤2-2得到的表达分析的结果如下表5所示。在下表5中单位为％。样品2和样品3的片状细胞培养物的CD44的表达强于样品1。

[表5]

表5.CD44表达分析结果

此外，所述步骤2-3中获得的染色结果如图3所示。

如图3所示，样品2和样品3的球形结构比样品1的球形结构更强烈地被番红O染色。球状组织中番红O的染色程度较强，说明软骨样组织形成特性优良。因此，从图3所示的结果可以看出，2号样品和3号样品的片状细胞培养物的软骨样组织形成特性比1号样品的更优异。

从表5所示的结果和图3所示的结果可以看出片状细胞培养物的CD44表达越强，软骨样组织形成特性越好。此外，确认了CD44作为评价片状细胞培养物的软骨样组织形成特性的指标是有用的。

特别是从所述“6-2.CD44表达分析(步骤2-2)”中说明的测定及分析方法的观点出发，认为将对照组(IgG1-FITC)为1％时的CD44表达比％)可选为90％以上，更可选为92％以上的情况，则该片状细胞培养物可以用作具有特别优异的软骨样组织形成特性的片状细胞培养物，适合于软骨修复。

6-5.基于COL2和COL1的表达量比的评估

当片状细胞培养物的CD44的表达水平高时，片状细胞培养物的软骨样组织形成特性优异，如下所述，这也可以从COL2和COL1的基因表达比和染色来确认。

首先，按照所述“5.实施例1”的步骤1中记载的方法，从一种软骨组织片，得到来自该软骨组织片中的软骨细胞的片状细胞培养物。

获得的片状细胞培养物显示出极低的COL2表达和高度的COL1表达。即，片状细胞培养物为2型胶原蛋白阴性而对1型胶原蛋白呈阳性。如国际专利公开第2018/154813号所述，这种片状细胞培养物具有优异的软骨样组织形成特性。

对该片状细胞培养物，如所述步骤2-2中所述进行CD44的表达分析。结果显示，该片状细胞培养物中CD44的表达为94.95，与2号和3号样品的表达水平相同。

由以上结果可以确认，片状细胞培养物的CD44的表达程度高时，该片状细胞培养物的软骨状组织形成特性优异。